Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH R35GM133588 aan G.L.S., een United States National Academy of Medicine Catalyst Award aan G.L.S., het State of Arizona Technology and Research Initiative Fund beheerd door de Arizona Board of Regents en de Ellison Medical Foundation.

1. Bereiding van stockoplossingen en media
OPMERKING: Voordat u begint met de voorbereiding van de multi-well-apparaten, bereidt u de volgende voorraadoplossingen en media voor.
<ol><li>Stamoplossingen voor nematodengroeimedia (NGM) en laagsmeltende NGM (lmNGM):<ol><li>Bereid 1 MK2 HPO4: Voeg 174,18 g K2HPO4 toe aan een fles van 1 L en vul deze tot 1 L met steriel gedeïoniseerd water. Autoclaaf (121 °C, 15 psig) gedurende 30 min, en bewaren...

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Freitas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm+Paparazzi+-+A+high+throughput+lifespan+and+healthspan+analysis+platform+for+individual+Caenorhabditis+elegans.">Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans.</a> University of Arizona. , (2021).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+High-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

Het WorMotel-systeem is een krachtig hulpmiddel voor het verzamelen van geïndividualiseerde gegevens voor honderden geïsoleerde C. elegans in de loop van de tijd. Na de eerdere studies met behulp van multi-well-apparaten voor toepassingen in ontwikkelingsrust, locomotorisch gedrag en veroudering, was het doel van dit werk om de voorbereiding van multi-well-apparaten te optimaliseren voor de langetermijnmonitoring van activiteit, gezondheid en levensduur op een manier met een hogere doorvoer. Dit werk biedt een...

