Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo NIH R35GM133588 para G.L.S., um Prêmio Catalisador da Academia Nacional de Medicina dos Estados Unidos para G.L.S., o Fundo de Iniciativa de Tecnologia e Pesquisa do Estado do Arizona administrado pelo Conselho de Regentes do Arizona e a Fundação Médica Ellison.

1. Preparação de soluções e suportes de stock
NOTA: Antes de iniciar a preparação dos dispositivos multipoços, prepare as seguintes soluções de estoque e mídias.
<ol><li>Soluções estoque para meios de crescimento de nematoides (NGM) e NGM de baixa fusão (lmNGM):<ol><li>Prepare 1 M K 2 HPO4: Adicione 174,18 g de K2HPO4 aum frasco de 1 L e encha-o até 1 L com água deionizada estéril. Autoclave (121 °C, 15 psig) por 30 min, e ar...

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Freitas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm+Paparazzi+-+A+high+throughput+lifespan+and+healthspan+analysis+platform+for+individual+Caenorhabditis+elegans.">Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans.</a> University of Arizona. , (2021).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+High-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

O sistema WorMotel é uma ferramenta poderosa para coletar dados individualizados para centenas de C. elegans isolados ao longo do tempo. Seguindo os estudos anteriores usando dispositivos multipoços para aplicações em quiescência de desenvolvimento, comportamento locomotor e envelhecimento, o objetivo deste trabalho foi otimizar a preparação de dispositivos multipoços para o monitoramento de longo prazo da atividade, saúde e vida útil de uma maneira de maior rendimento. Este trabalho fornece um protoco...

Caenorhabditis elegans são comumente usados em estudos de envelhecimento devido ao seu curto tempo de geração (aproximadamente 3 dias), curta expectativa de vida (aproximadamente 3 semanas), facilidade de cultivo em laboratório, alto grau de conservação evolutiva de processos moleculares e vias com mamíferos, e ampla disponibilidade de técnicas de manipulação genética. No contexto dos estudos de envelhecimento, C. elegans permite a geração rápida de dados de longevidade e populações envelhecidas para a análise de fenótipos tardios em animais vivos. A abordagem típica para a realização de estudos de envelhecimento de vermes envolve a medição manual da vida útil de uma população de vermes mantida em grupos de 20 a 70 animais em meios de crescimento de nematoides em ágar sólido (NGM) em placas de Petri de 6 cm1. O uso de populações sincronizadas com a idade permite a medição da expectativa de vida ou fenótipos transversais em animais individuais em toda a população, mas esse método impede o monitoramento das características de animais individuais ao longo do tempo. Essa abordagem também é trabalhosa, restringindo o tamanho da população que pode ser testada.
Há um número limitado de métodos de cultura que permitem o monitoramento longitudinal de C. elegans individuais ao longo de sua vida útil, e cada um tem um conjunto distinto de vantagens e desvantagens. Dispositivos microfluídicos, incluindo WormFarm2, NemaLife3, chipde "comportamento" 4, entre outros 5,6,7, permitem o monitoramento de animais individuais ao longo do tempo. O cultivo de vermes em cultura líquida utilizando placas de poços múltiplos permite o monitoramento de animais individuais ou de pequenas populações de C. elegans ao longo do tempo 8,9. O ambiente líquido representa um contexto ambiental distinto do ambiente comum de cultura em meio sólido em placas de Petri, o que pode alterar aspectos da fisiologia animal relevantes para o envelhecimento, incluindo o conteúdo de gordura e a expressão de genes de resposta ao estresse10,11. A capacidade de comparar diretamente esses estudos com a maioria dos dados coletados sobre envelhecimento de C. elegans é limitada por diferenças em variáveis ambientais potencialmente importantes. O Worm Corral12 é uma abordagem desenvolvida para abrigar animais individuais em um ambiente que replica mais de perto a cultura típica de mídia sólida. O Curral de Vermes contém uma câmara selada para cada animal em uma lâmina de microscópio utilizando hidrogel, permitindo o monitoramento longitudinal dos animais isolados. Esse método usa imagens de campo claro padrão para registrar dados morfológicos, como tamanho e atividade corporal. No entanto, os animais são colocados no ambiente de hidrogel como embriões, onde permanecem intactos durante toda a sua vida. Isso requer o uso de fundos genéticos mutantes ou transgênicos condicionalmente estéreis, o que limita tanto a capacidade de triagem genética, já que cada nova mutação ou transgene precisa ser cruzado em um fundo com esterilidade condicional, quanto a capacidade de triagem de drogas, já que os tratamentos só podem ser aplicados uma vez aos animais como embriões.
Um método alternativo desenvolvido pelo laboratório Fang-Yen permite o cultivo de vermes em meio sólido em poços individuais de um dispositivo microfabricado de polidimetilsiloxano (PDMS) denominado WorMotel13,14. Cada dispositivo é colocado em uma bandeja de poço único (ou seja, com as mesmas dimensões de uma placa de 96 poços) e tem 240 poços separados por um fosso preenchido com uma solução aversiva para evitar que os vermes viajem entre poços. Cada poço pode abrigar um único verme durante toda a sua vida útil. O dispositivo é cercado por pastilhas de gel de poliacrilamida absorvedoras de água (conhecidas como "cristais de água"), e a bandeja é selada com filme de laboratório Parafilm para manter a umidade e minimizar a dessecação do meio. Esse sistema permite que dados de saúde e expectativa de vida sejam coletados para animais individuais, enquanto o uso de meios sólidos recapitula melhor o ambiente experimentado pelos animais na grande maioria dos estudos publicados sobre a expectativa de vida de C. elegans, permitindo comparações mais diretas. Recentemente, uma técnica semelhante foi desenvolvida utilizando microbandejas de poliestireno que foram originalmente usadas para ensaios de microcitotoxicidade15 no lugar do dispositivo PDMS16. O método da microbandeja permite a coleta de dados individualizados para vermes cultivados em meio sólido e melhorou a capacidade de conter vermes em condições que normalmente causariam fuga (por exemplo, estressores ou restrição alimentar), com a compensação de que cada microbandeja pode conter apenas 96 animais16, enquanto o dispositivo multipoço utilizado aqui pode conter até 240 animais.
Apresentamos aqui um protocolo detalhado para a preparação de dispositivos multipoços que é otimizado para consistência placa a placa e a preparação de vários dispositivos em paralelo. Esse protocolo foi adaptado do protocolo original do laboratório Fang-Yen13. Especificamente, há descrições de técnicas para minimizar a contaminação, otimizar a secagem consistente do meio sólido e da fonte de alimento bacteriano e entregar RNAi e medicamentos. Esse sistema pode ser usado para rastrear a saúde individual, a expectativa de vida e outros fenótipos, como tamanho e forma do corpo. Esses dispositivos de vários poços são compatíveis com sistemas de alto rendimento existentes para medir a vida útil, o que pode remover grande parte do trabalho manual envolvido em experimentos tradicionais de vida útil e fornecer a oportunidade de medição de longevidade direta e automatizada e rastreamento de saúde em C. elegans individuais em escala.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

