Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par NIH R35GM133588 à G.L.S., un prix Catalyst de l’Académie nationale de médecine des États-Unis à G.L.S., le Fonds d’initiative de technologie et de recherche de l’État de l’Arizona administré par l’Arizona Board of Regents et la Fondation médicale Ellison.

1. Préparation des solutions de stock et des supports
REMARQUE: Avant de commencer la préparation des dispositifs multipuits, préparez les solutions mères et les supports suivants.
<ol><li>Solutions mères pour milieux de croissance des nématodes (NGM) et NGM à bas point de fusion (lmNGM):<ol><li>Préparer 1 M K 2 HPO4 : Ajouter 174,18 g de K2HPO4 dansune bouteille de 1 L et la remplir jusqu’à 1 L d’eau désionisée stérile. Autoc...

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

Le système WorMotel est un outil puissant pour recueillir des données individualisées pour des centaines de C. elegans isolés au fil du temps. À la suite des études antérieures utilisant des dispositifs multipuits pour des applications dans la quiescence développementale, le comportement locomoteur et le vieillissement, l’objectif de ce travail était d’optimiser la préparation de dispositifs multipuits pour la surveillance à long terme de l’activité, de la santé et de la durée de vie de mani?...

Caenorhabditis elegans est couramment utilisé dans les études sur le vieillissement en raison de son temps de génération court (environ 3 jours), de sa courte durée de vie (environ 3 semaines), de sa facilité de culture en laboratoire, de son degré élevé de conservation évolutive des processus moléculaires et des voies avec les mammifères et de la grande disponibilité des techniques de manipulation génétique. Dans le contexte des études sur le vieillissement, C. elegans permet la génération rapide de données sur la longévité et de populations âgées pour l’analyse des phénotypes en fin de vie chez les animaux vivants. L’approche typique pour mener des études sur le vieillissement des vers consiste à mesurer manuellement la durée de vie d’une population de vers maintenue en groupes de 20 à 70 animaux sur milieu de croissance du nématode gélose solide (NGM) dans des plaques de Petri de 6 cm1. L’utilisation de populations synchronisées selon l’âge permet de mesurer la durée de vie ou les phénotypes transversaux chez les animaux individuels de la population, mais cette méthode empêche de surveiller les caractéristiques des animaux individuels au fil du temps. Cette approche est également exigeante en main-d’œuvre, limitant ainsi la taille de la population pouvant être testée.
Il existe un nombre limité de méthodes de culture qui permettent la surveillance longitudinale de C. elegans tout au long de leur vie, et chacune présente un ensemble distinct d’avantages et d’inconvénients. Les dispositifs microfluidiques, y compris WormFarm2, NemaLife3 et la puce « comportementale »4, entre autres 5,6,7, permettent de surveiller des animaux individuels au fil du temps. La culture de vers en culture liquide à l’aide de plaques multipuits permet également de surveiller des animaux individuels ou de petites populations de C. elegans au fil du temps 8,9. L’environnement liquide représente un contexte environnemental distinct de l’environnement de culture commun sur les milieux solides dans les plaques de Petri, ce qui peut modifier les aspects de la physiologie animale qui sont pertinents pour le vieillissement, y compris la teneur en graisse et l’expression des gènes de réponse au stress10,11. La capacité de comparer directement ces études à la majorité des données recueillies sur le vieillissement de C. elegans est limitée par les différences dans les variables environnementales potentiellement importantes. Le Worm Corral12 est une approche développée pour héberger des animaux individuels dans un environnement qui reproduit plus fidèlement la culture médiatique solide typique. Le Worm Corral contient une chambre scellée pour chaque animal sur une lame de microscope utilisant de l’hydrogel, permettant la surveillance longitudinale des animaux isolés. Cette méthode utilise l’imagerie en fond clair standard pour enregistrer des données morphologiques, telles que la taille et l’activité corporelles. Cependant, les animaux sont placés dans l’environnement hydrogel en tant qu’embryons, où ils restent intacts tout au long de leur vie. Cela nécessite l’utilisation de milieux génétiques mutants ou transgéniques conditionnellement stériles, ce qui limite à la fois la capacité de dépistage génétique, car chaque nouvelle mutation ou transgène doit être croisé dans un arrière-plan avec stérilité conditionnelle, et la capacité de dépistage de médicaments, car les traitements ne peuvent être appliqués qu’une seule fois aux animaux en tant qu’embryons.
Une méthode alternative développée par le laboratoire Fang-Yen permet la culture de vers sur des milieux solides dans des puits individuels d’un dispositif microfabriqué de polydiméthylsiloxane (PDMS) appelé WorMotel13,14. Chaque dispositif est placé dans un plateau à puits unique (c’est-à-dire avec les mêmes dimensions qu’une plaque de 96 puits) et comporte 240 puits séparés par un fossé rempli d’une solution aversive pour empêcher les vers de se déplacer entre les puits. Chaque puits peut abriter un seul ver pendant toute sa durée de vie. L’appareil est entouré de granulés de gel de polyacrylamide absorbant l’eau (appelés « cristaux d’eau »), et le plateau est scellé avec un film de laboratoire Parafilm pour maintenir l’humidité et minimiser la dessiccation du média. Ce système permet de recueillir des données sur la durée de vie et la durée de vie de chaque animal, tandis que l’utilisation de milieux solides récapitule mieux l’environnement vécu par les animaux dans la grande majorité des études publiées sur la durée de vie de C. elegans, permettant ainsi des comparaisons plus directes. Récemment, une technique similaire a été développée en utilisant des microplateaux en polystyrène qui étaient à l’origine utilisés pour les tests de microcytotoxicité15 à la place du dispositif PDMS16. La méthode des microplateaux permet de recueillir des données individualisées sur les vers cultivés sur des milieux solides et a amélioré la capacité de contenir les vers dans des conditions qui causeraient généralement la fuite (par exemple, les facteurs de stress ou les restrictions alimentaires), le compromis étant que chaque microplateau ne peut contenir que 96 animaux16, alors que le dispositif multipuits utilisé ici peut contenir jusqu’à 240 animaux.
Vous trouverez ici un protocole détaillé pour la préparation de dispositifs multipuits optimisé pour la cohérence de plaque à plaque et la préparation de plusieurs dispositifs en parallèle. Ce protocole a été adapté du protocole original du laboratoire Fang-Yen13. Plus précisément, il existe des descriptions de techniques visant à minimiser la contamination, à optimiser le séchage constant des milieux solides et de la source alimentaire bactérienne, et à administrer l’ARNi et les médicaments. Ce système peut être utilisé pour suivre la durée de santé individuelle, la durée de vie et d’autres phénotypes, tels que la taille et la forme du corps. Ces dispositifs multipuits sont compatibles avec les systèmes à haut débit existants pour mesurer la durée de vie, ce qui peut éliminer une grande partie du travail manuel impliqué dans les expériences traditionnelles sur la durée de vie et offrir la possibilité de mesurer la longévité et de suivre la santé de C. elegans à grande échelle automatisés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