Caenorhabditis elegans worden vaak gebruikt in verouderingsstudies vanwege hun korte generatietijd (ongeveer 3 dagen), korte levensduur (ongeveer 3 weken), gemak van kweken in het laboratorium, hoge mate van evolutionair behoud van moleculaire processen en routes met zoogdieren, en brede beschikbaarheid van genetische manipulatietechnieken. In de context van verouderingsstudies maken C. elegans het mogelijk om snel gegevens over de levensduur en verouderde populaties te genereren voor de analyse van fenotypen op latere leeftijd bij levende dieren. De typische aanpak voor het uitvoeren van wormverouderingsstudies omvat het handmatig meten van de levensduur van een populatie wormen die in groepen van 20 tot 70 dieren wordt gehouden op vaste agarnematodengroeimedia (NGM) in 6 cm petriplaten1. Het gebruik van leeftijdsgesynchroniseerde populaties maakt het mogelijk om de levensduur of cross-sectionele fenotypes in individuele dieren in de hele populatie te meten, maar deze methode sluit het monitoren van de kenmerken van individuele dieren in de loop van de tijd uit. Deze aanpak is ook arbeidsintensief, waardoor de omvang van de populatie die kan worden getest, wordt beperkt.
Er is een beperkt aantal kweekmethoden die de longitudinale monitoring van individuele C. elegans gedurende hun hele levensduur mogelijk maken, en elk heeft een verschillende reeks voor- en nadelen. Microfluïdica-apparaten, waaronder WormFarm2, NemaLife3 en de "gedrags"-chip4, onder andere 5,6,7, maken het mogelijk om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen. Het kweken van wormen in vloeibare cultuur met behulp van multi-well platen maakt het op dezelfde manier mogelijk om individuele dieren of kleine populaties van C. elegans in de loop van de tijd te volgen 8,9. De vloeibare omgeving vertegenwoordigt een andere omgevingscontext dan de gemeenschappelijke kweekomgeving op vaste media in petrischlaten, die aspecten van de dierfysiologie kunnen veranderen die relevant zijn voor veroudering, waaronder het vetgehalte en de expressie van stressresponsgenen10,11. Het vermogen om deze studies direct te vergelijken met de meerderheid van de verzamelde gegevens over ouder wordende C. elegans wordt beperkt door verschillen in potentieel belangrijke omgevingsvariabelen. De Worm Corral12 is een benadering die is ontwikkeld om individuele dieren te huisvesten in een omgeving die de typische vaste mediacultuur beter nabootst. De Worm Corral bevat een afgesloten kamer voor elk dier op een microscoopglaasje met behulp van hydrogel, waardoor geïsoleerde dieren longitudinaal kunnen worden gevolgd. Deze methode maakt gebruik van standaard brightfield-beeldvorming om morfologische gegevens vast te leggen, zoals lichaamsgrootte en activiteit. Dieren worden echter als embryo's in de hydrogelomgeving geplaatst, waar ze hun hele leven ongestoord blijven. Dit vereist het gebruik van voorwaardelijk steriele mutante of transgene genetische achtergronden, wat zowel de capaciteit voor genetische screening beperkt, aangezien elke nieuwe mutatie of transgen moet worden gekruist naar een achtergrond met voorwaardelijke steriliteit, als de capaciteit voor geneesmiddelenscreening, aangezien behandelingen slechts eenmaal kunnen worden toegepast op de dieren als embryo's.
Een alternatieve methode ontwikkeld door het Fang-Yen lab maakt het mogelijk om wormen te kweken op vaste media in individuele putten van een microgefabriceerd polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat genaamd een WorMotel13,14. Elk apparaat wordt in een lade met één put geplaatst (d.w.z. met dezelfde afmetingen als een plaat met 96 putten) en heeft 240 putten gescheiden door een gracht gevuld met een aversieve oplossing om te voorkomen dat de wormen tussen putten reizen. Elke put kan een enkele worm huisvesten voor de duur van zijn levensduur. Het apparaat is omgeven door waterabsorberende polyacrylamide-gelpellets (aangeduid als "waterkristallen") en de lade is verzegeld met Parafilm-laboratoriumfilm om de luchtvochtigheid te handhaven en de uitdroging van de media te minimaliseren. Met dit systeem kunnen gegevens over gezondheid en levensduur voor individuele dieren worden verzameld, terwijl het gebruik van vaste media de omgeving die dieren ervaren in de overgrote meerderheid van de gepubliceerde C. elegans levensduurstudies beter samenvat, waardoor directere vergelijkingen mogelijk zijn. Onlangs is een vergelijkbare techniek ontwikkeld met behulp van polystyreenmicrotrays die oorspronkelijk werden gebruikt voor microcytotoxiciteitstests15 in plaats van het PDMS-apparaat16. De microtray-methode maakt het mogelijk om geïndividualiseerde gegevens te verzamelen voor wormen die op vaste media zijn gekweekt en heeft een verbeterde capaciteit voor het bevatten van wormen onder omstandigheden die normaal gesproken vluchten zouden veroorzaken (bijv. Stressoren of dieetbeperking), met als afweging dat elke microtray slechts 96 dieren kan bevatten16, terwijl het multi-well apparaat dat hier wordt gebruikt tot 240 dieren kan bevatten.
Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het voorbereiden van multi-well-apparaten dat is geoptimaliseerd voor plaat-tot-plaatconsistentie en de voorbereiding van meerdere apparaten parallel. Dit protocol is aangepast van het oorspronkelijke protocol van het Fang-Yen laboratorium13. Specifiek zijn er beschrijvingen voor technieken om besmetting te minimaliseren, de consistente droging van zowel de vaste media als de bacteriële voedselbron te optimaliseren en RNAi en medicijnen te leveren. Dit systeem kan worden gebruikt om individuele gezondheid, levensduur en andere fenotypen te volgen, zoals lichaamsgrootte en -vorm. Deze multi-well apparaten zijn compatibel met bestaande high-throughput systemen om de levensduur te meten, die veel van de handmatige arbeid die betrokken is bij traditionele levensduurexperimenten kan verwijderen en de mogelijkheid biedt voor geautomatiseerde, directe levensduurmeting en gezondheidstracking in individuele C. elegans op schaal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