O nematoide Caenorhabditis elegans está entre os sistemas modelo mais comuns usados na pesquisa do envelhecimento devido às suas técnicas de cultura simples e baratas, ciclo de reprodução rápido (~3 dias), curta vida útil (~3 semanas) e inúmeras ferramentas disponíveis para manipulação genética e análise molecular. A abordagem mais comum para a realização de estudos de envelhecimento em C. elegans, incluindo análise de sobrevivência, envolve o cultivo de populações de dezenas a centenas de animais em conjunto em meios de crescimento de nematoides sólidos (NGM) em placas de Petri. Embora essa abordagem reúna dados sobre uma população de animais, a maioria dos protocolos não rastreia animais individuais ao longo do tempo. Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o cultivo a longo prazo de animais individuais em dispositivos microfabricados de polidimetilsiloxano (PDMS) chamados WorMotels. Cada dispositivo permite que até 240 animais sejam cultivados em pequenos poços contendo NGM, com cada poço isolado por um fosso contendo sulfato de cobre que impede a fuga dos animais. Com base na descrição original do WorMotel, este documento fornece um protocolo detalhado para moldar, preparar e preencher cada dispositivo, com descrições de complicações técnicas comuns e conselhos para solução de problemas. Dentro desse protocolo estão técnicas para o carregamento consistente de NGM de pequeno volume, a secagem consistente tanto da NGM quanto do alimento bacteriano, opções para a realização de intervenções farmacológicas, instruções e limitações práticas para a reutilização de dispositivos PDMS e dicas para minimizar a dessecação, mesmo em ambientes de baixa umidade. Essa técnica permite o monitoramento longitudinal de vários parâmetros fisiológicos, incluindo atividade estimulada, atividade não estimulada, tamanho corporal, geometria do movimento, tempo de saúde e sobrevivência, em um ambiente semelhante à técnica padrão para cultura de grupo em meios sólidos em placas de Petri. Este método é compatível com a coleta de dados de alto rendimento quando usado em conjunto com software de microscopia e análise automatizados. Finalmente, as limitações desta técnica são discutidas, bem como uma comparação desta abordagem com um método recentemente desenvolvido que utiliza microbandejas para cultura de nematoides isolados em meio sólido.

