Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da NIH R35GM133588 a G.L.S., un premio catalizzatore della National Academy of Medicine degli Stati Uniti a G.L.S., lo State of Arizona Technology and Research Initiative Fund amministrato dall'Arizona Board of Regents e la Ellison Medical Foundation.

1. Preparazione di soluzioni stock e supporti
NOTA: prima di iniziare la preparazione dei dispositivi multi-pozzetto, preparare le seguenti soluzioni e supporti stock.
<ol><li>Soluzioni stock per terreni di crescita di nematodi (NGM) e NGM a basso punto di fusione (lmNGM):<ol><li>Preparare 1 M K 2 HPO4: aggiungere 174,18 g di K2HPO4 inuna bottiglia da 1 L e riempirla fino a 1 L con acqua deionizzata sterile. Autoclave (121 °C, 15 psig) per 3...

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 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S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

Il sistema WorMotel è un potente strumento per raccogliere dati individualizzati per centinaia di C. elegans isolati nel tempo. A seguito degli studi precedenti che utilizzavano dispositivi multi-pozzetto per applicazioni nella quiescenza dello sviluppo, nel comportamento locomotore e nell'invecchiamento, l'obiettivo di questo lavoro era ottimizzare la preparazione di dispositivi multi-pozzo per il monitoraggio a lungo termine di attività, salute e durata della vita in modo più elevato. Questo lavoro fornisce...

I Caenorhabditis elegans sono comunemente usati negli studi sull'invecchiamento a causa del loro breve tempo di generazione (circa 3 giorni), breve durata della vita (circa 3 settimane), facilità di coltivazione in laboratorio, alto grado di conservazione evolutiva dei processi molecolari e dei percorsi con i mammiferi e ampia disponibilità di tecniche di manipolazione genetica. Nel contesto degli studi sull'invecchiamento, C. elegans consente la rapida generazione di dati sulla longevità e popolazioni invecchiate per l'analisi dei fenotipi in età avanzata negli animali vivi. L'approccio tipico per condurre studi sull'invecchiamento dei vermi prevede la misurazione manuale della durata della vita di una popolazione di vermi mantenuti in gruppi da 20 a 70 animali su terreni di crescita solidi di nematodi agar (NGM) in piastre di Petri da 6 cm1. L'utilizzo di popolazioni sincronizzate per età consente la misurazione della durata della vita o dei fenotipi trasversali nei singoli animali in tutta la popolazione, ma questo metodo preclude il monitoraggio delle caratteristiche dei singoli animali nel tempo. Questo approccio è anche ad alta intensità di manodopera, limitando così le dimensioni della popolazione che può essere testata.
Esistono un numero limitato di metodi di coltura che consentono il monitoraggio longitudinale dei singoli C. elegans per tutta la loro durata di vita, e ognuno ha una serie distinta di vantaggi e svantaggi. I dispositivi microfluidici, tra cui WormFarm2, NemaLife3 e il chip "behavior"4, tra gli altri 5,6,7, consentono il monitoraggio dei singoli animali nel tempo. La coltura di vermi in coltura liquida utilizzando piastre multi-pozzetto consente allo stesso modo il monitoraggio di singoli animali o piccole popolazioni di C. elegans nel tempo 8,9. L'ambiente liquido rappresenta un contesto ambientale distinto dall'ambiente di coltura comune su terreni solidi in piastre di Petri, che può alterare aspetti della fisiologia animale che sono rilevanti per l'invecchiamento, incluso il contenuto di grassi e l'espressione dei geni di risposta allo stress10,11. La capacità di confrontare direttamente questi studi con la maggior parte dei dati raccolti sull'invecchiamento di C. elegans è limitata dalle differenze nelle variabili ambientali potenzialmente importanti. Il Worm Corral12 è un approccio sviluppato per ospitare singoli animali in un ambiente che replica più da vicino la tipica cultura dei media solidi. Il Worm Corral contiene una camera sigillata per ogni animale su un vetrino da microscopio che utilizza idrogel, consentendo il monitoraggio longitudinale di animali isolati. Questo metodo utilizza l'imaging standard in campo chiaro per registrare dati morfologici, come le dimensioni e l'attività del corpo. Tuttavia, gli animali vengono collocati nell'ambiente idrogel come embrioni, dove rimangono indisturbati per tutta la durata della loro vita. Ciò richiede l'uso di background genetici mutanti o transgenici condizionatamente sterili, che limitano sia la capacità di screening genetico, poiché ogni nuova mutazione o transgene deve essere incrociato in uno sfondo con sterilità condizionale, sia la capacità di screening farmacologico, poiché i trattamenti possono essere applicati solo una volta agli animali come embrioni.
Un metodo alternativo sviluppato dal laboratorio Fang-Yen consente la coltivazione di vermi su supporti solidi in singoli pozzetti di un dispositivo microfabbricato in polidimetilsilossano (PDMS) chiamato WorMotel13,14. Ogni dispositivo è posto in un vassoio a pozzetto singolo (cioè con le stesse dimensioni di una piastra a 96 pozzetti) e ha 240 pozzi separati da un fossato riempito con una soluzione avversiva per impedire ai vermi di viaggiare tra i pozzi. Ogni pozzo può ospitare un singolo verme per tutta la durata della sua vita. Il dispositivo è circondato da pellet di gel di poliacrilammide che assorbono l'acqua (denominati "cristalli d'acqua") e il vassoio è sigillato con pellicola da laboratorio Parafilm per mantenere l'umidità e ridurre al minimo l'essiccazione del supporto. Questo sistema consente di raccogliere dati sulla durata della salute e sulla durata della vita per i singoli animali, mentre l'uso di supporti solidi ricapitola meglio l'ambiente vissuto dagli animali nella stragrande maggioranza degli studi pubblicati sulla durata della vita di C. elegans, consentendo così confronti più diretti. Recentemente, una tecnica simile è stata sviluppata utilizzando microvassoi in polistirene originariamente utilizzati per i saggi di microcitotossicità15 al posto del dispositivo PDMS16. Il metodo del microvassoio consente la raccolta di dati individualizzati per i vermi coltivati su terreni solidi e ha migliorato la capacità di contenere i vermi in condizioni che tipicamente causerebbero la fuga (ad esempio, fattori di stress o restrizioni dietetiche), con il compromesso che ogni microvassoio può contenere solo 96 animali16, mentre il dispositivo multi-pozzo utilizzato qui può contenere fino a 240 animali.
Di seguito è presentato un protocollo dettagliato per la preparazione di dispositivi multi-pozzetto ottimizzato per la coerenza da piastra a piastra e la preparazione di più dispositivi in parallelo. Questo protocollo è stato adattato dal protocollo originale del laboratorio Fang-Yen13. In particolare, ci sono descrizioni per le tecniche per ridurre al minimo la contaminazione, ottimizzare l'essiccazione coerente sia dei mezzi solidi che della fonte di cibo batterico e fornire RNAi e farmaci. Questo sistema può essere utilizzato per monitorare la durata della salute individuale, la durata della vita e altri fenotipi, come le dimensioni e la forma del corpo. Questi dispositivi multi-pozzetto sono compatibili con i sistemi esistenti ad alta produttività per misurare la durata della vita, che possono rimuovere gran parte del lavoro manuale coinvolto negli esperimenti tradizionali sulla durata della vita e fornire l'opportunità di misurare la longevità automatizzata e diretta e il monitoraggio della salute nei singoli C. elegans su larga scala.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

