Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

이 작업은 NIH R35GM133588에서 GLS로, GLS에 대한 미국 국립 의학 아카데미 촉매 상, 애리조나 이사회에서 관리하는 애리조나 주 기술 및 연구 이니셔티브 기금 및 Ellison Medical Foundation의 지원을 받았습니다.

1. 원액 및 배지 준비
알림: 멀티웰 장치 준비를 시작하기 전에 다음 스톡 용액과 매체를 준비하십시오.
<ol><li>선충 성장 배지(NGM) 및 저융점 NGM(lmNGM)을 위한 스톡 솔루션:<ol><li>1 M K 2 HPO4 준비: 1 L 병에 174.18 g의 K2HPO4를 첨가하고, 멸균 탈이온수로 1 L까지 채운다. 오토클레이브(121°C, 15psig)에서 30분 동안 보관하고 실온(RT)에서 보관합니다.</l...

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Freitas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm+Paparazzi+-+A+high+throughput+lifespan+and+healthspan+analysis+platform+for+individual+Caenorhabditis+elegans.">Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans.</a> University of Arizona. , (2021).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+High-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

WorMotel 시스템은 시간이 지남에 따라 수백 개의 고립된 예쁜꼬마선충 에 대한 개별화된 데이터를 수집하기 위한 강력한 도구입니다. 발달 정지, 운동 행동 및 노화 응용 분야에 다중 웰 장치를 사용한 초기 연구에 이어 이 작업의 목표는 더 높은 처리량 방식으로 활동, 건강 및 수명을 장기간 모니터링하기 위한 다중 웰 장치의 준비를 최적화하는 것이었습니다. 이 작업은 원래의 프로토콜(<s...