De nematode Caenorhabditis elegans is een van de meest voorkomende modelsystemen die worden gebruikt in verouderingsonderzoek vanwege de eenvoudige en goedkope kweektechnieken, snelle reproductiecyclus (~ 3 dagen), korte levensduur (~ 3 weken) en tal van beschikbare hulpmiddelen voor genetische manipulatie en moleculaire analyse. De meest gebruikelijke benadering voor het uitvoeren van verouderingsstudies bij C. elegans, inclusief overlevingsanalyse, omvat het kweken van populaties van tientallen tot honderden dieren samen op vaste nematodengroeimedia (NGM) in petrischolen. Hoewel deze aanpak gegevens verzamelt over een populatie dieren, volgen de meeste protocollen individuele dieren niet in de loop van de tijd. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het langdurig kweken van individuele dieren op microgefabriceerde polydimethylsiloxaan (PDMS) -apparaten genaamd WorMotels. Met elk apparaat kunnen tot 240 dieren worden gekweekt in kleine putten die NGM bevatten, waarbij elke put wordt geïsoleerd door een kopersulfaathoudende gracht die voorkomt dat de dieren vluchten. Voortbouwend op de oorspronkelijke WorMotel-beschrijving, biedt dit artikel een gedetailleerd protocol voor het vormen, voorbereiden en vullen van elk apparaat, met beschrijvingen van veelvoorkomende technische complicaties en advies voor het oplossen van problemen. Binnen dit protocol zijn technieken voor het consistent laden van kleine hoeveelheden NGM, het consistent drogen van zowel de NGM als bacterieel voedsel, opties voor het leveren van farmacologische interventies, instructies voor en praktische beperkingen voor het hergebruik van PDMS-apparaten en tips voor het minimaliseren van uitdroging, zelfs in omgevingen met een lage luchtvochtigheid. Deze techniek maakt de longitudinale monitoring van verschillende fysiologische parameters mogelijk, waaronder gestimuleerde activiteit, niet-gestimuleerde activiteit, lichaamsgrootte, bewegingsgeometrie, gezondheid en overleving, in een omgeving die vergelijkbaar is met de standaardtechniek voor groepscultuur op vaste media in petrischplaten. Deze methode is compatibel met gegevensverzameling met hoge doorvoer wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met geautomatiseerde microscopie- en analysesoftware. Ten slotte worden de beperkingen van deze techniek besproken, evenals een vergelijking van deze aanpak met een recent ontwikkelde methode die microtrays gebruikt om geïsoleerde nematoden op vaste media te kweken.

Het WorMotel-cultuursysteem kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan gegevens te verzamelen, waaronder over levensduur, gezondheid en activiteit. Gepubliceerde studies hebben multi-well-apparaten gebruikt om levensduur en gezondheid 13,14, rust en slaap 22,23,24 en gedrag 25 te bestuderen. De levensduur kan handmatig worden gescoord of door ...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het kweken van geïsoleerde individuele nematoden op vaste media in microgefabriceerde multi-well-apparaten. Met deze aanpak kunnen individuele dieren gedurende hun hele leven worden gevolgd op een verscheidenheid aan fenotypen die verband houden met veroudering en gezondheid, waaronder activiteit, lichaamsgrootte en -vorm, bewegingsgeometrie en overleving.

