Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH R35GM133588 для G.L.S., премией Национальной академии медицины США за катализатор для G.L.S., Фондом технологической и исследовательской инициативы штата Аризона, управляемым Советом регентов Аризоны, и Медицинским фондом Эллисона.

1. Приготовление исходных растворов и сред
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом подготовки многолуночных устройств подготовьте следующие исходные растворы и среды.
<ol><li>Исходные растворы для сред для выращивания нематод (NGM) и низкоплавких NGM (lmNGM):<ol><li>Приготовьте 1 M K 2 HPO<sub...

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Freitas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm+Paparazzi+-+A+high+throughput+lifespan+and+healthspan+analysis+platform+for+individual+Caenorhabditis+elegans.">Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans.</a> University of Arizona. , (2021).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+High-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

Система WorMotel является мощным инструментом для сбора индивидуализированных данных о сотнях изолированных C. elegans с течением времени. Вслед за более ранними исследованиями с использованием многолуночных устройств для применения в состоянии покоя в развитии, опорно-двигательном по?...

Caenorhabditis elegans обычно используются в исследованиях старения из-за их короткого времени генерации (примерно 3 дня), короткой продолжительности жизни (около 3 недель), простоты культивирования в лаборатории, высокой степени эволюционного сохранения молекулярных процессов и путей с млекопитающими, а также широкой доступности методов генетических манипуляций. В контексте исследований старения C. elegans позволяет быстро генерировать данные о долголетии и возрастных популяциях для анализа фенотипов позднего возраста у живых животных. Типичный подход к проведению исследований старения червей включает ручное измерение продолжительности жизни популяции червей, содержащихся в группах от 20 до 70 животных на твердой питательной среде агаровой нематоды (NGM) в 6-сантиметровых пластинах Петри1. Использование популяций, синхронизированных по возрасту, позволяет измерять продолжительность жизни или фенотипы поперечного сечения у отдельных животных в популяции, но этот метод исключает мониторинг характеристик отдельных животных с течением времени. Этот подход также является трудоемким, что ограничивает размер популяции, которая может быть протестирована.
Существует ограниченное количество методов культивирования, которые позволяют проводить продольный мониторинг отдельных C. elegans на протяжении всей их жизни, и каждый из них имеет определенный набор преимуществ и недостатков. Устройства микрофлюидики, в том числе WormFarm2, NemaLife3 и чип «поведения»4, среди прочих 5,6,7, позволяют контролировать отдельных животных с течением времени. Культивирование червей в жидкой культуре с использованием многолуночных планшетов аналогичным образом позволяет контролировать как отдельных животных, так и небольшие популяции C. elegans с течением времени 8,9. Жидкая среда представляет собой особый экологический контекст от обычной культурной среды на твердых средах в пластинах Петри, что может изменять аспекты физиологии животных, имеющие отношение к старению, включая содержание жира и экспрессию генов реакции на стресс10,11. Возможность прямого сравнения этих исследований с большинством данных, собранных о старении C. elegans, ограничена различиями в потенциально важных переменных окружающей среды. Worm Corral12 — это один из подходов, разработанный для размещения отдельных животных в среде, которая более точно воспроизводит типичную культуру твердых сред. Загон для червей содержит герметичную камеру для каждого животного на предметном стекле микроскопа с использованием гидрогеля, что позволяет проводить продольный мониторинг изолированных животных. Этот метод использует стандартную визуализацию светлого поля для записи морфологических данных, таких как размер тела и активность. Тем не менее, животные помещаются в гидрогелевую среду в качестве эмбрионов, где они остаются нетронутыми на протяжении всей своей жизни. Это требует использования условно стерильных мутантных или трансгенных генетических фонов, что ограничивает как возможности для генетического скрининга, поскольку каждая новая мутация или трансген должны быть скрещены на фоне с условной стерильностью, так и способность к скринингу лекарств, поскольку лечение может быть применено только один раз к животным в качестве эмбрионов.
Альтернативный метод, разработанный лабораторией Fang-Yen, позволяет культивировать червей на твердых средах в отдельных лунках микрофабрикованного устройства из полидиметилсилоксана (PDMS) под названием WorMotel13,14. Каждое устройство помещается в однолуночный лоток (т.е. с теми же размерами, что и 96-луночная пластина) и имеет 240 лунок, разделенных рвом, заполненным аверсивным раствором, чтобы предотвратить перемещение червей между лунками. В каждой скважине может находиться один червь в течение всей его жизни. Устройство окружено водопоглощающими гранулами полиакриламидного геля (называемыми «кристаллами воды»), а лоток запечатан лабораторной пленкой Parafilm для поддержания влажности и минимизации высыхания среды. Эта система позволяет собирать данные о продолжительности жизни и продолжительности жизни отдельных животных, в то время как использование твердых сред лучше повторяет окружающую среду, в которой обитают животные в подавляющем большинстве опубликованных исследований продолжительности жизни C. elegans, что позволяет проводить более прямые сравнения. Недавно аналогичная методика была разработана с использованием полистирольных микролотков, которые первоначально использовались для анализов микроцитотоксичности15 вместо устройства16 PDMS. Метод микролотка позволяет собирать индивидуализированные данные о червях, культивируемых на твердых средах, и обладает улучшенной способностью удерживать червей в условиях, которые обычно вызывают бегство (например, стрессоры или диетические ограничения), при этом компромисс заключается в том, что каждый микролоток может содержать только 96 животных16, тогда как используемое здесь многолуночное устройство может содержать до 240 животных.
Здесь представлен подробный протокол подготовки многолуночных устройств, оптимизированный для согласованности между пластинами и параллельной подготовки нескольких устройств. Этот протокол был адаптирован из оригинального протокола из лаборатории Fang-Yen13. В частности, описаны методы минимизации загрязнения, оптимизации последовательной сушки как твердой среды, так и бактериального источника пищи, а также доставки РНК-интерференции и лекарств. Эта система может использоваться для отслеживания индивидуальной продолжительности здоровья, продолжительности жизни и других фенотипов, таких как размер и форма тела. Эти многолуночные устройства совместимы с существующими высокопроизводительными системами для измерения продолжительности жизни, что может устранить большую часть ручного труда, связанного с традиционными экспериментами по продолжительности жизни, и предоставить возможность автоматизированного прямого измерения продолжительности жизни и отслеживания здоровья у отдельных C. elegans в масштабе.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