O sistema de cultura WorMotel pode ser usado para reunir uma variedade de dados, incluindo sobre tempo de vida, saúde e atividade. Estudos publicados têm utilizado dispositivos multipoços para estudar a expectativa de vida e a expectativa de vida13,14, a quiescência e o sono 22,23,24 e o comportamento 25. A vida útil pode ser pontuada manualm...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Apresentamos aqui um protocolo otimizado para o cultivo de nematoides individuais isolados em meios sólidos em dispositivos microfabricados de múltiplos poços. Essa abordagem permite que animais individuais sejam monitorados ao longo de suas vidas para uma variedade de fenótipos relacionados ao envelhecimento e à saúde, incluindo atividade, tamanho e forma corporal, geometria do movimento e sobrevivência.

Cultura de Longa Duração e Monitoramento de Caenorhabditis elegans Isolados em Meio Sólido em Dispositivos Multipoços

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

Quando estamos estudando o envelhecimento e os elegans marinhos, normalmente estamos acompanhando uma população de animais ao longo do tempo. Isso nos dá um vislumbre do que esse processo que você está estudando está fazendo na população em cada ponto de tempo, mas não diz como o processo está mudando em animais individuais ao longo do tempo. Esses ambientes de cultura animal única nos permitem acompanhar mudanças dinâmicas em processos moleculares e processos fisiológicos em animais individuais ao longo do tempo para centenas de animais em paralelo.Descobrimos que há duas coisas principais que podem realmente impactar a qualidade desses sistemas de cultura multipoço. Uma é sobre ou abaixo da secagem dos poços e a segunda é a contaminação. E tentamos observar ao longo do protocolo etapas específicas onde você pode tentar mitigar esses problemas.Quem demonstrará o protocolo hoje será Emily Gardea. Ela é técnica no meu laboratório e tem feito muito trabalho para otimizar esse protocolo. Depois de preparar todos os reagentes, misture 60 gramas de base PDMS e seis gramas de agente de cura por molde em um barco grande descartável usando uma espátula descartável.Coloque a mistura de PDMS em uma câmara de vácuo por 30 minutos a menos 0,08 Mega Pascal para remover bolhas. Despeje e preencha a mistura de PDMS em cada molde impresso em 3D. Coloque o molde preenchido e qualquer mistura extra de PDMS na câmara de vácuo por 25 minutos a menos 0,08 Mega Pascal.Retire o molde preenchido da câmara de vácuo e estoure as bolhas restantes com uma espátula descartável. Começando com uma borda, abaixe lentamente uma folha de acrílico plana sobre o molde preenchido com PDMS. Se ocorrer formação de bolhas, proceda conforme descrito no manuscrito.Coloque um peso de 2,5 quilos sobre o acrílico e coloque as formas pesadas no forno. Deixe-os curar a 55 graus Celsius durante a noite. Ao final da incubação, retire os pesos e as formas do forno.Em seguida, trabalhe uma lâmina de barbear entre o acrílico e o PDMS curado Para quebrar o selo Usando uma navalha ou uma espátula de metal, solte cuidadosamente as laterais do PDMS curado e retire-as do molde. Embrulhe o dispositivo PDMS em papel alumínio. Selá-lo com fita autoclave e esterilizar por autoclave em ciclo seco por pelo menos 15 minutos a 121 graus Celsius e pressão de 15 libras por polegada quadrada de manômetro.Para preparar o dispositivo multipoço, pré-aqueça uma incubadora de banho de contas secas a 90 graus Celsius. Desembrulhe um dispositivo multipoço autoclavado e corte um pequeno entalhe no canto superior direito do dispositivo. Coloque até três dispositivos desembrulhados no limpador de plasma com os orifícios virados para cima e execute o limpador de plasma.Esterilize uma bandeja de poliestireno de poço único por dispositivo, borrifando o interior da bandeja com etanol 70% e limpando-a com um lenço de limpeza. Retire cada dispositivo do limpador de plasma com uma mão enluvada e coloque-o em uma bandeja limpa. Em seguida, coloque uma bacia de pipeta descartável de 25 mililitros na incubadora de banho de contas pré-aquecida a 90 graus Celsius.Pegue um tubo de pré-mistura LMNGM solidificado por dispositivo a ser preenchido e coloque-o em um copo de vidro de 200 mililitros. Retire a tampa e o Parafilm e o micro-ondas até que o meio derreta o suficiente para despejar. Despeje a pré-mistura LMNGM derretida em outro copo estéril de 200 mililitros.Vários tubos de ensaio podem ser combinados neste copo se mais de um dispositivo for preenchido ao mesmo tempo. Leve à pré-mistura LMNGM no micro-ondas por mais 20 segundos. Se a pré-mistura começar a ferver, pare o micro-ondas e deixe assentar.Retire a pré-mistura LMNGM derretida do micro-ondas e arrefeça a 