Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

この研究は、NIH R35GM133588からG.L.S.、米国医学アカデミー触媒賞、アリゾナ州理事会が管理するアリゾナ州技術研究イニシアチブ基金、およびエリソン医学財団によってサポートされました。

1.原液および培地の調製
注意: マルチウェルデバイスの準備を開始する前に、次のストック溶液と培地を準備してください。
<ol><li>線虫増殖培地(NGM)および低メルトNGM(lmNGM)用のストックソリューション:<ol><li>1 M K 2 HPO 4の準備:1 Lボトルに174.18 gのK2HPO4を加え、滅菌脱イオン水で1 Lまで満たします。オートクレーブ(121°C、15psig)で30分間?...

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Freitas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm+Paparazzi+-+A+high+throughput+lifespan+and+healthspan+analysis+platform+for+individual+Caenorhabditis+elegans.">Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans.</a> University of Arizona. , (2021).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+High-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

WorMotelシステムは、何百もの孤立した C.エレガンスの 個別化されたデータを経時的に収集するための強力なツールです。発生停止、運動行動、および老化のアプリケーションにマルチウェルデバイスを使用した以前の研究に続いて、この作業の目標は、活動、健康、および寿命をより高いスループットの方法で長期間監視するためのマルチウェルデバイスの準備を最適化することでし?...

Caenorhabditis elegans は、その短い世代時間(約3日)、短い寿命(約3週間)、実験室での培養の容易さ、哺乳類との分子プロセスと経路の高度な進化的保存、および遺伝子操作技術の幅広い利用可能性のために、老化研究で一般的に使用されます。老化研究の文脈では、 C.エレガンスは 、生きている動物の晩年の表現型の分析のために、長寿データと高齢者集団の迅速な生成を可能にします。ワーム老化研究を実施するための典型的なアプローチは、6cmペトリプレート内の固体寒天線虫増殖培地(NGM)上で20〜70匹の動物のグループで維持されているワームの集団の寿命を手動で測定することを含む1。年齢同期集団を使用すると、集団全体の個々の動物の寿命または断面表現型を測定できますが、この方法では、個々の動物の特性を経時的に監視することはできません。このアプローチも労働集約的であるため、テストできる母集団のサイズが制限されます。
個々のC.エレガンスの寿命を通して縦断的にモニタリングできる培養方法は限られており、それぞれに異なる長所と短所があります。WormFarm2、NemaLife3、および「挙動」チップ4、とりわけ5,6,7を含むマイクロ流体デバイスは、個々の動物の経時的なモニタリングを可能にする。マルチウェルプレートを使用して液体培養でワームを培養することも同様に、個々の動物またはC.エレガンスの小さな集団のいずれかを経時的にモニタリングすることを可能にします8,9。液体環境は、ペトリプレートの固体培地上の一般的な培養環境とは異なる環境状況を表しており、脂肪含有量やストレス応答遺伝子の発現など、老化に関連する動物生理学の側面を変える可能性があります10,11。これらの研究を、老化したC.エレガンスについて収集されたデータの大部分と直接比較する能力は、潜在的に重要な環境変数の違いによって制限されます。Worm Corral12は、典型的な固体培地培養をより厳密に再現する環境で個々の動物を収容するために開発された1つのアプローチです。Worm Corralには、ヒドロゲルを使用した顕微鏡スライド上に各動物用の密閉チャンバーが含まれており、孤立した動物の縦方向のモニタリングが可能です。この方法では、標準的な明視野イメージングを使用して、体のサイズや活動などの形態学的データを記録します。しかしながら、動物は胚としてヒドロゲル環境に置かれ、そこでそれらは生涯を通じて邪魔されないままである。これには、条件付き無菌変異体またはトランスジェニック遺伝的背景の使用が必要であり、各新規変異または導入遺伝子を条件付き不妊でバックグラウンドに交配する必要があるため、遺伝子スクリーニングの能力と、治療は胚として動物に一度しか適用できないため、薬物スクリーニングの能力の両方が制限されます。
Fang-Yenラボによって開発された代替方法は、WorMotel13,14と呼ばれる微細加工ポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイスの個々のウェル内の固体培地上でワームを培養することを可能にする。各デバイスは、単一ウェルトレイ(すなわち、96ウェルプレートと同じ寸法)に配置され、ワームがウェル間を移動するのを防ぐために、嫌悪溶液で満たされた堀によって分離された240ウェルを有する。各ウェルは、その寿命の間、単一のワームを収容することができます。デバイスは吸水性ポリアクリルアミドゲルペレット(「水結晶」と呼ばれる)に囲まれており、トレイは湿度を維持し、メディアの乾燥を最小限に抑えるためにParafilmラボフィルムで密封されています。このシステムにより、個々の動物の健康寿命と寿命のデータを収集できますが、固体培地を使用すると、公開されたC.エレガンスの寿命研究の大部分で動物が経験した環境をよりよく再現できるため、より直接的な比較が可能になります。最近、PDMSデバイス16の代わりに、微小細胞毒性アッセイ15に元々使用されていたポリスチレンマイクロトレイを使用して同様の技術が開発された。マイクロトレイ法は、固体培地上で培養されたワームの個別化されたデータの収集を可能にし、典型的には逃げを引き起こす条件(例えば、ストレッサーまたは食事制限)の下でワームを収容する能力が向上し、トレードオフは、各マイクロトレイが96匹の動物しか収容できないというトレードオフである16、ここで使用されるマルチウェル装置は最大240匹の動物を収容することができる。
ここでは、プレート間の一貫性と複数のデバイスの並列調製に最適化されたマルチウェルデバイスを調製するための詳細なプロトコルを示します。このプロトコルは、Fang-Yen研究所13の元のプロトコルから採用されました。具体的には、汚染を最小限に抑え、固体培地と細菌の食物源の両方の一貫した乾燥を最適化し、RNAiと薬物を送達する技術の説明があります。このシステムは、個人の健康寿命、寿命、および体のサイズや形状などの他の表現型を追跡するために使用できます。これらのマルチウェルデバイスは、寿命を測定するための既存のハイスループットシステムと互換性があり、従来の寿命実験に伴う手作業の多くを排除し、個々の C.エレガンス における自動化された直接的な寿命測定と健康追跡の機会を大規模に提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