Langetermijnkweek en monitoring van geïsoleerde Caenorhabditis elegans op vaste media in multiwell-apparaten

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

Wanneer we veroudering en zee-elegans bestuderen, volgen we meestal een populatie dieren in de loop van de tijd. Dit geeft ons een glimp van wat dat proces dat je bestudeert doet in de populatie op elk tijdstip, maar het vertelt je niet hoe het proces in de loop van de tijd verandert bij individuele dieren. Deze omgevingen met één diercultuur stellen ons in staat om dynamische veranderingen in moleculaire processen en fysiologische processen in individuele dieren in de loop van de tijd te volgen voor honderden dieren parallel.We vinden dat er twee belangrijke dingen zijn die echt van invloed kunnen zijn op de kwaliteit van deze multi-well cultuursystemen. De ene is het over- of onderdrogen van de putten en de tweede is vervuiling. En we proberen in het hele protocol specifieke stappen te noteren waar u kunt proberen deze problemen te verminderen.Het protocol wordt vandaag gedemonstreerd door Emily Gardea. Ze is een technicus in mijn lab en heeft veel werk verzet om dit protocol te optimaliseren. Na het bereiden van alle reagentia, meng 60 gram PDMS-basis en zes gram uithardingsmiddel per mal in een grote wegwerpboot met behulp van een wegwerpspatel.Plaats het PDMS-mengsel gedurende 30 minuten in een vacuümkamer bij min 0,08 Mega Pascal om bubbels te verwijderen. Giet en vul het PDMS-mengsel in elke 3D-geprinte mal. Plaats de gevulde mal en het eventuele extra PDMS-mengsel gedurende 25 minuten in de vacuümkamer bij min 0,08 Mega Pascal.Verwijder de gevulde vorm uit de vacuümkamer en knal eventuele resterende bubbels met een wegwerpspatel. Begin met één rand en laat langzaam een vlakke acrylplaat op de met PDMS gevulde mal zakken. Als er bubbelvorming optreedt, ga dan verder zoals beschreven in het manuscript.Plaats een gewicht van 2,5 pond op het acryl en plaats de verzwaarde vormen in de oven. Laat ze een nacht uitharden bij 55 graden Celsius. Verwijder aan het einde van de incubatie de gewichten en de vormen uit de oven.Werk vervolgens een scheermesje tussen het acryl en het uitgeharde PDMS Om de verzegeling te verbreken Gebruik een scheermes of een metalen spatel en maak voorzichtig de zijkanten van het uitgeharde PDMS los en verwijder ze uit de mal. Wikkel het PDMS-apparaat in aluminiumfolie. Verzegel het met autoclaaftape en steriliseer het door autoclaveren op een droge cyclus gedurende ten minste 15 minuten bij 121 graden Celsius en 15 pond per vierkante inch meterdruk.Om het multi-well-apparaat voor te bereiden, verwarmt u een droge kraalbadincubator voor tot 90 graden Celsius. Pak een autoclaaf multi-well apparaat uit en knip een kleine inkeping in de rechterbovenhoek van het apparaat. Plaats maximaal drie onverpakte apparaten in de plasmareiniger met de putjes naar boven gericht en laat de plasmareiniger lopen.Steriliseer één enkele putpolystyreenbak per apparaat door de binnenkant van de lade met 70% ethanol te besproeien en droog te vegen met een taakdoekje. Verwijder elk apparaat uit de plasmareiniger met een gehandschoende hand en plaats het in een schoongemaakte lade. Plaats vervolgens een wegwerppipetbak van 25 milliliter in de kralenbadincubator die is voorverwarmd op 90 graden Celsius.Neem één tube gestolde LMNGM-voormengsel per te vullen apparaat en plaats deze in een glazen bekerglas van 200 milliliter. Verwijder de dop en Parafilm en magnetron totdat het medium voldoende smelt om te gieten. Giet het gesmolten LMNGM-voormengsel in een ander steriel bekerglas van 200 milliliter.In dit bekerglas kunnen meerdere reageerbuizen worden gecombineerd als er meer dan één apparaat tegelijk wordt gevuld. Zet het LMNGM-voormengsel nog eens 20 seconden in de magnetron. Als het voormengsel begint over te