Нематода Caenorhabditis elegans является одной из наиболее распространенных модельных систем, используемых в исследованиях старения, благодаря своим простым и недорогим методам культивирования, быстрому циклу размножения (~ 3 дня), короткой продолжительности жизни (~ 3 недели) и многочисленным доступным инструментам для генетических манипуляций и молекулярного анализа. Наиболее распространенный подход к проведению исследований старения у C. elegans, включая анализ выживаемости, включает культивирование популяций от десятков до сотен животных вместе на твердых средах роста нематод (NGM) в планшетах Петри. Хотя этот подход собирает данные о популяции животных, большинство протоколов не отслеживают отдельных животных с течением времени. Здесь представлен оптимизированный протокол для долгосрочного культивирования отдельных животных на микрофабрикованных устройствах из полидиметилсилоксана (PDMS), называемых WorMotels. Каждое устройство позволяет культивировать до 240 животных в небольших лунках, содержащих NGM, при этом каждая лунка изолирована рвом, содержащим сульфат меди, который предотвращает бегство животных. Основываясь на оригинальном описании WorMotel, в этом документе представлен подробный протокол формования, подготовки и заполнения каждого устройства с описанием общих технических сложностей и советами по устранению неполадок. В рамках этого протокола представлены методы последовательной загрузки NGM небольшого объема, последовательная сушка как NGM, так и бактериальной пищи, варианты проведения фармакологических вмешательств, инструкции и практические ограничения для повторного использования устройств PDMS, а также советы по минимизации высыхания даже в условиях низкой влажности. Этот метод позволяет проводить продольный мониторинг различных физиологических параметров, включая стимулированную активность, нестимулированную активность, размер тела, геометрию движения, продолжительность жизни и выживаемость, в среде, аналогичной стандартной методике группового культивирования на твердых средах в планшетах Петри. Этот метод совместим с высокопроизводительным сбором данных при использовании в сочетании с программным обеспечением для автоматической микроскопии и анализа. Наконец, обсуждаются ограничения этого метода, а также сравнение этого подхода с недавно разработанным методом, который использует микролотки для культивирования изолированных нематод на твердых средах.

