Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH R35GM133588 til G.L.S., en United States National Academy of Medicine Catalyst Award til G.L.S., State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administreret af Arizona Board of Regents og Ellison Medical Foundation.

1. Fremstilling af stamopløsninger og medier
BEMÆRK: Før du begynder at forberede multibrøndsenhederne, skal du forberede følgende stamopløsninger og medier.
<ol><li>Stamopløsninger til nematodevækstmedier (NGM) og lavsmeltet NGM (lmNGM):<ol><li>Forbered 1 M K 2 HPO4: Tilsæt 174,18 g K2HPO4 til en1 L flaske, og fyld den op til 1 liter med sterilt deioniseret vand. Autoklave (121 °C, 15 psig) i 30 minutter og opbevares ved stuetemper...

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Freitas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm+Paparazzi+-+A+high+throughput+lifespan+and+healthspan+analysis+platform+for+individual+Caenorhabditis+elegans.">Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans.</a> University of Arizona. , (2021).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+High-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

WorMotel-systemet er et kraftfuldt værktøj til indsamling af individualiserede data for hundredvis af isolerede C. elegans over tid. Efter de tidligere undersøgelser ved hjælp af multi-well-enheder til applikationer i udviklingshvile, bevægelsesadfærd og aldring var målet med dette arbejde at optimere forberedelsen af multi-well-enheder til langsigtet overvågning af aktivitet, sundhed og levetid på en højere gennemstrømningsmåde. Dette arbejde giver en detaljeret protokol til forberedelse af enheder ...

Caenorhabditis elegans er almindeligt anvendt i aldringsundersøgelser på grund af deres korte generationstid (ca. 3 dage), kort levetid (ca. 3 uger), let dyrkning i laboratoriet, høj grad af evolutionær bevarelse af molekylære processer og veje med pattedyr og bred tilgængelighed af genetiske manipulationsteknikker. I forbindelse med aldringsundersøgelser giver C. elegans mulighed for hurtig generering af levetidsdata og ældre populationer til analyse af fænotyper i det sene liv hos levende dyr. Den typiske fremgangsmåde til gennemførelse af ormeældningsundersøgelser indebærer manuel måling af levetiden for en population af orme, der opretholdes i grupper på 20 til 70 dyr på faste agarnematodevækstmedier (NGM) i 6 cm petriplader1. Brug af alderssynkroniserede populationer muliggør måling af levetid eller tværsnitsfænotyper hos individuelle dyr på tværs af populationen, men denne metode udelukker overvågning af individuelle dyrs egenskaber over tid. Denne tilgang er også arbejdskrævende og begrænser dermed størrelsen af den befolkning, der kan testes.
Der er et begrænset antal dyrkningsmetoder, der giver mulighed for langsgående overvågning af individuelle C. elegans gennem hele deres levetid, og hver har et særskilt sæt fordele og ulemper. Microfluidics-enheder, herunder WormFarm2, NemaLife3 og "adfærdschip"4, blandt andet 5,6,7, tillader overvågning af individuelle dyr over tid. Dyrkning af orme i flydende kultur ved hjælp af plader med flere brønde muliggør ligeledes overvågning af enten individuelle dyr eller små populationer af C. elegans over tid 8,9. Det flydende miljø repræsenterer en særskilt miljøkontekst fra det almindelige kulturmiljø på faste medier i petriplader, som kan ændre aspekter af dyrefysiologi, der er relevante for aldring, herunder fedtindhold og ekspression af stressresponsgener10,11. Evnen til direkte at sammenligne disse undersøgelser med størstedelen af data indsamlet om aldrende C. elegans er begrænset af forskelle i potentielt vigtige miljøvariabler. Worm Corral12 er en tilgang, der er udviklet til at huse individuelle dyr i et miljø, der i højere grad replikerer typisk solid media-kultur. Worm Corral indeholder et forseglet kammer for hvert dyr på et mikroskopglas ved hjælp af hydrogel, hvilket muliggør langsgående overvågning af isolerede dyr. Denne metode bruger standard brightfield-billeddannelse til at registrere morfologiske data, såsom kropsstørrelse og aktivitet. Dyr placeres dog i hydrogelmiljøet som embryoner, hvor de forbliver uforstyrrede i hele deres levetid. Dette kræver anvendelse af betinget sterile mutante eller transgene genetiske baggrunde, hvilket begrænser både kapaciteten til genetisk screening, da hver ny mutation eller transgen skal krydses ind i en baggrund med betinget sterilitet, og kapaciteten til lægemiddelscreening, da behandlinger kun kan anvendes én gang på dyrene som embryoner.
En alternativ metode udviklet af Fang-Yen-laboratoriet tillader dyrkning af orme på faste medier i individuelle brønde af en mikrofabrikeret polydimethylsiloxan (PDMS) enhed kaldet en WorMotel13,14. Hver enhed placeres i en enkeltbrøndsbakke (dvs. med samme dimensioner som en 96-brøndplade) og har 240 brønde adskilt af en voldgrav fyldt med en aversiv opløsning for at forhindre ormene i at rejse mellem brønde. Hver brønd kan huse en enkelt orm i løbet af sin levetid. Enheden er omgivet af vandabsorberende polyacrylamidgelpellets (kaldet "vandkrystaller"), og bakken er forseglet med Parafilm laboratoriefilm for at opretholde fugtigheden og minimere udtørringen af mediet. Dette system gør det muligt at indsamle data om sundhed og levetid for de enkelte dyr, mens brugen af faste medier bedre sammenfatter det miljø, som dyr oplever i langt størstedelen af de offentliggjorte C. elegans-levetidsundersøgelser, hvilket muliggør mere direkte sammenligninger. For nylig er der udviklet en lignende teknik ved hjælp af polystyrenmikrobakker, der oprindeligt blev brugt til mikrocytotoksicitetsassays15 i stedet for PDMS-enheden16. Mikrobakkemetoden giver mulighed for indsamling af individualiserede data for orme dyrket på faste medier og har forbedret kapaciteten til at indeholde orme under forhold, der typisk ville forårsage flugt (f.eks. Stressfaktorer eller kostbegrænsning), idet afvejningen er, at hver mikrobakke kun kan indeholde 96 dyr16, mens multibrøndsenheden, der anvendes her, kan indeholde op til 240 dyr.
Præsenteret her er en detaljeret protokol til forberedelse af multi-well-enheder, der er optimeret til plade-til-plade-konsistens og forberedelse af flere enheder parallelt. Denne protokol blev tilpasset fra den oprindelige protokol fra Fang-Yen-laboratoriet13. Specifikt er der beskrivelser for teknikker til at minimere kontaminering, optimere den konsekvente tørring af både det faste medie og den bakterielle fødekilde og levere RNAi og lægemidler. Dette system kan bruges til at spore individuel sundhed, levetid og andre fænotyper, såsom kropsstørrelse og form. Disse multibrøndsenheder er kompatible med eksisterende systemer med høj kapacitet til måling af levetid, hvilket kan fjerne meget af det manuelle arbejde, der er involveret i traditionelle levetidseksperimenter og give mulighed for automatiseret, direkte levetidsmåling og sundhedssporing i individuelle C. elegans i skala.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