60 graus Celsius. Adicione os ingredientes LMNGM restantes à mistura de pré-mistura e despeje o LMNGM fundido na bacia de 25 mililitros no banho de contas. Encha os poços do dispositivo usando uma pipeta repetidora multicanal de 200 microlitros.Ajuste o repetidor para dispensar alíquotas de 14 microlitros e montar cinco ponteiras de pipeta. Carregue as pontas com LMNGM fundido e distribua os primeiros 14 microlitros de volta na bacia contendo LMNGM. Movendo-se rapidamente, mas cuidadosamente, distribua 14 microlitros nos poços internos do dispositivo e distribua o LMNGM restante de volta para a bacia, pois a alíquota final é tipicamente inferior a 14 microlitros.Em seguida, ajuste o repetidor para dispensar alíquotas de 15 microlitros e preencher o anel mais externo dos poços. Usando uma pipeta de 200 microlitros, distribua 200 microlitros de solução de sulfato de cobre no fosso do dispositivo em cada canto. Evite encher demais o fosso e certifique-se de que o sulfato de cobre não toque na superfície superior dos poços.Se o sulfato de cobre não fluir facilmente através de todo o fosso, use uma picareta de fio de platina curta para ajudar a quebrar a tensão e arrastar o sulfato de cobre através do fosso. Depois que o sulfato de cobre fluir através de todo o fosso, remova o máximo de sulfato de cobre possível usando uma pipeta de 200 microlitros ou aspiração com vácuo. Usando uma garrafa de squeeze, adicione os cristais de água nos espaços entre o dispositivo e as paredes da bandeja.Feche a tampa da bandeja e envolva os quatro lados com um pedaço de Parafilm. Adicione mais duas peças de Parafilm para selar completamente a placa. Usando uma pipeta repetidora, identifique cada poço com cinco microlitros de bactérias concentradas.Evite o contato direto com a superfície LMNGM. Seque os dispositivos usando uma caixa de secagem personalizada que pode ser construída a um custo mínimo usando ventiladores de gabinete de computador e filtros HEPA. Sob um escopo de dissecação, inspecione os poços para garantir que todos os poços tenham secado com sucesso.Usando uma picareta de platina, transfira os animais das placas de minhoca preparadas e adicione uma minhoca por poço. Adicione uma gota de solução de detergente preparada ao interior da tampa da bandeja e esfregue com um lenço de limpeza até que a solução de detergente tenha secado. Embrulhe a bandeja com três pedaços de Parafilm conforme descrito no manuscrito.A extensão da vida útil do daf-2(RNAi) é bloqueada pela mutação nula daf-16. O tempo de saúde também diminuiu na presença de daf-2(RNAi)A média contínua de três dias de atividade ao longo da vida é reduzida pelo mutante daf-16 e daf-2(RNAi)A variação na expectativa de vida e no tempo de saúde entre animais individuais comparados em termos absolutos ou como uma fração da expectativa de vida total é mostrada. A atividade cumulativa ao longo da vida útil para animais individuais correlaciona-se melhor com a expectativa de vida do que a atividade para animais individuais em qualquer dia específico ao longo da vida.É importante encher os poços e adicionar as minhocas o mais rápido possível. Caso contrário, os poços podem secar e os vermes não sobreviverão. Este sistema é compatível com imagens automatizadas que podem ser usadas para coletar dados de alto rendimento, como tempo de vida, atividade e tamanho ou forma do corpo.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Medição Caenorhabditis elegans Expectativa de Vida em meios sólidos

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Biologia

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Placa sólida baseada na restrição dietética Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Lapso de tempo Microscopia de embriogênese inicial em Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Longo prazo Cultura de Amostras de mama Humano do Câncer e sua análise por meio de tomografia óptica de Projeção

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

A longo prazo de Teste de toxicidade letal com o crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Extração de prostaglandina e Análise em<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

A cultura<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; Em Axenic Liquid Media e Criação de transgênicos Worms por bombardeamento com micropartículas

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolamento, Transfecção e Cultura de Longo Prazo de Cardiomiócitos de Ratos Adultos e Ratos

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Imagem livre de rótulos da Dinâmica de Armazenamento Lipídido em Elegans caenorhabditis usando microscopia de dispersão raman estimulada

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...