koken, stop dan met de magnetron en laat het bezinken.Haal het gesmolten LMNGM voormengsel uit de magnetron en koel af tot 60 graden Celsius. Voeg de resterende LMNGM-ingrediënten toe aan het voormengmengsel en giet de gesmolten LMNGM in het bassin van 25 milliliter in het kralenbad. Vul de putjes van het apparaat met een meerkanaals repeaterpipet van 200 microliter.Stel de repeater in op het doseren van aliquots van 14 microliter en monteer vijf pipetpunten. Laad de uiteinden met gesmolten LMNGM en doseer de eerste 14 microliter terug in het LMNGM-bevattende bassin. Beweeg snel maar voorzichtig, doseer 14 microliter in de binnenste putten van het apparaat en doseer de resterende LMNGM terug in het bassin, omdat het uiteindelijke aliquot meestal minder dan 14 microliter is.Stel vervolgens de repeater in om aliquots van 15 microliter af te geven en vul de buitenste ring van putjes. Gebruik een pipet van 200 microliter en doseer 200 microliter kopersulfaatoplossing in de slotgracht van het apparaat in elke hoek. Vermijd overvulling van de gracht en zorg ervoor dat het kopersulfaat het bovenoppervlak van de putten niet raakt.Als het kopersulfaat niet gemakkelijk door de hele gracht stroomt, gebruik dan een korte platinadraadprikker om de spanning te doorbreken en het kopersulfaat door de gracht te slepen. Nadat het kopersulfaat door de hele gracht is gestroomd, verwijdert u zoveel mogelijk kopersulfaat met behulp van een pipet van 200 microliter of aspiratie met een vacuüm. Voeg met behulp van een knijpfles de waterkristallen toe in de ruimtes tussen het apparaat en de wanden van de lade.Sluit het deksel van de lade en wikkel alle vier de zijden in met een stukje Parafilm. Voeg twee extra Parafilm-stukjes toe om de plaat volledig af te sluiten. Gebruik een repeaterpipet om elke put te spotten met vijf microliter geconcentreerde bacteriën.Vermijd direct contact met het LMNGM-oppervlak. Droog de apparaten met behulp van een op maat gemaakte droogbox die tegen minimale kosten kan worden geconstrueerd met behulp van computerbehuizingsventilatoren en HEPA-filters. Inspecteer onder een dissectiescoop putten om ervoor te zorgen dat alle putten met succes zijn opgedroogd.Breng met behulp van een platinapluk de dieren over van de voorbereide wormplaten en voeg één worm per put toe. Voeg een druppel bereide reinigingsmiddeloplossing toe aan de binnenkant van het deksel van de lade en wrijf met een taakdoekje totdat de reinigingsmiddeloplossing is opgedroogd. Wikkel het dienblad in met drie stukjes Parafilm zoals beschreven in het manuscript.De levensduurverlenging van daf-2(RNAi) wordt geblokkeerd door de daf-16 nulmutatie. De gezondheidsspanne nam ook af in de aanwezigheid van daf-2(RNAi)Het driedaagse voortschrijdende gemiddelde van activiteit gedurende de levensduur wordt verminderd door daf-16-mutant en daf-2(RNAi)De variatie in levensduur en gezondheidsspanne tussen individuele dieren vergeleken in absolute termen of als een fractie van de totale levensduur wordt weergegeven. De cumulatieve activiteit gedurende de levensduur voor individuele dieren correleert beter met de levensduur dan de activiteit voor individuele dieren op een specifieke dag gedurende de levensduur.Het is belangrijk om de putten te vullen en de wormen zo snel mogelijk toe te voegen. Anders kunnen de putten uitdrogen en zullen de wormen het niet overleven. Dit systeem is compatibel met geautomatiseerde beeldvorming die kan worden gebruikt om gegevens met een hoge doorvoer te verzamelen, zoals levensduur, activiteit en lichaamsgrootte of -vorm.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopie van de vroege embryogenese in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandine-extractie en analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Kweken<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...