Культурная система WorMotel может использоваться для сбора различных данных, в том числе о продолжительности жизни, продолжительности здоровья и активности. В опубликованных исследованиях использовались многолуночные устройства для изучения продолжительности жизни и здоровья <sup class="xref...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Представлен оптимизированный протокол культивирования изолированных отдельных нематод на твердых средах в микрофабрикованных многолуночных устройствах. Этот подход позволяет контролировать отдельных животных на протяжении всей их жизни на предмет различных фенотипов, связанных со старением и здоровьем, включая активность, размер и форму тела, геометрию движения и выживание.

Многолетнее культивирование и мониторинг изолированных Caenorhabditis elegans на твердых средах в многолуночных устройствах

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

Когда мы изучаем старение и морских элеганов, мы, как правило, следим за популяцией животных с течением времени. Это дает нам представление о том, что этот процесс, который вы изучаете, происходит в популяции в каждый момент времени, но это не говорит вам, как этот процесс меняется у отдельных животных с течением времени. Эти единые среды культивирования животных позволяют нам параллельно отслеживать динамические изменения молекулярных процессов и физиологических процессов у отдельных животных с течением времени для сотен животных.Мы обнаружили, что есть две основные вещи, которые действительно могут повлиять на качество этих многолуночных культурных систем. Один из них либо пересушивает, либо недосушивает колодцы, а второй - загрязнение. И мы стараемся отмечать в протоколе конкретные шаги, на которых вы можете попытаться смягчить эти проблемы.Демонстрировать протокол сегодня будет Эмили Гардеа. Она техник в моей лаборатории и проделала большую работу по оптимизации этого протокола. После приготовления всех реагентов смешайте 60 граммов основы PDMS и шесть граммов отвердителя на форму в большой одноразовой лодке с помощью одноразового шпателя.Поместите смесь PDMS в вакуумную камеру на 30 минут при температуре минус 0,08 мегапаскаля, чтобы удалить пузырьки. Налейте и залейте смесь PDMS в каждую форму, напечатанную на 3D-принтере. Поместите заполненную форму и любую дополнительную смесь PDMS в вакуумную камеру на 25 минут при температуре минус 0,08 мегапаскаля.Извлеките заполненную форму из вакуумной камеры и лопните оставшиеся пузырьки одноразовым шпателем. Начиная с одного края, медленно опустите плоский акриловый лист поверх формы, заполненной PDMS. Если происходит образование пузырьков, действуйте, как описано в рукописи.Поместите груз весом 2.5 фунта на акрил и поместите утяжеленные формы в духовку. Дайте им застыть при 55 градусах Цельсия за ночь. По окончании инкубации достаньте гири и формочки из духовки.Затем проведите бритвенным лезвием между акрилом и отвержденным PDMS. Чтобы сломать уплотнение С помощью бритвы или металлического шпателя осторожно ослабьте боковые стороны отвержденного PDMS и извлеките их из формы. Оберните устройство PDMS в алюминиевую фольгу. Запечатайте его автоклавной лентой и стерилизуйте, автоклавируя в сухом цикле не менее 15 минут при температуре 121 градус Цельсия и манометрическом давлении 15 фунтов на квадратный дюйм.Чтобы приготовить многолуночное устройство, разогрейте инкубатор для ванны с сухим бисером до 90 градусов Цельсия. Разверните автоклавное многолуночное устройство и вырежьте небольшую выемку в правом верхнем углу устройства. Поместите до трех неупакованных устройств в плазменный очиститель лунками вверх и запустите плазменный очиститель.Стерилизуйте один лоток из полистирола на одно устройство, распылив внутри лотка 70% этанола и вытерев его насухо рабочей салфеткой. Извлеките каждое устройство из плазменного очистителя рукой в перчатке и поместите его в очищенный лоток. Затем поместите 25-миллилитровый одноразовый таз для пипеток в инкубатор для ванны с шариками, предварительно нагретый до 90 градусов по Цельсию.Возьмите одну пробирку затвердевшей предварительной смеси LMNGM на каждое заполняемое устройство и поместите ее в стеклянный стакан объемом 200 миллилитров. Снимите крышку и парапленку и разогрейте в микроволновой печи, пока носитель не расплавится настолько, чтобы его можно было вылить. Перелейте расплавленную предварительную смесь LMNGM в другой стерильный стакан объемом 200 миллилитров.Несколько пробирок могут быть объединены в этом стакане, если одновременно заполнено более одного устройства. Разогрейте в микроволновой печи предварительную смесь LMNGM еще 20 секунд. Если предварительная смесь начинает закипать, остановите микроволновую печь и дайте ей отстояться.