예쁜꼬마선충은 짧은 생성 시간(약 3일), 짧은 수명(약 3주), 실험실에서의 재배 용이성, 포유류와의 분자 과정 및 경로의 높은 수준의 진화적 보존, 유전자 조작 기술의 광범위한 가용성으로 인해 노화 연구에 일반적으로 사용됩니다. 노화 연구의 맥락에서 C. elegans 는 살아있는 동물의 노년기 표현형 분석을 위해 수명 데이터와 노인 인구의 빠른 생성을 허용합니다. 웜 노화 연구를 수행하기 위한 일반적인 접근 방식은 6cm 페트리 플레이트의 고체 한천 선충 성장 배지(NGM)에서 20-70마리의 동물 그룹으로 유지되는 웜 개체군의 수명을 수동으로 측정하는 것입니다1. 연령 동기화 개체군을 사용하면 개체군 전체에 걸쳐 개별 동물의 수명 또는 단면 표현형을 측정할 수 있지만 이 방법은 시간 경과에 따른 개별 동물의 특성을 모니터링하는 것을 배제합니다. 이 접근 방식은 또한 노동 집약적이므로 테스트할 수 있는 모집단의 크기를 제한합니다.
일생 동안 개별 예쁜꼬마선충의 종단적 모니터링을 허용하는 배양 방법은 제한되어 있으며 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다. WormFarm2, NemaLife3 및 "행동" 칩4(5,6,7)을 포함한 미세 유체 장치를 사용하면 시간 경과에 따른 개별 동물을 모니터링할 수 있습니다. 다중 웰 플레이트를 사용하여 액체 배양에서 벌레를 배양하는 것은 시간이 지남에 따라 개별 동물 또는 작은 개체군의 모니터링을 가능하게 합니다 8,9. 액체 환경은 지방 함량 및 스트레스 반응 유전자10,11의 발현을 포함하여 노화와 관련된 동물 생리학의 측면을 변경할 수 있는 페트리 플레이트의 고체 배지에 대한 일반적인 배양 환경과 구별되는 환경적 맥락을 나타냅니다. 이러한 연구를 노화 예쁜꼬마선충에 대해 수집된 대부분의 데이터와 직접 비교할 수 있는 능력은 잠재적으로 중요한 환경 변수의 차이로 인해 제한됩니다. Worm Corral12는 전형적인 고체 미디어 문화를보다 밀접하게 복제하는 환경에 개별 동물을 수용하기 위해 개발 된 한 가지 접근 방식입니다. Worm Corral에는 하이드로겔을 사용하는 현미경 슬라이드에 각 동물을 위한 밀폐된 챔버가 포함되어 있어 분리된 동물의 종단 모니터링이 가능합니다. 이 방법은 표준 명시야 이미징을 사용하여 신체 크기 및 활동과 같은 형태학적 데이터를 기록합니다. 그러나 동물은 배아로 하이드로겔 환경에 배치되어 평생 동안 방해받지 않습니다. 이를 위해서는 조건부 무균 돌연변이 또는 형질전환 유전자 배경의 사용이 필요하며, 이는 각각의 새로운 돌연변이 또는 이식 유전자가 조건부 불임의 배경으로 교차되어야 하기 때문에 유전자 스크리닝 능력과 치료가 배아로서 동물에게 한 번만 적용될 수 있기 때문에 약물 스크리닝 능력을 모두 제한합니다.
Fang-Yen 연구실에서 개발한 대체 방법은 WorMotel13,14라고 하는 미세 가공된 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치의 개별 웰에 있는 고체 배지에서 벌레를 배양할 수 있습니다. 각 장치는 단일 웰 트레이(즉, 96웰 플레이트와 동일한 치수)에 배치되고 웜이 웰 사이를 이동하는 것을 방지하기 위해 혐오 용액으로 채워진 해자로 분리된 240개의 웰이 있습니다. 각 우물은 수명 동안 단일 웜을 수용 할 수 있습니다. 이 장치는 수분 흡수 폴리아크릴아미드 겔 펠릿("물 결정"이라고 함)으로 둘러싸여 있으며 트레이는 습도를 유지하고 매체의 건조를 최소화하기 위해 Parafilm 실험실 필름으로 밀봉되어 있습니다. 이 시스템을 사용하면 개별 동물에 대한 건강 수명 및 수명 데이터를 수집할 수 있으며, 고체 매체를 사용하면 출판된 대부분의 예쁜꼬마선충 수명 연구에서 동물이 경험한 환경을 더 잘 요약하여 보다 직접적인 비교가 가능합니다. 최근에, PDMS 장치(16) 대신에 원래 미세세포독성 분석(15)에 사용되었던 폴리스티렌 마이크로트레이를 사용하여 유사한 기술이 개발되었다. 마이크로트레이 방법은 고체 배지 상에서 배양된 웜에 대한 개별화된 데이터의 수집을 허용하고, 전형적으로 도피를 유발하는 조건(예를 들어, 스트레스 요인 또는 식이 제한) 하에서 웜을 함유하는 능력을 향상시켰으며, 각 마이크로트레이는 96마리의 동물만 포함할 수 있는 반면(16), 여기서 활용되는 멀티웰 장치는 최대 240마리의 동물을 포함할 수 있다.
여기에 제시된 것은 플레이트 간 일관성 및 여러 장치의 병렬적 준비에 최적화된 멀티웰 장치를 준비하기 위한 자세한 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 Fang-Yen 실험실13의 원래 프로토콜에서 채택되었습니다. 특히, 오염을 최소화하고, 고체 배지와 박테리아 식품 공급원 모두의 일관된 건조를 최적화하고, RNAi 및 약물을 전달하는 기술에 대한 설명이 있습니다. 이 시스템은 개인의 건강 수명, 수명 및 신체 크기 및 모양과 같은 기타 표현형을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 멀티웰 장치는 기존의 고처리량 시스템과 호환되어 수명을 측정할 수 있으며, 이를 통해 기존 수명 실험과 관련된 많은 수작업을 제거하고 대규모로 개별 예쁜꼬마선충의 자동화된 직접 수명 측정 및 건강 추적 기회를 제공할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