線虫 Caenorhabditis elegansは 、そのシンプルで安価な培養技術、迅速な繁殖サイクル(~3日)、短い寿命(~3週間)、および遺伝子操作と分子分析のための多数の利用可能なツールにより、老化研究で使用される最も一般的なモデルシステムの1つです。生存分析を含む C.エレガンスの老化研究を実施するための最も一般的なアプローチは、ペトリプレートの固体線虫増殖培地(NGM)上で数十〜数百匹の動物の集団を一緒に培養することです。このアプローチは動物の集団に関するデータを収集しますが、ほとんどのプロトコルは個々の動物を経時的に追跡しません。ここでは、WorMotelsと呼ばれる微細加工ポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイスで個々の動物を長期間培養するための最適化されたプロトコルを紹介します。各装置では、NGMを含む小さなウェルで最大240匹の動物を培養でき、各ウェルは硫酸銅を含む堀で分離され、動物が逃げるのを防ぎます。このホワイト ペーパーでは、元の WorMotel の説明に基づいて、各デバイスの成形、準備、および装着に関する詳細なプロトコルを提供し、一般的な技術的問題の説明とトラブルシューティングのアドバイスを提供します。このプロトコルには、少量のNGMの一貫した負荷、NGMと細菌性食品の両方の一貫した乾燥、薬理学的介入を提供するためのオプション、PDMSデバイスの再利用に関する指示と実際的な制限、および低湿度環境でも乾燥を最小限に抑えるためのヒントがあります。この技術により、ペトリプレートの固体培地での集団培養の標準的な技術と同様の環境で、刺激された活動、刺激されていない活動、体のサイズ、運動形状、健康寿命、生存など、さまざまな生理学的パラメーターの縦断的モニタリングが可能になります。この方法は、自動顕微鏡および分析ソフトウェアと組み合わせて使用 すると、ハイスループットデータ収集と互換性があります。最後に、この技術の限界、およびマイクロトレイを使用して単離された線虫を固体培地上で培養する最近開発された方法とのこのアプローチの比較について説明します。

WorMotel培養システムを使用して、寿命、健康寿命、活動など、さまざまなデータを収集できます。発表された研究では、寿命と健康寿命13,14、静止と睡眠22,23,24、および行動25を研究するためにマルチウェルデバイスを利用しています。寿命は、手動で、または?...

