Name: the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach at JoVE.com

この記事で紹介した研究は、国立衛生研究所/国立アルコール乱用研究所(NIH / NIAAA)R00AA023560からCBLへの助成金によってサポートされました。

この手順で使用されたすべてのゼブラフィッシュ胚は、確立されたIACUCプロトコル12に従って飼育および飼育されました。これらのプロトコルはルイビル大学によって承認されました。
注:野生型ゼブラフィッシュ株AB、および bmp4st72;smad5b1100 二重変異株をこの研究で使用しました。この手順で使用した水はすべて滅菌逆浸透水であ...

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UMass Chan Medical School Available from: <a target="_blank" href="https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols">https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols</a> (2017)</li><li>Mosimann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+gateway+calculations:+Excel+spreadsheet.">Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet.</a> protocols.io. , (2022).</li><li>Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-endodermal+interactions+are+required+for+pancreatic+&#946;+cell+induction.">Intra-endodermal interactions are required for pancreatic &#946; cell induction.</a> Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).</li><li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharyngeal+pouches+and+clefts:+Development,+evolution,+structure+and+derivatives.">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).</li><li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish.">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li><li>Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. 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V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression.">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li><li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication,+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos.">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+transgenesis,+gene+trapping,+enhancer+trapping,+and+Gal4-UAS+system.">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li></ol>

ゼブラフィッシュは、エタノール曝露が発育および病態に与える影響を研究するのに理想的です7,8。ゼブラフィッシュは、半透明の、体外受精の、遺伝的に扱いやすい胚を大量に産生し、複数の環境状況で同時にいくつかの導入遺伝子標識組織および細胞タイプのライブイメージングを可能にします19,20?...

出生前のエタノール曝露は、胎児アルコールスペクトラム障害(FASD)1,2,3,4と呼ばれる構造的欠損と認知障害の連続を引き起こします。複数の要因間の複雑な関係により、ヒトにおけるFASDの病因の研究と理解は困難になっています。この課題を解決するために、多種多様な動物モデルが使用されてきました。これらのモデルで利用可能な生物学的および実験的ツールは、エタノール催奇形性の機構的基礎の理解を深める上で重要であることが証明されており、これらのモデルシステムからの結果は、ヒトエタノール研究で見られるものと著しく一致しています5,6。これらの中で、ゼブラフィッシュはエタノール催奇形性を研究するための強力なモデルとして浮上しています7,8、部分的には、それらの外部受精、高い繁殖力、遺伝的扱いやすさ、および半透明の胚のために。これらの強みが組み合わさって、ゼブラフィッシュはトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を用いたFASDのリアルタイムライブイメージング研究に最適です。
トランスジェニックゼブラフィッシュは、胚発生の複数の側面を研究するために広く使用されています9。しかし、トランスジェニックコンストラクトとそれに続くトランスジェニック株を作成することは非常に困難な場合があります。標準的な導入遺伝子は、導入遺伝子を駆動するための活性プロモーター要素と、一般的なベクター維持のために安定した細菌ベクター中のポリAシグナルまたは「テール」を必要とします。多成分トランスジェニック構築物の従来の生成は、複数の時間のかかるサブクローニングステップ10を必要とする。ギブソンアセンブリなどのPCRベースのアプローチは、サブクローニングに関連する問題のいくつかを回避できます。しかしながら、固有のプライマーは、すべての固有のトランスジェニック構築物の生成のために設計および試験されなければならない10。導入遺伝子の構築を超えて、ゲノム統合、生殖細胞系列伝達、および適切な導入遺伝子統合のスクリーニングも困難でした。ここでは、トランスポゾンベースのTol2トランスジェネシスシステム(Tol2Kit)を使用するためのプロトコルについて説明します10,11。このモジュラーシステムは、マルチサイトゲートウェイクローニングを使用して、「エントリ」および「宛先」ベクターの増え続けるライブラリから複数のトランスジェニックコンストラクトを迅速に生成します。統合されたTol2転移因子は、導入速度を大幅に増加させ、複数の導入遺伝子の迅速な構築とゲノム統合を可能にします。このシステムを使用して、内胚葉トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の生成を使用して、FASDの根底にある組織特異的な構造欠陥を研究する方法を示します。最終的に、このプロトコルでは、モジュラーセットアップとトランスジェニックコンストラクトの構築がゼブラフィッシュベースのFASD研究に大いに役立つことを示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Addgene Tol2 toolbox</td>
			<td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided directly by the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>BioVision</td>
			<td>2486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP118-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Dissecting Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Fluoview FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lawsone Lab Donor Plasmid Prep</td>
			<td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR Clonase II Plus Enzyme</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12538200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Pipette holder</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MIMPH-M-PIP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 0.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10025-716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MM33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AM1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet</td>
			<td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Spectrophotometer</td>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NcoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NotI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0189S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red sodium salt</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4758-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Injector</td>
			<td>Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup .22 &#181;m vacuum filtration system&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU11RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tol2 Wiki Page</td>
			<td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Top10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C404010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipetter Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish microinjection mold</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>i34</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the zebrafish tol2 system: a modular and flexible gateway-based transgenesis approach

胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)は、出生前のエタノール曝露によって生じる構造的欠陥および認知障害の非常に多様なセットによって特徴付けられる。FASDの複雑な病理のために、動物モデルはエタノール誘発性発達障害の現在の理解にとって重要であることが証明されています。ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュとヒトの間の遺伝学と発生の両方の高度な保存のために、エタノール誘発性発達障害を調べるための強力なモデルであることが証明されています。モデルシステムとして、ゼブラフィッシュは、遺伝的に扱いやすく半透明の多数の外部受精胚を含む、発生研究に理想的な多くの属性を持っています。これにより、研究者は複数の遺伝的状況でエタノール曝露のタイミングと投与量を正確に制御することができます。ゼブラフィッシュで利用可能な重要な遺伝的ツールの1つは、遺伝子導入です。しかし、トランスジェニック構築物の生成とトランスジェニック株の確立は複雑で困難な場合があります。この問題に対処するために、ゼブラフィッシュの研究者はトランスポゾンベースのTol2トランスジェネシスシステムを確立しました。このモジュラーシステムは、マルチサイトGatewayクローニングアプローチを使用して、完全なTol2トランスポゾンベースのトランスジェニックコンストラクトを迅速に組み立てます。ここでは、柔軟なTol2システムツールボックスと、ゼブラフィッシュのトランスジェネシスの準備ができているトランスジェニックコンストラクトを生成するためのプロトコルと、エタノール研究におけるそれらの使用について説明します。

トランスジェニック構築物を生成するために、我々はTol2トランスジェネシスシステムを使用した。遺伝子プロモーター/エンハンサーエレメントを保持するp5E、プロモーター/エンハンサーエレメントによって発現される遺伝子を保持するpME、および少なくともpolyAテールを保持するp3Eを含む3つのエントリーベクターを使用して、マルチサイトゲートウェイLRクローニング を介して トラ...

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The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

この研究では、トランスジェニックコンストラクトを作成してゼブラフィッシュ胚に注入するためのゲートウェイベースのクローニング方法であるモジュラーTol2トランスジェネシスシステムのプロトコルについて説明します。