Le nématode Caenorhabditis elegans est l’un des systèmes modèles les plus couramment utilisés dans la recherche sur le vieillissement en raison de ses techniques de culture simples et peu coûteuses, de son cycle de reproduction rapide (~3 jours), de sa courte durée de vie (~3 semaines) et de ses nombreux outils disponibles pour la manipulation génétique et l’analyse moléculaire. L’approche la plus courante pour mener des études sur le vieillissement chez C. elegans, y compris l’analyse de survie, consiste à cultiver des populations de dizaines à des centaines d’animaux ensemble sur des milieux de croissance de nématodes solides (NGM) dans des plaques de Petri. Bien que cette approche recueille des données sur une population d’animaux, la plupart des protocoles ne suivent pas les animaux individuels au fil du temps. Un protocole optimisé pour la culture à long terme d’animaux individuels sur des dispositifs microfabriqués de polydiméthylsiloxane (PDMS) microfabriqués appelés WorMotels est présenté ici. Chaque dispositif permet de cultiver jusqu’à 240 animaux dans de petits puits contenant du NGM, chaque puits étant isolé par un fossé contenant du sulfate de cuivre qui empêche les animaux de fuir. S’appuyant sur la description originale de WorMotel, ce document fournit un protocole détaillé pour le moulage, la préparation et le remplissage de chaque appareil, avec des descriptions des complications techniques courantes et des conseils pour le dépannage. Ce protocole comprend des techniques pour le chargement constant de NGM en petit volume, le séchage constant du NGM et des aliments bactériens, des options pour la réalisation d’interventions pharmacologiques, des instructions et des limites pratiques pour la réutilisation des dispositifs PDMS, et des conseils pour minimiser la dessiccation, même dans des environnements à faible humidité. Cette technique permet la surveillance longitudinale de divers paramètres physiologiques, y compris l’activité stimulée, l’activité non stimulée, la taille corporelle, la géométrie du mouvement, la durée de santé et la survie, dans un environnement similaire à la technique standard pour la culture de groupe sur des milieux solides dans des plaques de Petri. Cette méthode est compatible avec la collecte de données à haut débit lorsqu’elle est utilisée conjointement avec un logiciel de microscopie et d’analyse automatisé. Enfin, les limites de cette technique sont discutées, ainsi qu’une comparaison de cette approche avec une méthode récemment développée qui utilise des microplateaux pour cultiver des nématodes isolés sur des milieux solides.