선충류 Caenorhabditis elegans 는 간단하고 저렴한 배양 기술, 빠른 번식 주기(~3일), 짧은 수명(~3주), 유전자 조작 및 분자 분석을 위한 수많은 도구로 인해 노화 연구에 사용되는 가장 일반적인 모델 시스템 중 하나입니다. 생존 분석을 포함하여 예쁜꼬마선충에서 노화 연구를 수행하는 가장 일반적인 접근 방식은 페트리 플레이트의 고체 선충 성장 배지(NGM)에서 수십에서 수백 마리의 동물 개체군을 함께 배양하는 것입니다. 이 접근 방식은 동물 개체군에 대한 데이터를 수집하지만 대부분의 프로토콜은 시간이 지남에 따라 개별 동물을 추적하지 않습니다. 여기에 제시된 것은 WorMotels라고 하는 미세 가공 폴리디메틸실록산(PDMS) 장치에서 개별 동물을 장기간 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 각 장치는 NGM이 포함된 작은 우물에서 최대 240마리의 동물을 배양할 수 있으며, 각 우물은 동물이 도망치는 것을 방지하는 황산구리 함유 해자로 격리됩니다. 원래 WorMotel 설명을 기반으로 하는 이 백서는 일반적인 기술적 복잡성에 대한 설명과 문제 해결을 위한 조언과 함께 각 장치의 성형, 준비 및 채우기에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 소량 NGM의 일관된 로딩을 위한 기술, NGM과 박테리아 식품의 일관된 건조, 약리학적 개입을 제공하기 위한 옵션, PDMS 장치 재사용에 대한 지침 및 실질적인 제한, 습도가 낮은 환경에서도 건조를 최소화하기 위한 팁이 있습니다. 이 기술을 사용하면 페트리 플레이트의 고체 배지에서 그룹 배양을 위한 표준 기술과 유사한 환경에서 자극된 활동, 자극되지 않은 활동, 신체 크기, 움직임 기하학, 건강 범위 및 생존을 포함한 다양한 생리학적 매개변수의 종단 모니터링이 가능합니다. 이 방법은 자동화된 현미경 및 분석 소프트웨어와 함께 사용할 때 고처리량 데이터 수집과 호환됩니다. 마지막으로, 이 기술의 한계에 대해 논의하고 이 접근 방식을 마이크로트레이를 사용하여 고체 배지에서 분리된 선충을 배양하는 최근에 개발된 방법과 비교합니다.

WorMotel 배양 시스템은 수명, 건강 수명 및 활동과 관련된 다양한 데이터를 수집하는 데 사용할 수 있습니다. 발표된 연구에서는 다중 웰 장치를 사용하여 수명과 건강 기간 13,14, 정지 및 수면 22,23,24, 행동 25를 연구했습니다. 수명은 수동으로 또는 이미지 수집 및 다...

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Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

여기에 제시된 것은 미세 가공된 멀티웰 장치의 고체 배지에서 분리된 개별 선충을 배양하기 위한 최적화된 프로토콜입니다. 이 접근 방식을 통해 활동, 신체 크기 및 모양, 움직임 기하학 및 생존을 포함하여 노화 및 건강과 관련된 다양한 표현형에 대해 개별 동물을 평생 동안 모니터링할 수 있습니다.

Multi-well 장치의 고체 배지에서 분리된 Caenorhabditis elegans의 장기 배양 및 모니터링Long-term culture and monitoring of isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-well devices

