Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH R35GM133588 til G.L.S., en United States National Academy of Medicine Catalyst Award til G.L.S., State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administrert av Arizona Board of Regents, og Ellison Medical Foundation.

1. Utarbeidelse av lagerløsninger og medier
MERK: Før du begynner forberedelsen av flerbrønnsinnretningene, må du forberede følgende lagerløsninger og medier.
<ol><li>Stamløsninger for nematodevekstmedier (NGM) og lavsmelte NGM (lmNGM):<ol><li>Forbered 1 MK2 HPO4: Tilsett 174,18 g K2HPO4 til en 1 l flaske, og fyll den opp til 1 L med sterilt avionisert vann. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 minutter, og oppbevares i romtemperatur (RT)....

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Freitas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm+Paparazzi+-+A+high+throughput+lifespan+and+healthspan+analysis+platform+for+individual+Caenorhabditis+elegans.">Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans.</a> University of Arizona. , (2021).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+High-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

WorMotel-systemet er et kraftig verktøy for å samle individualiserte data for hundrevis av isolerte C. elegans over tid. Etter de tidligere studiene ved bruk av flerbrønnsenheter for applikasjoner i utviklingsstillhet, lokomotorisk oppførsel og aldring, var målet med dette arbeidet å optimalisere utarbeidelsen av flerbrønnsenheter for langsiktig overvåking av aktivitet, helse og levetid på en høyere gjennomstrømningsmåte. Dette arbeidet gir en detaljert protokoll for klargjøring av flerbrønnsenhete...

Caenorhabditis elegans brukes ofte i aldringsstudier på grunn av deres korte generasjonstid (ca. 3 dager), kort levetid (ca. 3 uker), enkel dyrking i laboratoriet, høy grad av evolusjonær bevaring av molekylære prosesser og veier med pattedyr, og bred tilgjengelighet av genetiske manipulasjonsteknikker. I sammenheng med aldringsstudier tillater C. elegans rask generering av levetidsdata og eldre populasjoner for analyse av senlivsfenotyper hos levende dyr. Den typiske tilnærmingen for å gjennomføre ormaldringsstudier innebærer manuell måling av levetiden til en populasjon av ormer opprettholdt i grupper på 20 til 70 dyr på faste agarnematodevekstmedier (NGM) i 6 cm petrisklater1. Bruk av alderssynkroniserte populasjoner gjør det mulig å måle levetid eller tverrsnittsfenotyper hos enkeltdyr på tvers av populasjonen, men denne metoden utelukker overvåking av egenskapene til individuelle dyr over tid. Denne tilnærmingen er også arbeidskrevende, og begrenser dermed størrelsen på befolkningen som kan testes.
Det er et begrenset antall kulturmetoder som muliggjør langsgående overvåking av individuelle C. elegans gjennom hele levetiden, og hver har et distinkt sett med fordeler og ulemper. Microfluidics-enheter, inkludert WormFarm2, NemaLife3 og "behavior" chip4, blant annet 5,6,7, tillater overvåking av individuelle dyr over tid. Dyrking av ormer i flytende kultur ved hjelp av flerbrønnsplater tillater på samme måte overvåking av enten individuelle dyr eller små populasjoner av C. elegans over tid 8,9. Det flytende miljøet representerer en distinkt miljøkontekst fra det felles kulturmiljøet på faste medier i petrisklater, noe som kan endre aspekter av dyrefysiologi som er relevante for aldring, inkludert fettinnhold og uttrykket av stressresponsgener10,11. Muligheten til å direkte sammenligne disse studiene med flertallet av data samlet på aldring C. elegans er begrenset av forskjeller i potensielt viktige miljøvariabler. Worm Corral12 er en tilnærming utviklet for å huse individuelle dyr i et miljø som bedre replikerer typisk solid mediekultur. Worm Corral inneholder et forseglet kammer for hvert dyr på et mikroskopglass ved hjelp av hydrogel, noe som muliggjør langsgående overvåking av isolerte dyr. Denne metoden bruker standard lysfeltavbildning for å registrere morfologiske data, for eksempel kroppsstørrelse og aktivitet. Imidlertid plasseres dyr i hydrogelmiljøet som embryoer, hvor de forblir uforstyrret gjennom hele levetiden. Dette krever bruk av betinget steril mutant eller transgen genetisk bakgrunn, noe som begrenser både kapasiteten til genetisk screening, da hver ny mutasjon eller transgen må krysses inn i en bakgrunn med betinget sterilitet, og kapasiteten til narkotikascreening, da behandlinger bare kan brukes en gang på dyrene som embryoer.
En alternativ metode utviklet av Fang-Yen-laboratoriet tillater dyrking av ormer på faste medier i individuelle brønner av en mikrofabrikert polydimetylsiloksan (PDMS) enhet kalt en WorMotel13,14. Hver enhet er plassert i en enkeltbrønnsbrett (dvs. med samme dimensjoner som en 96-brønnplate) og har 240 brønner adskilt av en vollgrav fylt med en aversiv løsning for å forhindre at ormene reiser mellom brønner. Hver brønn kan huse en enkelt orm i løpet av levetiden. Enheten er omgitt av vannabsorberende polyakrylamidgelpellets (referert til som "vannkrystaller"), og brettet er forseglet med Parafilm laboratoriefilm for å opprettholde fuktigheten og minimere uttørking av mediet. Dette systemet gjør det mulig å samle inn helsespenn- og levetidsdata for individuelle dyr, mens bruken av solide medier bedre rekapitulerer miljøet som oppleves av dyr i det store flertallet av publiserte C. elegans levetidsstudier, og tillater dermed mer direkte sammenligninger. Nylig har en lignende teknikk blitt utviklet ved bruk av polystyrenmikrobrett som opprinnelig ble brukt til mikrocytotoksisitetsanalyser15 i stedet for PDMS-enheten16. Mikroskuffmetoden tillater innsamling av individualiserte data for ormer dyrket på faste medier og har forbedret kapasitet for å inneholde ormer under forhold som vanligvis ville føre til flukt (f.eks. stressorer eller diettbegrensning), med avveiningen at hver mikrobrett bare kan inneholde 96 dyr16, mens flerbrønnsenheten som brukes her, kan inneholde opptil 240 dyr.
Presentert her er en detaljert protokoll for å forberede flerbrønnsenheter som er optimalisert for plate-til-plate-konsistens og utarbeidelse av flere enheter parallelt. Denne protokollen ble tilpasset fra den opprinnelige protokollen fra Fang-Yen-laboratoriet13. Spesielt er det beskrivelser for teknikker for å minimere forurensning, optimalisere konsekvent tørking av både faste medier og bakteriell matkilde, og levere RNAi og narkotika. Dette systemet kan brukes til å spore individuell helse, levetid og andre fenotyper, for eksempel kroppsstørrelse og form. Disse flerbrønnsenhetene er kompatible med eksisterende systemer med høy gjennomstrømning for å måle levetiden, noe som kan fjerne mye av det manuelle arbeidet som er involvert i tradisjonelle levetidseksperimenter og gi mulighet for automatisert, direkte levetidsmåling og helsesporing i individuelle C. elegans i skala.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