Il nematode Caenorhabditis elegans è tra i sistemi modello più comuni utilizzati nella ricerca sull'invecchiamento grazie alle sue tecniche di coltura semplici e poco costose, al ciclo di riproduzione rapido (~ 3 giorni), alla breve durata della vita (~ 3 settimane) e ai numerosi strumenti disponibili per la manipolazione genetica e l'analisi molecolare. L'approccio più comune per condurre studi sull'invecchiamento in C. elegans, compresa l'analisi di sopravvivenza, prevede la coltura di popolazioni da decine a centinaia di animali insieme su terreni di crescita di nematodi solidi (NGM) in piastre di Petri. Mentre questo approccio raccoglie dati su una popolazione di animali, la maggior parte dei protocolli non traccia i singoli animali nel tempo. Presentato qui è un protocollo ottimizzato per la coltura a lungo termine di singoli animali su dispositivi microfabbricati in polidimetilsilossano (PDMS) chiamati WorMotels. Ogni dispositivo consente di coltivare fino a 240 animali in piccoli pozzi contenenti NGM, con ogni pozzo isolato da un fossato contenente solfato di rame che impedisce agli animali di fuggire. Basandosi sulla descrizione originale di WorMotel, questo documento fornisce un protocollo dettagliato per lo stampaggio, la preparazione e il popolamento di ciascun dispositivo, con descrizioni di complicazioni tecniche comuni e consigli per la risoluzione dei problemi. All'interno di questo protocollo ci sono tecniche per il carico costante di piccoli volumi di NGM, l'essiccazione coerente sia dell'NGM che del cibo batterico, opzioni per fornire interventi farmacologici, istruzioni e limitazioni pratiche al riutilizzo dei dispositivi PDMS e suggerimenti per ridurre al minimo l'essiccazione, anche in ambienti a bassa umidità. Questa tecnica consente il monitoraggio longitudinale di vari parametri fisiologici, tra cui attività stimolata, attività non stimolata, dimensioni corporee, geometria del movimento, durata della salute e sopravvivenza, in un ambiente simile alla tecnica standard per la cultura di gruppo su supporti solidi in piastre di Petri. Questo metodo è compatibile con la raccolta di dati ad alto rendimento se utilizzato in combinazione con software di microscopia e analisi automatizzati. Infine, vengono discussi i limiti di questa tecnica, nonché un confronto di questo approccio con un metodo recentemente sviluppato che utilizza microvassoi per coltivare nematodi isolati su supporti solidi.