ゼブラフィッシュTol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

トランスジェニックゼブラフィッシュは、胚発生の理解に不可欠であることが証明されています。Tol2システムは、研究者がFASD研究のために複数のトランスジェニックゼブラフィッシュを迅速かつ体系的に生成することを可能にする汎用性の高いツールです。モジュラー設計と新しいキットコンポーネントの生成の容易さにより、Tol2システムは、キットのコンポーネントを再設計することなく、新しいトランスジェニックを生成するための汎用性の高いツールになります。この技術を初めて行う研究者への私のアドバイスは、トランスジェニックコンストラクトの生成と注入の精度を訓練するために数回の試運転を行うことです。まず、トランスポザーゼを含むTol2キットプラスミドを、10マイクロリットルのトランスポザーゼプラスミド、1.5マイクロリットルの制限エンドヌクレアーゼ反応バッファー、および0.3マイクロリットルの1つのエンドヌクレアーゼを500マイクロリットルのマイクロ遠心チューブに組み合わせて、1つの制限エンドヌクレアーゼで直線化します。反応液を20マイクロリットルまでRNAseフリーの水で満たします。摂氏37度で一晩混合して消化します。翌日、反応混合物に1マイクロリットルの0.5モルEDTA、2マイクロリットルの5モル酢酸アンモニウム、および80マイクロリットルの100%エタノールを加えて消化を停止します。マイナス20°Cで一晩混ぜて冷やします。翌日、上清を遠心分離して吸引してから、DNAペレットをRNAseフリーの水に再懸濁します。次に、2マイクロリットルのサンプルを実行して、蛍光光度計でナノグラム/マイクロリットル単位の線形プラスミド濃度を決定します。500マイクロリットルのチューブに2マイクロリットルのSP6酵素ミックスに10マイクロリットルの2X NTP/CAP、2マイクロリットルの10X反応バッファー、0.1〜1マイクログラムの線状DNAテンプレートを組み合わせて、SP6 mRNAの生産を設定します。反応液をRNAseフリーの水で最大20マイクロリットル満たし、摂氏37度でインキュベートする前に混合します。2時間後、1マイクロリットルのDNAseを加え、よく混ぜて、さらに15分間インキュベートします。30マイクロリットルの塩化リチウム沈殿溶液を加えて反応を停止します。マイナス20°Cで一晩混ぜて冷やします。翌日、溶液を遠心分離してmRNAをペレット化し、上清を吸引してからペレットを1ミリリットルの80%エタノールで洗浄する。ペレットを風乾し、20マイクロリットルのRNAseフリー水に再懸濁します。蛍光光度計を使用してmRNA濃度を測定し、単回使用のためにチューブあたり100ナノグラムのmRNAを分注し、摂氏マイナス80度で保存します。反応を行うには、P5E、PME、およびP3Eのフェムトモールをそれぞれ10フェムトロール、および宛先ベクターPDESTのフェムトモールを20フェムトモールに集める。プラスミドソースから4つのベクターと塩基対すべてのサイズを特定します。DNAの重量をモルあたり660グラム、プラスミドサイズと塩基対を使用して、4つのベクターすべての濃度を決定した後、エントリーベクターの場合は10フェムトモール、宛先ベクターの場合は20フェムトモールに到達するために必要なプラスミドの合計ナノグラムを計算します。次に、原稿に記載されているコンポーネントを使用して、コンストラクトsox17:EGFP-CAAXを生成します。プラスミド濃度を使用して、10フェムトモールまたは20フェムトモールのいずれかに到達するために必要な各プラスミドの合計マイクロリットルを計算し、これを2で割って5マイクロリットルのハーフLR反応に使用します。P5E SOX17、PME EGFP-CAAX、P3E Poly(A)のフェムトロールを10個、デスティネーションベクターを20フェムトロール生成します。500マイクロリットルのチューブにP5E、PME、P3E、およびPDESTの容量を組み合わせて、5マイクロリットルのハーフLR反応を設定します。それから容量を4マイクロリットルにするために滅菌水を加えなさい。LR酵素混合物をそれぞれ1分間2回ボルテックスしてから、反応に1マイクロリットルを加え、摂氏25度でインキュベートする前に完全に混合します。翌日、0.5マイクロリットルのプロテイナーゼKを加えてLR反応を停止し、摂氏37度で10分間インキュベートした後、室温まで冷却します。次に、プラスミドを添加し、細胞を氷上に25〜30分間放置することにより、3〜4マイクロリットルのプラスミドを解凍した化学的にコンピテントな細胞に変換します。