Nematoden Caenorhabditis elegans er blant de vanligste modellsystemene som brukes i aldringsforskning på grunn av sine enkle og rimelige kulturteknikker, rask reproduksjonssyklus (~ 3 dager), kort levetid (~ 3 uker) og mange tilgjengelige verktøy for genetisk manipulasjon og molekylær analyse. Den vanligste tilnærmingen for å gjennomføre aldringsstudier i C. elegans, inkludert overlevelsesanalyse, innebærer dyrking av populasjoner på titalls til hundrevis av dyr sammen på faste nematodevekstmedier (NGM) i petrisklater. Selv om denne tilnærmingen samler inn data om en populasjon av dyr, sporer de fleste protokoller ikke individuelle dyr over tid. Presentert her er en optimalisert protokoll for langsiktig dyrking av individuelle dyr på mikrofabrikerte polydimetylsiloksan (PDMS) enheter kalt WorMotels. Hver enhet gjør det mulig å dyrke opptil 240 dyr i små brønner som inneholder NGM, med hver brønn isolert av en kobbersulfatholdig vollgrav som hindrer dyrene i å flykte. Basert på den opprinnelige WorMotel-beskrivelsen, gir dette dokumentet en detaljert protokoll for støping, klargjøring og utfylling av hver enhet, med beskrivelser av vanlige tekniske komplikasjoner og råd for feilsøking. Innenfor denne protokollen er teknikker for konsekvent lasting av små volum NGM, konsekvent tørking av både NGM og bakteriell mat, muligheter for å levere farmakologiske inngrep, instruksjoner for og praktiske begrensninger for gjenbruk av PDMS-enheter, og tips for å minimere uttørking, selv i miljøer med lav luftfuktighet. Denne teknikken tillater langsgående overvåking av ulike fysiologiske parametere, inkludert stimulert aktivitet, ustimulert aktivitet, kroppsstørrelse, bevegelsesgeometri, helsespenn og overlevelse, i et miljø som ligner standardteknikken for gruppekultur på faste medier i petrisklater. Denne metoden er kompatibel med datainnsamling med høy gjennomstrømning når den brukes sammen med automatisert mikroskopi- og analyseprogramvare. Til slutt diskuteres begrensningene i denne teknikken, samt en sammenligning av denne tilnærmingen til en nylig utviklet metode som bruker mikroskuffer til å dyrke isolerte nematoder på faste medier.