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

노화와 예쁜꼬마선충을 연구할 때 우리는 일반적으로 시간이 지남에 따라 동물 개체군을 추적합니다. 이것은 당신이 연구하고 있는 그 과정이 각 시점에서 개체군에서 무엇을 하고 있는지 엿볼 수 있게 해주지만 시간이 지남에 따라 개별 동물에서 그 과정이 어떻게 변하고 있는지는 알려주지 않습니다. 이러한 단일 동물 배양 환경을 통해 우리는 수백 마리의 동물에 대해 시간이 지남에 따라 개별 동물의 분자 과정과 생리적 과정의 역동적인 변화를 동시에 추적할 수 있습니다.우리는 이러한 다중 우물 배양 시스템의 품질에 실제로 영향을 미칠 수 있는 두 가지 주요 사항이 있음을 발견했습니다. 하나는 우물을 건조시키는 것 이상이거나 건조하는 것이고 두 번째는 오염입니다. 그리고 프로토콜 전반에 걸쳐 이러한 문제를 완화할 수 있는 특정 단계를 기록하려고 합니다.오늘 프로토콜을 시연하는 것은 Emily Gardea가 될 것입니다. 그녀는 내 연구실의 기술자이며 이 프로토콜을 최적화하기 위해 많은 작업을 수행했습니다. 모든 시약을 준비한 후, 일회용 주걱을 사용하여 대형 일회용 보트에 금형 당 60 그램의 PDMS 염기와 6 그램의 경화제를 혼합한다.PDMS 혼합물을 마이너스 0.08메가파스칼의 진공 챔버에 30분 동안 넣어 기포를 제거합니다. PDMS 혼합물을 각 3D 프린팅 몰드에 붓고 채웁니다. 채워진 몰드와 여분의 PDMS 혼합물을 진공 챔버에 마이너스 0.08메가파스칼로 25분 동안 넣습니다.진공 챔버에서 채워진 몰드를 제거하고 일회용 주걱으로 남아 있는 기포를 터뜨립니다. 한쪽 가장자리부터 시작하여 PDMS로 채워진 금형 위에 평평한 아크릴 시트를 천천히 내립니다. 기포 형성이 발생하면 원고에 설명 된대로 진행하십시오.아크릴에 2.5파운드의 추를 놓고 무게가 있는 틀을 오븐에 넣습니다. 하룻밤 동안 섭씨 55도에서 경화시키십시오. 배양이 끝나면 오븐에서 추와 틀을 제거합니다.다음으로 아크릴과 경화된 PDMS 사이에 면도날을 끼우십시오 봉인을 깨려면 면도기 또는 금속 주걱을 사용하여 경화된 PDMS의 측면을 조심스럽게 풀고 금형에서 제거합니다. PDMS 장치를 알루미늄 호일로 감쌉니다. 오토클레이브 테이프로 밀봉하고 섭씨 15도 및 제곱인치당 121파운드 게이지 압력에서 최소 15분 동안 건조 주기로 오토클레이빙하여 멸균합니다.멀티웰 장치를 준비하기 위해, 건식 비드 배스 인큐베이터를 섭씨 90도로 예열한다. 오토클레이브 멀티웰 장치의 포장을 풀고 장치의 오른쪽 상단 모서리에 있는 작은 홈을 자릅니다. 웰이 위를 향하도록 하여 최대 3개의 포장을 뜯지 않은 장치를 플라즈마 클리너에 넣고 플라즈마 클리너를 실행합니다.트레이 내부에 70% 에탄올을 뿌리고 작업 물티슈로 닦아서 장치당 하나의 웰 폴리스티렌 트레이를 소독합니다. 장갑을 낀 손으로 플라즈마 클리너에서 각 장치를 제거하고 깨끗한 트레이에 넣습니다. 그런 다음 섭씨 90도로 예열된 비드 배스 인큐베이터에 25밀리리터의 일회용 피펫 대야를 놓습니다.장치당 응고된 LMNGM 예비 혼합물 튜브 하나를 채울 수 있도록 200밀리리터 유리 비커에 넣습니다. 캡과 파라필름을 제거하고 미디어가 부어질 만큼 충분히 녹을 때까지 전자레인지에 돌립니다. 용융된 LMNGM 예비 혼합물을 다른 멸균된 200밀리리터 비커에 붓습니다.한 번에 두 개 이상의 장치를 채우는 경우 이 비커에 여러 테스트 튜브를 결합할 수 있습니다. LMNGM 사전 혼합물을 추가로 20초 동안 전자레인지에 돌립니다. 미리 혼합물이 끓기 시작하면 전자레인지를 멈추고 가라앉히십시오.용융된 LMNGM 예비 혼합물을 전자레인지에서 꺼내 섭씨 60도까지 식힙니다. 나머지 LMNGM 성분을 사전 혼합물에 첨가하고 용융된 LMNGM을 비드 배스의 25밀리리터 분지에 붓습니다. 200마이크로리터 다중 채널 리피터 피펫을 사용하여 장치 웰을 채웁니다.리피터가 14마이크로리터의 분취량을 분배하고 5개의 피펫 팁을 장착하도록 설정합니다. 용융된 LMNGM으로 팁을 로드하고 처음 14마이크로리터를 LMNGM 포함 수조에 다시 분배합니다. 빠르지만 조심스럽게 움직여 14마이크로리터를 장치의 내부 웰에 분배하고 나머지 LMNGM을 최종 분취량이 일반적으로 14마이크로리터 미만이므로 수조에 다시 분배합니다.