次に、摂氏42度の水浴中で細胞を30秒間ヒートショックします。ヒートショック後、250マイクロリットルの抗生物質を含まないリッチ液体培地を細胞に加え、摂氏37度で1.5時間振とうしながらインキュベートします。300マイクロリットルの細菌懸濁液を1つのアンピシリンLuria-Bertaniプレートに広げ、一晩インキュベートします。翌日、コロニーの2つの表現型(透明と不透明)の存在をスクリーニングします。透明なコロニーを一度に1つずつピックし、液体培養液を接種し、摂氏37度で一晩振とうします。150ナノグラムのプラスミド、100ナノグラムのトランスポザーゼmRNA、および2%フェノールレッドを氷上で組み合わせます。次に、RNAを含まない水を加えて容量を3マイクロリットルにします。寒天を完全に覆うEMで満たされた注射プレートにトランスファーピペットを使用して1細胞期の胚を移し、注入プレートのスロットあたり約50〜75個の胚を静かに押します。mRNAプラスミドフェノールレッド混合物をキャピラリー注射針の開放端に追加します。キャピラリーニードルをインジェクションリグアーマチュアに配置し、インジェクションリグをオンにします。針を射出プレートに下げ、鉗子を使用して先端を折って、射出リグによって少量の混合物のみを排出できるようにします。mRNAプラスミドフェノールレッド混合物の3ナノリットルのボーラスを胚の細胞体に注入します。終了したら、スロットから胚をそっと飛び出して注入プレートから取り出し、新鮮なEMを入れた100ミリメートルのペトリ皿に移します。摂氏28.5度でインキュベートします。蛍光導入遺伝子発現に適した発生段階を選択し、蛍光解剖顕微鏡でスクリーニングします。遺伝子Cmlc2の心臓特異的プロモーターによって駆動されるGFPなどの蛍光トランスジェニックマーカーのスクリーニングによる非蛍光導入遺伝子のスクリーニング。遺伝子導入陽性の胚が成虫に発達して繁殖年齢に達したら、野生型ゼブラフィッシュに交配させて、生殖細胞系列の伝達と導入遺伝子の発現能を個別にスクリーニングします。LR組換えの形質転換から得られた細菌コロニーの例が示されている。透明なコロニーには85%以上の確率で正しいLR組換え産物が含まれていましたが、不透明なコロニーには正しい組換え産物が含まれていませんでした。LR組換え産物の形質転換からの3つのコロニーの診断消化は、単一の不透明なコロニーにはプラスミドを含まないことを示したが、2つの透明なコロニーは9,544塩基対の単一バンドを含んでいた。1,950塩基対のトランスポザーゼmRNAがここに示されている。モザイク内胚葉EGFP-CAAX発現は、注入された胚の75%で観察された。発達中の心臓におけるCmlc2 EGFPのトランスジェニックマーカー発現は、受精後24時間で観察された。成体ゼブラフィッシュはsox17:EGFP-CAAXの生殖細胞系列伝達を有し、内胚葉がEGFP-CAAXで完全に標識された蛍光胚が生成した。内胚葉の前後の長さと、パウチ1から5までの各パウチの背腹長の両方を、対照およびエタノール処理した野生型BMP変異胚で測定しました。内胚葉の全長は、遺伝子型や治療の影響を受けなかった。しかし、パウチ1および3は、未処理およびエタノール処理された野生型胚の間でパウチ長の有意な増加を示したが、未処理およびエタノール処理されたBMP変異体の間では長さの有意な減少を示した。パウチ2は、未処理およびエタノール処理された野生型およびBMP変異体群の間でそれぞれパウチサイズの有意な増加を示した。この手順を試みるときは、Tol2システムのピペッティングと希釈、および胚注入中の細胞体への打撃を正確に行うことが重要です。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

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共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

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Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

同軸ノズルを用いて多能性幹細胞のアルギン酸カプセル化

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

ゼブラフィッシュの発生における急性腎障害のモデル化のための正確な細胞除去法

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...