WorMotel-kultursystemet kan brukes til å samle en rekke data, inkludert om levetid, helse og aktivitet. Publiserte studier har benyttet flerbrønnsenheter for å studere levetid og helsespenn 13,14, ro og søvn 22,23,24 og atferd 25. Levetiden kan skåres manuelt eller gjennom en samling bilder og nedstrøms bildeanalyse. I den tidligere tilnærm...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Presentert her er en optimalisert protokoll for dyrking av isolerte individuelle nematoder på faste medier i mikrofabrikerte flerbrønnsenheter. Denne tilnærmingen gjør det mulig å overvåke individuelle dyr gjennom hele livet for en rekke fenotyper relatert til aldring og helse, inkludert aktivitet, kroppsstørrelse og form, bevegelsesgeometri og overlevelse.

Langsiktig kultur og overvåking av isolerte Caenorhabditis elegans på faste medier i flerbrønnsenheter

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

Når vi studerer aldring og sjøeleganer, følger vi vanligvis en populasjon av dyr over tid. Dette gir oss et glimt av hva den prosessen du studerer gjør i populasjonen på hvert tidspunkt, men det forteller deg ikke hvordan prosessen endrer seg hos individuelle dyr over tid. Disse enkeltdyrkulturmiljøene lar oss følge dynamiske endringer i molekylære prosesser og fysiologiske prosesser hos individuelle dyr over tid for hundrevis av dyr parallelt.Vi finner at det er to store ting som virkelig kan påvirke kvaliteten på disse flerbrønnskultursystemene. Den ene er enten over eller under tørking av brønnene og den andre er forurensning. Og vi prøver å merke gjennom protokollen spesifikke trinn der du kan prøve å redusere disse problemene.Demonstrerer protokollen i dag vil være Emily Gardea. Hun er tekniker i laboratoriet mitt og har gjort mye arbeid for å optimalisere denne protokollen. Etter å ha forberedt alle reagensene, bland 60 gram PDMS-base og seks gram herdemiddel per form i en stor engangsbåt ved hjelp av en engangsspatel.Plasser PDMS-blandingen i et vakuumkammer i 30 minutter ved minus 0,08 Mega Pascal for å fjerne bobler. Hell og fyll PDMS-blandingen i hver 3D-printet form. Sett den fylte formen og eventuell ekstra PDMS-blanding i vakuumkammeret i 25 minutter ved minus 0,08 Mega Pascal.Fjern den fylte formen fra vakuumkammeret og pop eventuelle gjenværende bobler med en engangsslikkepott. Begynn med den ene kanten, senk sakte et flatt akrylark på toppen av den PDMS-fylte formen. Hvis bobledannelse oppstår, fortsett som beskrevet i manuskriptet.Legg en vekt på 2,5 pund på akryl og legg de vektede formene i ovnen. La dem kurere ved 55 grader Celsius over natten. På slutten av inkubasjonen, fjern vektene og formene fra ovnen.Deretter jobber du et barberblad mellom akryl og herdet PDMS For å bryte forseglingen Bruk en barberhøvel eller en metallspatel, løsne sidene av den herdede PDMS forsiktig og fjern dem fra formen. Pakk PDMS-enheten inn i aluminiumsfolie. Forsegl den med autoklavtape og steriliser ved autoklavering på en tørr syklus i minst 15 minutter ved 121 grader Celsius og 15 pund per kvadrattomme målertrykk.For å forberede flerbrønnsenheten, forvarm en tørr perlebadinkubator til 90 grader Celsius. Pakk ut en autoklavert flerbrønnsenhet og kutt et lite hakk øverst til høyre på enheten. Plasser opptil tre uinnpakkede enheter i plasmarenseren med brønnene vendt opp og kjør plasmarenseren.Steriliser ett enkelt polystyrenbrett per enhet ved å spraye innsiden av brettet med 70 % etanol og tørke det tørt med en arbeidsserviett. Fjern hver enhet fra plasmarenseren med en hansket hånd og legg den i en rengjort skuff. Legg deretter et 25 milliliter engangs pipettebasseng i perlebadinkubatoren forvarmet ved 90 grader Celsius.Ta ett rør med størknet LMNGM-forblanding per enhet som skal fylles og legg den i et 200 milliliter glassbeger. Fjern hetten og parafilm og mikrobølgeovn til mediet smelter tilstrekkelig til å helles. Hell den smeltede LMNGM-forblandingen i et annet sterilt 200 milliliter beger.Flere reagensrør