Il sistema di coltura WorMotel può essere utilizzato per raccogliere una varietà di dati, tra cui la durata della vita, la durata della salute e l'attività. Gli studi pubblicati hanno utilizzato dispositivi multi-pozzo per studiare la durata della vita e la durata della salute 13,14, la quiescenza e il sonno 22,23,24 e il comportamento 25. La d...

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Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per la coltura di singoli nematodi isolati su supporti solidi in dispositivi multipozzetto microfabbricati. Questo approccio consente ai singoli animali di essere monitorati per tutta la vita per una varietà di fenotipi legati all'invecchiamento e alla salute, tra cui attività, dimensioni e forma del corpo, geometria del movimento e sopravvivenza.

Coltura a lungo termine e monitoraggio di Caenorhabditis elegans isolati su terreni solidi in dispositivi multi-pozzetto

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

Quando studiamo l'invecchiamento e gli elegans di mare, in genere seguiamo una popolazione di animali nel tempo. Questo ci dà un'idea di ciò che quel processo che stai studiando sta facendo nella popolazione in ogni punto temporale, ma non ti dice come il processo sta cambiando nei singoli animali nel tempo. Questi singoli ambienti di coltura animale ci consentono di seguire i cambiamenti dinamici nei processi molecolari e nei processi fisiologici nei singoli animali nel tempo per centinaia di animali in parallelo.Scopriamo che ci sono due cose principali che possono davvero avere un impatto sulla qualità di questi sistemi di coltura multi-pozzo. Uno è sopra o sotto l'essiccazione dei pozzi e il secondo è la contaminazione. E cerchiamo di notare in tutto il protocollo passaggi specifici in cui è possibile provare a mitigare questi problemi.A dimostrare il protocollo oggi sarà Emily Gardea. È un tecnico nel mio laboratorio e ha lavorato molto per ottimizzare questo protocollo. Dopo aver preparato tutti i reagenti, mescolare 60 grammi di base PDMS e sei grammi di agente polimerizzante per stampo in una grande barca usa e getta utilizzando una spatola usa e getta.Mettere la miscela PDMS in una camera sottovuoto per 30 minuti a meno 0,08 Mega Pascal per rimuovere le bolle. Versare e riempire la miscela PDMS in ogni stampo stampato in 3D. Mettere lo stampo riempito e l'eventuale miscela PDMS extra nella camera a vuoto per 25 minuti a meno 0,08 Mega Pascal.Rimuovere lo stampo riempito dalla camera a vuoto e far scoppiare eventuali bolle rimanenti con una spatola usa e getta. Partendo da un bordo, abbassare lentamente un foglio acrilico piatto sopra lo stampo riempito PDMS. Se si verifica la formazione di bolle, procedere come descritto nel manoscritto.Posizionare un peso di 2,5 libbre sull'acrilico e posizionare gli stampi ponderati nel forno. Lasciateli curare a 55 gradi Celsius durante la notte. Al termine dell'incubazione, togliere i pesi e gli stampi dal forno.Quindi, lavorare una lama di rasoio tra l'acrilico e il PDMS polimerizzato Per rompere il sigillo Utilizzando un rasoio o una spatola metallica, allentare con cura i lati del PDMS polimerizzato e rimuoverli dallo stampo. Avvolgere il dispositivo PDMS in un foglio di alluminio. Sigillarlo con nastro adesivo e sterilizzare autoclavando su un ciclo a secco per almeno 15 minuti a 121 gradi Celsius e 15 libbre per pollice quadrato di pressione manometrica.Per preparare il dispositivo multi-pozzetto, preriscaldare un incubatore da bagno a perline asciutte a 90 gradi Celsius. Scartare un dispositivo multipozzetto autoclavato e tagliare una piccola tacca nell'angolo in alto a destra del dispositivo. Posizionare fino a tre dispositivi non avvolti nel pulitore al plasma con i pozzetti rivolti verso l'alto ed eseguire il pulitore al plasma.Sterilizzare un singolo vassoio di polistirolo per dispositivo spruzzando l'interno del vassoio con etanolo al 70% e asciugandolo con una salvietta da attività. Rimuovere ciascun dispositivo dal detergente al plasma con una mano guantata e metterlo in un vassoio pulito. Quindi posizionare una bacinella per pipetta monouso da 25 millilitri nell'incubatore da bagno a perline preriscaldato a 90 gradi Celsius.Prendere un tubo di premiscela LMNGM solidificata per dispositivo da riempire e metterlo in un becher di vetro da 200 millilitri. Rimuovere il tappo e il parafilm e il microonde fino a quando il supporto non si scioglie sufficientemente per versare. Versare la premiscela LMNGM fusa in un altro becher sterile da 200 millilitri.