Извлеките расплавленную предварительную смесь LMNGM из микроволновой печи и охладите ее до 60 градусов Цельсия. Добавьте оставшиеся ингредиенты LMNGM в смесь для предварительной смеси и вылейте расплавленный LMNGM в 25-миллилитровый таз в ванне для шариков. Заполните лунки устройства с помощью многоканальной пипетки-ретранслятора объемом 200 микролитров.Настройте ретранслятор на дозирование аликвот объемом 14 микролитров и установите пять наконечников пипетки. Загрузите наконечники расплавленным LMNGM и выдайте первые 14 микролитров обратно в бассейн, содержащий LMNGM. Двигаясь быстро, но осторожно, распределите 14 микролитров во внутренние лунки устройства и распределите оставшийся LMNGM обратно в бассейн, поскольку конечная аликвота обычно составляет менее 14 микролитров.Затем установите ретранслятор на выдачу аликвот объемом 15 микролитров и заполните самое внешнее кольцо лунок. С помощью пипетки объемом 200 микролитров дозируйте 200 микролитров раствора медного купороса в ров устройства в каждом углу. Избегайте переполнения рва и следите за тем, чтобы медный купорос не касался верхней поверхности лунок.Если медный купорос не проходит легко через весь ров, используйте короткую платиновую проволоку, чтобы снять натяжение и протащить медный купорос через ров. После того, как медный купорос потечет по всему рву, удалите как можно больше медного купороса с помощью пипетки объемом 200 микролитров или аспирации вакуумом. Используя бутылку для выжимки, добавьте кристаллы воды в промежутки между устройством и стенками лотка.Закройте крышку лотка и оберните все четыре стороны куском парапленки. Добавьте два дополнительных кусочка Parafilm, чтобы полностью запечатать пластину. Используя пипетку-ретранслятор, найдите в каждой лунке пять микролитров концентрированных бактерий.Избегайте прямого контакта с поверхностью LMNGM. Высушите устройства с помощью специально изготовленной сушильной камеры, которая может быть изготовлена с минимальными затратами с использованием компьютерных корпусных вентиляторов и фильтров HEPA. Под микроскопом вскрытия осмотрите скважины, чтобы убедиться, что все скважины успешно высохли.Используя платиновую кирку, переложите животных из подготовленных червячных пластин и добавьте по одному червяку в лунку. Добавьте каплю приготовленного раствора моющего средства на внутреннюю часть крышки лотка и протрите рабочей салфеткой, пока раствор моющего средства не высохнет. Оберните поднос тремя кусочками парапленки, как описано в рукописи.Продление продолжительности жизни daf-2 (RNAi) блокируется нулевой мутацией daf-16. Продолжительность здоровья также уменьшилась в присутствии daf-2 (RNAi)Трехдневное скользящее среднее значение активности на протяжении всей жизни уменьшается за счет мутанта daf-16 и daf-2 (RNAi)Показаны различия в продолжительности жизни и продолжительности здоровья у отдельных животных, сравниваемые либо в абсолютном выражении, либо в виде доли от общей продолжительности жизни. Кумулятивная активность на протяжении всей жизни отдельных животных лучше коррелирует с продолжительностью жизни, чем активность отдельных животных в любой конкретный день на протяжении всей жизни.Важно как можно быстрее заполнить лунки и добавить червей. В противном случае колодцы могут пересохнуть, и черви не выживут. Эта система совместима с автоматизированной визуализацией, которую можно использовать для сбора данных с высокой пропускной способностью, таких как продолжительность жизни, активность, размер или форма тела.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни на твердых средах

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Покадровый Микроскопия раннего эмбриогенеза в Caenorhabditis Элеганс

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Долгосрочные культуры рака молочной железы человека образцов и их анализ с помощью оптической томографии Проекция

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Культивирование<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em &gt; В аксенными жидких сред и создания трансгенных червей бомбардировки микрочастицами

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Изоляция, трансфекция и долгосрочная культура взрослых мышей и крысиных кардиомиоцитов

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Безметчная визуализация динамики накопления липидов у caenorhabditis elegans с использованием стимулированной рамановской рассеянной микроскопии

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...