kan kombineres i dette begeret hvis mer enn én enhet fylles om gangen. Mikrobølgeovn LMNGM-forblandingen i ytterligere 20 sekunder. Hvis forblandingen begynner å koke over, stopp mikrobølgeovnen og la den sette seg.Fjern den smeltede LMNGM-forblandingen fra mikrobølgeovnen og avkjøl den til 60 grader Celsius. Tilsett de resterende LMNGM-ingrediensene i preblandingsblandingen og hell den smeltede LMNGM i 25 milliliters bassenget i perlebadet. Fyll enhetens brønner med en 200 mikroliters flerkanals repeaterpipette.Sett repeateren til å dispensere alikoter på 14 mikroliter og monter fem pipettespisser. Legg spissene med smeltet LMNGM og dispenser de første 14 mikroliterne tilbake i LMNGM-bassenget. Flytt raskt, men forsiktig, dispenser 14 mikroliter inn i enhetens indre brønner og dispenser den gjenværende LMNGM tilbake i bassenget, da den endelige alikoten vanligvis er mindre enn 14 mikroliter.Sett deretter repeateren til å dispensere alikoter på 15 mikroliter og fylle den ytterste ringen av brønner. Bruk en 200 mikroliter pipette, dispenser 200 mikroliter kobbersulfatløsning i enhetens vollgrav i hvert hjørne. Unngå overfylling av vollgraven og sørg for at kobbersulfatet ikke berører brønnens øverste overflate.Hvis kobbersulfatet ikke strømmer lett gjennom hele vollgraven, bruk en kort platinatrådplukk for å bryte spenningen og dra kobbersulfatet gjennom vollgraven. Etter at kobbersulfatet har strømmet gjennom hele vollgraven, fjern så mye kobbersulfat som mulig ved hjelp av en 200 mikroliter pipette eller aspirasjon med vakuum. Bruk en klemflaske til å legge til vannkrystallene i mellomrommene mellom enheten og brettveggene.Lukk brettlokket og pakk alle fire sidene med et stykke Parafilm. Legg til to ekstra Parafilm-stykker for å forsegle platen helt. Bruk en repeaterpipette, flekk hver brønn med fem mikroliter konsentrerte bakterier.Unngå direkte kontakt med LMNGM-overflaten. Tørk enhetene ved hjelp av en spesialbygd tørkeboks som kan konstrueres til minimal kostnad ved hjelp av datamaskinvifter og HEPA-filtre. Under et disseksjonsomfang, inspiser brønner for å sikre at alle brønner har tørket riktig.Bruk en platinaplukke, overfør dyrene fra de tilberedte ormplatene og tilsett en orm per brønn. Tilsett en dråpe tilberedt vaskemiddelløsning på innsiden av brettlokket og gni med en arbeidsserviett til vaskemiddelløsningen har tørket. Pakk brettet inn med tre stykker Parafilm som beskrevet i manuskriptet.Levetidsforlengelsen fra daf-2 (RNAi) blokkeres av daf-16 nullmutasjonen. Helsespennet ble også redusert i nærvær av daf-2(RNAi)Det tre-dagers rullerende gjennomsnittet av aktivitet over hele levetiden reduseres av daf-16 mutant og daf-2(RNAi)Variasjonen i levetid og helsespenn på tvers av individuelle dyr sammenlignet enten i absolutte termer eller som en brøkdel av den totale levetiden er vist. Den kumulative aktiviteten over livsløpet for individuelle dyr korrelerer bedre med levetiden enn aktiviteten for individuelle dyr på en bestemt dag over hele levetiden.Det er viktig å fylle brønnene og legge til ormene så raskt som mulig. Ellers kan brønnene tørke ut og ormene vil ikke overleve. Dette systemet er kompatibelt med automatisert bildebehandling som kan brukes til å samle data med høy gjennomstrømning som levetid, aktivitet og kroppsstørrelse eller form.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsiktig Dødelig toksisitet Test med krepsdyret Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Utvinning og analyse i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Dyrking<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; I Axenic Flytende Media og Opprettelse av Transgene Worms av mikropartikkel bombardementet

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolasjon, transfection, og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Etikettfri bildebehandling av Lipidlagringsdynamikk i Caenorhabditis elegans ved hjelp av stimulert Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...