다음으로, 15마이크로리터의 분취량을 분배하고 웰의 가장 바깥쪽 링을 채우도록 리피터를 설정합니다. 200마이크로리터 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 황산구리 용액을 각 모서리의 장치 해자에 분배합니다. 해자를 과도하게 채우지 말고 황산구리가 우물의 상단 표면에 닿지 않도록하십시오.황산구리가 전체 해자를 통해 쉽게 흐르지 않으면 짧은 백금 와이어 픽을 사용하여 장력을 끊고 해자를 통해 황산구리를 끌 수 있습니다. 황산구리가 전체 해자를 통과 한 후 200 마이크로 리터 피펫 또는 진공 흡입을 사용하여 가능한 한 많은 황산구리를 제거하십시오. 스퀴즈 병을 사용하여 장치와 트레이 벽 사이의 공간에 물 결정을 추가합니다.트레이 뚜껑을 닫고 4면을 모두 파라필름으로 감쌉니다. 플레이트를 완전히 밀봉하기 위해 두 개의 추가 파라필름 조각을 추가합니다. 리피터 피펫을 사용하여 5마이크로리터의 농축 박테리아가 있는 각 웰을 발견합니다.LMNGM 표면과의 직접적인 접촉을 피하십시오. 컴퓨터 케이스 팬과 HEPA 필터를 사용하여 최소한의 비용으로 구성할 수 있는 맞춤형 건조 상자를 사용하여 장치를 건조하십시오. 해부 범위 내에서 우물을 검사하여 모든 우물이 성공적으로 건조되었는지 확인합니다.플래티넘 픽을 사용하여 준비된 웜 플레이트에서 동물을 옮기고 우물 당 하나의 웜을 추가합니다. 준비된 세제 용액을 트레이 뚜껑 안쪽에 한 방울 떨어뜨리고 세제 용액이 마를 때까지 작업용 물티슈로 문지릅니다. 원고에 설명 된대로 세 조각의 파라 필름으로 트레이를 감 쌉니다.daf-2(RNAi)의 수명 연장은 daf-16 null 돌연변이에 의해 차단됩니다. daf-2(RNAi)의 존재 하에서 건강 기간도 감소했습니다.daf-16 돌연변이 및 daf-2(RNAi)에 의해 수명 전반에 걸친 3일 롤링 평균 활동이 감소합니다. 개별 동물의 수명 전반에 걸친 누적 활동은 수명 전반에 걸쳐 특정 날짜의 개별 동물 활동보다 수명과 더 나은 상관 관계가 있습니다.우물을 채우고 가능한 한 빨리 벌레를 추가하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 우물이 마르고 벌레가 살아남지 못할 수 있습니다. 이 시스템은 수명, 활동, 신체 크기 또는 모양과 같은 높은 처리량의 데이터를 수집하는 데 사용할 수 있는 자동 이미징과 호환됩니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em솔리드 미디어> 수명

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

연구

생물학

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

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솔리드 플레이트 기반식이 제한에 Caenorhabditis 엘레간스</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

광학 프로젝션 Tomography를 사용하여 인간 유방암 표본과 그 분석의 장기 문화

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

갑각류와 장기 치명적인 독성 시험 Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

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에서 프로스타글란딘 추출 및 분석<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

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성인 마우스및 쥐 심근세포의 격리, 트랜스페션 및 장기 문화

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

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자극라만 산란 현미경 검사를 사용하여 Caenorhabditis elegans의 지질 저장 역학의 라벨 프리 이미징

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...