Le système de culture WorMotel peut être utilisé pour recueillir une variété de données, y compris concernant la durée de vie, la durée de vie et l’activité. Des études publiées ont utilisé des dispositifs multipuits pour étudier la durée de vie et la durée de vie 13,14, la quiescence et le sommeil 22,23,24 et le comportement 25. ...

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Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Un protocole optimisé pour la culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits microfabriqués est présenté ici. Cette approche permet de surveiller chaque animal tout au long de sa vie pour une variété de phénotypes liés au vieillissement et à la santé, y compris l’activité, la taille et la forme du corps, la géométrie du mouvement et la survie.

Culture à long terme et surveillance de Caenorhabditis elegans isolés sur des milieux solides dans des dispositifs multipuits

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

Lorsque nous étudions le vieillissement et les elegans de mer, nous suivons généralement une population d’animaux au fil du temps. Cela nous donne un aperçu de ce que le processus que vous étudiez fait dans la population à chaque point temporel, mais cela ne vous dit pas comment le processus change chez les animaux individuels au fil du temps. Ces environnements de culture animale uniques nous permettent de suivre les changements dynamiques dans les processus moléculaires et les processus physiologiques chez les animaux individuels au fil du temps pour des centaines d’animaux en parallèle.Nous constatons qu’il y a deux choses majeures qui peuvent vraiment avoir un impact sur la qualité de ces systèmes de culture multi-puits. L’un est soit sur ou sous séchage des puits et le second est la contamination. Et nous essayons de noter tout au long du protocole des étapes spécifiques où vous pouvez essayer d’atténuer ces problèmes.Emily Gardea fera la démonstration du protocole aujourd’hui. Elle est technicienne dans mon laboratoire et a fait beaucoup de travail pour optimiser ce protocole. Après avoir préparé tous les réactifs, mélanger 60 grammes de base PDMS et six grammes d’agent de durcissement par moule dans un grand bateau jetable à l’aide d’une spatule jetable.Placez le mélange PDMS dans une chambre à vide pendant 30 minutes à moins 0,08 Mega Pascal pour éliminer les bulles. Versez et remplissez le mélange PDMS dans chaque moule imprimé en 3D. Placez le moule rempli et tout mélange PDMS supplémentaire dans la chambre à vide pendant 25 minutes à moins 0,08 Mega Pascal.Retirez le moule rempli de la chambre à vide et faites éclater les bulles restantes avec une spatule jetable. En commençant par un bord, abaissez lentement une feuille d’acrylique plate sur le moule rempli de PDMS. Si la formation de bulles se produit, procédez comme décrit dans le manuscrit.Placez un poids de 2,5 livres sur l’acrylique et placez les moules lestés dans le four. Laissez-les guérir à 55 degrés Celsius pendant la nuit. À la fin de l’incubation, retirez les poids et les moules du four.Ensuite, travaillez une lame de rasoir entre l’acrylique et le PDMS durci Pour briser le joint À l’aide d’un rasoir ou d’une spatule en métal, desserrez soigneusement les côtés du PDMS durci et retirez-les du moule. Enveloppez le dispositif PDMS dans du papier d’aluminium. Scellez-le avec du ruban d’autoclave et stérilisez-le par autoclavage sur un cycle sec pendant au moins 15 minutes à 121 degrés Celsius et 15 livres par pouce carré pression manométrique.Pour préparer le dispositif multipuits, préchauffez un incubateur de bain de perles sèches à 90 degrés Celsius. Déballez un appareil multipuits autoclavé et coupez une petite encoche dans le coin supérieur droit de l’appareil. Placez jusqu’à trois appareils non emballés dans le nettoyeur plasma avec les puits orientés vers le haut et faites fonctionner le nettoyeur plasma.Stérilisez un plateau en polystyrène à puits unique par appareil en pulvérisant l’intérieur du plateau avec de l’éthanol à 70% et en l’essuyant avec une lingette de travail. Retirez chaque appareil du nettoyeur plasma avec une main gantée et placez-le dans un plateau nettoyé. Placez ensuite une bassine à pipette jetable de 25 millilitres dans l’incubateur de bain de perles préchauffé à 90 degrés Celsius.Prenez un tube de prémélange LMNGM solidifié par dispositif à remplir et placez-le dans un bécher en verre de 200 millilitres. Retirer