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Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

ここには、微細加工されたマルチウェルデバイスの固体培地上で単離された個々の線虫を培養するための最適化されたプロトコルが提示されます。このアプローチにより、個々の動物を生涯を通じて監視して、活動、体のサイズと形状、運動の形状、生存など、老化と健康に関連するさまざまな表現型を確認できます。

マルチウェルデバイスの固体培地上での単離 されたカエノラブディティスエレガンスの 長期培養とモニタリング

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

私たちが老化と海のエレガンスを研究しているとき、私たちは通常、時間の経過に伴う動物の集団を追跡しています。これにより、あなたが研究しているプロセスが各時点で集団で何をしているのかを垣間見ることができますが、個々の動物でプロセスが時間の経過とともにどのように変化しているかはわかりません。これらの単一動物培養環境により、数百匹の動物について、個々の動物の分子プロセスと生理学的プロセスの動的な変化を経時的に追跡することができます。これらのマルチウェル培養システムの品質に大きく影響する可能性のある2つの主要な要因があることがわかりました。1つはウェルの乾燥が過剰または不足しており、もう1つは汚染です。また、プロトコル全体を通して、これらの問題を軽減することができる特定の手順に注意するように努めています。今日のプロトコルのデモンストレーションはエミリーガルデアです。彼女は私の研究室の技術者であり、このプロトコルを最適化するために多くの作業を行ってきました。すべての試薬を調製した後、使い捨てヘラを使用して、型ごとに60グラムのPDMSベースと6グラムの硬化剤を大型の使い捨てウェイボートで混合します。PDMS混合物をマイナス0.08メガパスカルで30分間真空チャンバーに入れて気泡を除去します。PDMS混合物を各3Dプリントされた型に注ぎ、充填します。充填した金型と余分なPDMS混合物を真空チャンバーにマイナス0.08メガパスカルで25分間入れます。充填された型を真空チャンバーから取り出し、使い捨てヘラで残りの気泡をポップします。一方の端から始めて、PDMSで満たされた金型の上に平らなアクリルシートをゆっくりと下げます。気泡形成が生じた場合は、原稿に記載のように進行する。アクリルに2.5ポンドの重りを置き、加重型をオーブンに入れます。摂氏55度で一晩硬化させます。インキュベーションの終わりに、オーブンから重りと型を取り除きます。次に、アクリルと硬化PDMSの間にかみそりの刃を動かしてシールを破りますかみそりまたは金属ヘラを使用して、硬化したPDMSの側面を慎重に緩め、金型から取り外します。PDMSデバイスをアルミホイルで包みます。オートクレーブテープで密封し、摂氏121度、ゲージ圧15ポンド/平方インチで少なくとも15分間、ドライサイクルでオートクレーブ滅菌します。マルチウェル装置を準備するには、ドライビーズバスインキュベーターを摂氏90度に予熱します。オートクレーブ滅菌したマルチウェルデバイスの開梱を行い、デバイスの右上隅にある小さな切り込みを切ります。ウェルを上に向けて、最大3つの包装されていないデバイスをプラズマクリーナーに入れ、プラズマクリーナーを実行します。トレイの内側に70%エタノールをスプレーし、タスクワイプで拭いて乾かすことにより、デバイスごとに1つのウェルポリスチレントレイを滅菌します。手袋をはめた手でプラズマクリーナーから各デバイスを取り出し、クリーニングしたトレイに置きます。次に、摂氏90度に予熱したビーズバスインキュベーターに25ミリリットルの使い捨てピペット洗面器を置きます。充填するデバイスごとに固化したLMNGMプレ混合物のチューブを1本取り、200ミリリットルのガラスビーカーに入れます。メディアが注ぐのに十分溶けるまで、キャップとパラフィルムと電子レンジを取り外します。溶融LMNGMプレ混合物を別の滅菌200ミリリットルビーカーに注ぎます。一度に複数のデバイスが充填されている場合、このビーカーに複数の試験管を組み合わせることができます。LMNGMプレ混合物をさらに20秒間電子レンジで加熱します。予備混合物が沸騰し始めたら、電子レンジを停止し、落ち着かせます。溶融LMNGMプレ混合物を電子レンジから取り出し、摂氏60度に冷却します。残りのLMNGM成分をプレミックス混合物に加え、溶融LMNGMをビーズバスの25ミリリットルの洗面器に注ぎます。200マイクロリットルのマルチチャンネルリピーターピペットを使用してデバイスウェルを満たします。