È possibile combinare più provette in questo becher se viene riempito più di un dispositivo alla volta. Cuocere a microonde la premiscela LMNGM per altri 20 secondi. Se la premiscela inizia a bollire, fermare il microonde e lasciarlo sedimentare.Rimuovere la premiscela LMNGM fusa dal microonde e raffreddarla a 60 gradi Celsius. Aggiungere i restanti ingredienti LMNGM alla miscela premiscelata e versare il LMNGM fuso nella bacinella da 25 millilitri nel bagno di perline. Riempire i pozzetti del dispositivo utilizzando una pipetta ripetitore multicanale da 200 microlitri.Impostare il ripetitore per erogare aliquote da 14 microlitri e montare cinque punte per pipette. Caricare le punte con LMNGM fuso ed erogare i primi 14 microlitri nel bacino contenente LMNGM. Muovendosi rapidamente ma con attenzione, erogare 14 microlitri nei pozzetti interni del dispositivo e rifornire il rimanente LMNGM nel bacino poiché l'aliquota finale è in genere inferiore a 14 microlitri.Quindi, impostare il ripetitore per erogare aliquote di 15 microlitri e riempire l'anello più esterno dei pozzi. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, erogare 200 microlitri di soluzione di solfato di rame nel fossato del dispositivo in ogni angolo. Evitare di riempire eccessivamente il fossato e assicurarsi che il solfato di rame non tocchi la superficie superiore dei pozzi.Se il solfato di rame non scorre facilmente attraverso l'intero fossato, utilizzare un corto filo di platino per aiutare a rompere la tensione e trascinare il solfato di rame attraverso il fossato. Dopo che il solfato di rame ha attraversato l'intero fossato, rimuovere quanto più solfato di rame possibile utilizzando una pipetta da 200 microlitri o un'aspirazione con un vuoto. Utilizzando una bottiglia di spremitura, aggiungere i cristalli d'acqua negli spazi tra il dispositivo e le pareti del vassoio.Chiudere il coperchio del vassoio e avvolgere tutti e quattro i lati con un pezzo di Parafilm. Aggiungere altri due pezzi di parafilm per sigillare completamente la piastra. Utilizzando una pipetta ripetitrice, individuare ogni pozzetto con cinque microlitri di batteri concentrati.Evitare il contatto diretto con la superficie LMNGM. Asciugare i dispositivi utilizzando una scatola di asciugatura personalizzata che può essere costruita a costi minimi utilizzando ventole per case per computer e filtri HEPA. Sotto un ambito di dissezione, ispezionare i pozzi per assicurarsi che tutti i pozzi si siano asciugati correttamente.Usando un plettro di platino, trasferire gli animali dalle piastre di verme preparate e aggiungere un verme per pozzetto. Aggiungere una goccia di soluzione detergente preparata all'interno del coperchio del vassoio e strofinare con una salvietta fino a quando la soluzione detergente non si è asciugata. Avvolgere il vassoio con tre pezzi di Parafilm come descritto nel manoscritto.Il prolungamento della durata della vita da daf-2 (RNAi) è bloccato dalla mutazione nulla daf-16. La durata della salute è diminuita anche in presenza di daf-2 (RNAi)La media mobile di tre giorni di attività nel corso della vita è ridotta dal mutante daf-16 e dal daf-2 (RNAi)Viene mostrata la variazione della durata della vita e della durata della salute tra i singoli animali confrontata in termini assoluti o come frazione della durata totale della vita. L'attività cumulativa nel corso della vita dei singoli animali è correlata meglio con la durata della vita rispetto all'attività per i singoli animali in un giorno specifico per tutta la durata della vita.È importante riempire i pozzetti e aggiungere i vermi il più rapidamente possibile. Altrimenti i pozzi possono asciugarsi e i vermi non sopravviveranno. Questo sistema è compatibile con l'imaging automatizzato che può essere utilizzato per raccogliere dati ad alta produttività come durata della vita, attività e dimensioni o forma del corpo.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

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Misura Caenorhabditis elegans Life Span su terreni solidi

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

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