le capuchon et le parafilm et cuire au micro-ondes jusqu’à ce que le média fonde suffisamment pour verser. Versez le prémélange LMNGM fondu dans un autre bécher stérile de 200 millilitres.Plusieurs tubes à essai peuvent être combinés dans ce bécher si plus d’un dispositif est rempli à la fois. Micro-ondes le prémélange LMNGM pendant 20 secondes supplémentaires. Si le prémélange commence à bouillir, arrêtez le micro-ondes et laissez-le se déposer.Retirez le prémélange LMNGM fondu du four à micro-ondes et refroidissez-le à 60 degrés Celsius. Ajouter les ingrédients LMNGM restants au mélange pré-mélangé et verser le LMNGM fondu dans la bassine de 25 millilitres dans le bain de billes. Remplissez les puits de l’appareil à l’aide d’une pipette répétitrice multicanal de 200 microlitres.Réglez le répéteur pour distribuer des aliquotes de 14 microlitres et montez cinq pointes de pipette. Chargez les embouts avec du LMNGM fondu et distribuez les 14 premiers microlitres dans le bassin contenant LMNGM. En se déplaçant rapidement mais prudemment, distribuez 14 microlitres dans les puits intérieurs de l’appareil et redistribuez le LMNGM restant dans le bassin, car l’aliquote finale est généralement inférieure à 14 microlitres.Ensuite, réglez le répéteur pour distribuer des aliquotes de 15 microlitres et remplir l’anneau de puits le plus externe. À l’aide d’une pipette de 200 microlitres, distribuez 200 microlitres de solution de sulfate de cuivre dans le fossé de l’appareil dans chaque coin. Évitez de trop remplir les douves et assurez-vous que le sulfate de cuivre ne touche pas la surface supérieure des puits.Si le sulfate de cuivre ne s’écoule pas facilement dans tout le fossé, utilisez un court pic en fil de platine pour aider à briser la tension et faire glisser le sulfate de cuivre à travers le fossé. Une fois que le sulfate de cuivre a coulé dans tout le fossé, retirez autant de sulfate de cuivre que possible à l’aide d’une pipette de 200 microlitres ou d’une aspiration sous vide. À l’aide d’une bouteille pressée, ajoutez les cristaux d’eau dans les espaces entre l’appareil et les parois du plateau.Fermez le couvercle du plateau et enveloppez les quatre côtés avec un morceau de Parafilm. Ajoutez deux morceaux de Parafilm supplémentaires pour sceller complètement la plaque. À l’aide d’une pipette répétitrice, repérez chaque puits avec cinq microlitres de bactéries concentrées.Éviter tout contact direct avec la surface LMNGM. Séchez les appareils à l’aide d’une boîte de séchage sur mesure qui peut être construite à un coût minime à l’aide de ventilateurs de boîtier d’ordinateur et de filtres HEPA. Dans le cadre d’une portée de dissection, inspecter les puits pour s’assurer que tous les puits ont séché avec succès.À l’aide d’un pic en platine, transférer les animaux des plaques de vers préparées et ajouter un ver par puits. Ajouter une goutte de solution détergente préparée à l’intérieur du couvercle du plateau et frotter avec une lingette de travail jusqu’à ce que la solution de détergent soit sèche. Enveloppez le plateau avec trois morceaux de Parafilm comme décrit dans le manuscrit.L’extension de la durée de vie de daf-2 (ARNi) est bloquée par la mutation nulle daf-16. La durée de vie et la durée de vie ont également diminué en présence de daf-2 (ARNi)La moyenne mobile de l’activité sur trois jours tout au long de la vie est réduite par le mutant daf-16 et le daf-2 (ARNi)La variation de la durée de vie et de la durée de santé entre les animaux individuels par rapport en termes absolus ou en fraction de la durée de vie totale est indiquée. L’activité cumulative tout au long de la vie des animaux individuels correspond mieux à la durée de vie que l’activité des animaux individuels un jour spécifique de la vie.Il est important de remplir les puits et d’ajouter les vers le plus rapidement possible. Sinon, les puits peuvent s’assécher et les vers ne survivront pas. Ce système est compatible avec l’imagerie automatisée qui peut être utilisée pour recueillir des données à haut débit telles que la durée de vie, l’activité et la taille ou la forme du corps.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

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Mesure Caenorhabditis elegans</emDurée de vie> sur des milieux solides

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Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

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