Nematoden Caenorhabditis elegans er blandt de mest almindelige modelsystemer, der anvendes i aldringsforskning på grund af dens enkle og billige dyrkningsteknikker, hurtige reproduktionscyklus (~ 3 dage), kort levetid (~ 3 uger) og adskillige tilgængelige værktøjer til genetisk manipulation og molekylær analyse. Den mest almindelige tilgang til gennemførelse af aldringsundersøgelser i C. elegans, herunder overlevelsesanalyse, involverer dyrkning af populationer på titusinder til hundreder af dyr sammen på faste nematodevækstmedier (NGM) i petriplader. Mens denne tilgang indsamler data om en population af dyr, sporer de fleste protokoller ikke individuelle dyr over tid. Præsenteret her er en optimeret protokol til langsigtet dyrkning af individuelle dyr på mikrofabrikerede polydimethylsiloxan (PDMS) enheder kaldet WorMotels. Hver enhed gør det muligt at dyrke op til 240 dyr i små brønde, der indeholder NGM, hvor hver brønd isoleres af en kobbersulfatholdig voldgrav, der forhindrer dyrene i at flygte. Med udgangspunkt i den oprindelige WorMotel-beskrivelse giver dette papir en detaljeret protokol til støbning, forberedelse og udfyldning af hver enhed med beskrivelser af almindelige tekniske komplikationer og råd til fejlfinding. Inden for denne protokol er teknikker til konsekvent indlæsning af NGM i små mængder, konsekvent tørring af både NGM og bakteriel mad, muligheder for levering af farmakologiske indgreb, instruktioner til og praktiske begrænsninger for genbrug af PDMS-enheder og tip til minimering af udtørring, selv i miljøer med lav luftfugtighed. Denne teknik tillader langsgående overvågning af forskellige fysiologiske parametre, herunder stimuleret aktivitet, ustimuleret aktivitet, kropsstørrelse, bevægelsesgeometri, sundhedslængde og overlevelse i et miljø, der ligner standardteknikken til gruppekultur på faste medier i petriplader. Denne metode er kompatibel med dataindsamling med høj kapacitet, når den bruges sammen med automatiseret mikroskopi og analysesoftware. Endelig diskuteres begrænsningerne ved denne teknik samt en sammenligning af denne tilgang til en nyligt udviklet metode, der bruger mikrobakker til dyrkning af isolerede nematoder på faste medier.