14マイクロリットルの分注液にリピーターを設定し、5つのピペットチップを取り付けます。チップに溶融LMNGMをロードし、最初の14マイクロリットルをLMNGMを含む洗面器に戻します。迅速かつ慎重に移動し、14マイクロリットルをデバイスの内側のウェルに分注し、最終的な分注液は通常14マイクロリットル未満であるため、残りのLMNGMを洗面器に戻します。次に、15マイクロリットルのアリコートを分注し、ウェルの最も外側のリングを満たすようにリピーターを設定します。200マイクロリットルのピペットを使用して、200マイクロリットルの硫酸銅溶液を各コーナーのデバイスの堀に分注します。堀をいっぱいにしないようにし、硫酸銅が井戸の上面に触れないようにしてください。硫酸銅が堀全体を簡単に流れない場合は、短いプラチナワイヤーピックを使用して張力を破り、硫酸銅を堀に引きずり込みます。硫酸銅が堀全体を流れた後、200マイクロリットルのピペットまたは真空吸引を使用してできるだけ多くの硫酸銅を取り除きます。スクイーズボトルを使用して、デバイスとトレイの壁の間のスペースに水の結晶を追加します。トレイの蓋を閉め、パラフィルムで四方を包みます。パラフィルムピースを2つ追加して、プレートを完全に密閉します。リピーターピペットを使用して、各ウェルに5マイクロリットルの濃縮細菌を見つけます。LMNGM表面との直接接触を避けてください。コンピュータケースファンとHEPAフィルターを使用して最小限のコストで構築できるカスタムメイドの乾燥ボックスを使用してデバイスを乾燥させます。解剖スコープで、ウェルを検査して、すべてのウェルが正常に乾燥していることを確認します。プラチナピックを使用して、準備したワームプレートから動物を移し、ウェルごとに1つのワームを追加します。準備した洗剤溶液をトレイの蓋の内側に一滴加え、洗剤溶液が乾くまでタスクワイプでこすります。原稿に記載されているように、トレイを3枚のパラフィルムで包みます。daf-2(RNAi)からの寿命延長は、daf-16ヌル変異によってブロックされます。daf-2(RNAi)の存在下でも健康寿命が減少した生涯にわたる活動の3日間の移動平均は、daf-16変異体とdaf-2(RNAi)絶対値または全寿命の一部と比較した個々の動物間の寿命と健康寿命の変動が示されています。個々の動物の生涯にわたる累積活動は、寿命全体の特定の日の個々の動物の活動よりも寿命とよく相関しています。ウェルをいっぱいにし、ワームをできるだけ早く追加することが重要です。そうしないと、井戸が乾燥し、ワームが生き残れなくなる可能性があります。このシステムは、寿命、活動、体のサイズや形状などの高スループットデータを収集するために使用できる自動イメージングと互換性があります。

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

計測線虫（Caenorhabditis elegans）</em固体培地上>寿命

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

固体プレートベースの食餌制限線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

光学投影トモグラフィを用いたヒト乳癌検体とその分析の長期培養

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

におけるプロスタグランジンの抽出と分析<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

培養<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em &gt;微小粒子衝撃による無菌液体培地およびトランスジェニックワームの作成に

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

成人マウスおよびラット心筋細胞の分離、トランスフェクション、長期培養

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

刺激されたラマン散乱顕微鏡を用いた カエノラム型エレガンス における脂質蓄積ダイナミクスの無標識イメージング

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

マルチウェルデバイスの固体培地上での単離 されたカエノラブディティスエレガンスの 長期培養とモニタリング

マルチウェルデバイスの固体培地上での単離されたカエノラブディティスエレガンスの長期培養とモニタリング