WorMotel-kultursystemet kan bruges til at indsamle en række data, herunder vedrørende levetid, sundhed og aktivitet. Offentliggjorte undersøgelser har brugt multi-well enheder til at studere levetid og sundhedspan 13,14, hviletilstand og søvn 22,23,24 og adfærd 25. Levetid kan scores manuelt eller gennem en samling af billeder og downstream b...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Her præsenteres en optimeret protokol til dyrkning af isolerede individuelle nematoder på faste medier i mikrofabrikerede multibrøndsenheder. Denne tilgang gør det muligt at overvåge individuelle dyr gennem hele deres liv for en række fænotyper relateret til aldring og sundhed, herunder aktivitet, kropsstørrelse og form, bevægelsesgeometri og overlevelse.

Langsigtet dyrkning og overvågning af isolerede Caenorhabditis elegans på faste medier i enheder med flere brønde

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

Når vi studerer aldring og haveleganer, følger vi typisk en population af dyr over tid. Dette giver os et glimt af, hvad den proces, du studerer, gør i befolkningen på hvert tidspunkt, men det fortæller dig ikke, hvordan processen ændrer sig hos individuelle dyr over tid. Disse enkelte dyrekulturmiljøer giver os mulighed for at følge dynamiske ændringer i molekylære processer og fysiologiske processer hos individuelle dyr over tid for hundredvis af dyr parallelt.Vi finder ud af, at der er to vigtige ting, der virkelig kan påvirke kvaliteten af disse multi-well kultursystemer. Den ene er enten over- eller undertørring af brøndene, og den anden er forurening. Og vi forsøger at notere i hele protokollen specifikke trin, hvor du kan prøve at afbøde disse problemer.Emily Gardea demonstrerer protokollen i dag. Hun er tekniker i mit laboratorium og har gjort meget arbejde for at optimere denne protokol. Efter tilberedning af alle reagenserne blandes 60 gram PDMS-base og seks gram hærdningsmiddel pr. Form i en stor engangsbåd ved hjælp af en engangsspatel.Anbring PDMS-blandingen i et vakuumkammer i 30 minutter ved minus 0,08 Mega Pascal for at fjerne bobler. Hæld og fyld PDMS-blandingen i hver 3D-printet form. Sæt den fyldte form og enhver ekstra PDMS-blanding i vakuumkammeret i 25 minutter ved minus 0,08 Mega Pascal.Fjern den fyldte form fra vakuumkammeret, og pop eventuelle resterende bobler med en engangsspatel. Start med den ene kant, sænk langsomt en flad akrylplade oven på den PDMS-fyldte form. Hvis der opstår bobledannelse, skal du fortsætte som beskrevet i manuskriptet.Placer en vægt på 2.5 pund på akrylen, og læg de vægtede forme i ovnen. Lad dem helbrede ved 55 grader Celsius natten over. Ved afslutningen af inkubationen fjernes vægten og formene fra ovnen.Arbejd derefter et barberblad mellem akryl og hærdet PDMS For at bryde forseglingen Brug en barbermaskine eller en metalspatel til forsigtigt at løsne siderne af de hærdede PDMS og fjerne dem fra formen. Pak PDMS-enheden ind i aluminiumsfolie. Forsegl det med autoklavetape og steriliser ved autoklavering på en tør cyklus i mindst 15 minutter ved 121 grader Celsius og 15 pund pr. Kvadrattomme måletryk.For at forberede multi-well-enheden skal du forvarme en tør perlebadsinkubator til 90 grader Celsius. Pak en autoklaveret multibrøndsenhed ud, og skær et lille hak i øverste højre hjørne af enheden. Anbring op til tre uindpakkede enheder i plasmarenseren med hullerne opad, og kør plasmarenseren.Steriliser en enkelt brøndpolystyrenbakke pr. enhed ved at sprøjte indersiden af bakken med 70% ethanol og tørre den tør med en opgaveserviet. Fjern hver enhed fra plasmarenseren med en handskehånd og læg den i en rengjort bakke. Anbring derefter et 25 ml engangspipettebassin i perlebadinkubatoren, der er forvarmet til 90 grader Celsius.Tag et rør størknet LMNGM-forblanding pr. enhed, der skal fyldes, og læg det i et 200 ml glasbægerglas. Fjern hætten og parafilm og mikrobølgeovn, indtil mediet smelter tilstrækkeligt til at hælde. Hæld den smeltede LMNGM-forblanding i et andet sterilt 200 ml bægerglas.Flere reagensglas kan kombineres i dette bægerglas, hvis mere end én anordning fyldes ad gangen. Mikrobølge LMNGM-forblandingen i yderligere 20 sekunder. Hvis forblandingen begynder at koge over, skal du stoppe mikrobølgeovnen og lade den bundfælde sig.Fjern den smeltede LMNGM-forblanding fra mikrobølgeovnen og afkøl den til 60 grader Celsius. Tilsæt de resterende LMNGM-ingredienser til forblandingsblandingen, og hæld den smeltede LMNGM i 25 ml-bassinet i perlebadet. Fyld enhedens brønde ved hjælp af en 200 mikroliter flerkanals repeaterpipette.Indstil repeateren til at dispensere alikvoter på 14 mikroliter, og monter fem pipettespidser. Fyld spidserne med smeltet LMNGM og hæld de første 14 mikroliter tilbage i det LMNGM-holdige bassin. Bevæg dig hurtigt, men forsigtigt, dispenser 14 mikroliter i enhedens indre brønde og dispenser den resterende LMNGM tilbage i bassinet, da den endelige delprøve typisk er mindre end 14 mikroliter.Indstil derefter repeateren til at dispensere alikvoter på 15 mikroliter og fyld den yderste ring af brønde. Brug en 200 mikroliter pipette til at dispensere 200 mikroliter kobbersulfatopløsning i enhedens voldgrav i hvert hjørne. Undgå at overfylde voldgraven, og sørg for, at kobbersulfatet ikke berører brøndenes øverste overflade.Hvis kobbersulfatet ikke flyder let gennem hele voldgraven, skal du bruge en kort platintrådpluk til at hjælpe med at bryde spændingen og trække kobbersulfatet gennem voldgraven. Når kobbersulfatet har strømmet gennem hele voldgraven, fjernes så meget kobbersulfat som muligt ved hjælp af en 200 mikroliter pipette eller aspiration med et vakuum. Brug en klemmeflaske til at tilføje vandkrystallerne i mellemrummet mellem enheden og bakkevæggene.Luk bakkelåget, og pakk alle fire sider ind med et stykke parafilm. Tilføj yderligere to parafilmstykker for at forsegle pladen helt. Brug en repeaterpipette til at spotte hver brønd med fem mikroliter koncentrerede bakterier.Undgå direkte kontakt med LMNGM-overfladen. Tør enhederne ved hjælp af en specialbygget tørreboks, der kan konstrueres til minimale omkostninger ved hjælp af computerventilatorer og HEPA-filtre. Under et dissektionsomfang skal du inspicere brønde for at sikre, at alle brønde er tørret med succes.Brug en platinplukning til at overføre dyrene fra de forberedte ormeplader og tilsæt en orm pr. Brønd. Tilsæt en dråbe forberedt vaskemiddelopløsning på indersiden af bakkelåget, og gnid med en opgaveserviet, indtil vaskemiddelopløsningen er tørret. Pak bakken ind med tre stykker parafilm som beskrevet i manuskriptet.Levetidsforlængelsen fra daf-2 (RNAi) blokeres af daf-16 nullmutationen. Sundhedsspændvidden faldt også i nærvær af daf-2(RNAi)Det tre-dages rullende gennemsnit af aktivitet over hele levetiden reduceres med daf-16-mutant og daf-2(RNAi)Variationen i levetid og sundhedslængde på tværs af individuelle dyr sammenlignet enten i absolutte tal eller som en brøkdel af den samlede levetid vises. Den kumulative aktivitet på tværs af levetiden for individuelle dyr korrelerer bedre med levetiden end aktiviteten for individuelle dyr på en bestemt dag i løbet af levetiden.Det er vigtigt at fylde brøndene og tilføje ormene så hurtigt som muligt. Ellers kan brøndene tørre ud, og ormene overlever ikke. Dette system er kompatibelt med automatiseret billeddannelse, som kan bruges til at indsamle data med høj kapacitet såsom levetid, aktivitet og kropsstørrelse eller form.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsigtet dødelige toksicitet Test med krebsdyr Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Udvinding og Analyse i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Dyrkning<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; I Axeniske Liquid Media og fremstilling af transgene Worms ved mikropartikelbombardement

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolation, transfektion og langsigtet kultur af voksne mus og rat kardiomyocytter

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging af Lipid Storage Dynamics i Caenorhabditis elegans ved hjælp af stimuleret Raman Scattering Mikroskopi

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...