Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por NIH R35GM133588 a G.L.S., un Premio Catalizador de la Academia Nacional de Medicina de los Estados Unidos a GLS, el Fondo de Iniciativa de Tecnología e Investigación del Estado de Arizona administrado por la Junta de Regentes de Arizona y la Fundación Médica Ellison.

1. Preparación de soluciones madre y medios
NOTA: Antes de comenzar la preparación de los dispositivos multipocillos, prepare las siguientes soluciones y medios de stock.
<ol><li>Soluciones madre para medios de crecimiento de nematodos (NGM) y NGM de bajo punto de fusión (lmNGM):<ol><li>Prepare 1 M K 2 HPO4: Agregue 174.18 g de K2HPO4 auna botella de 1 L y llénela hasta 1 L con agua desionizada estéril. Conservar en autoclave (121 °C, 1...

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

El sistema WorMotel es una poderosa herramienta para recopilar datos individualizados para cientos de C. elegans aislados a lo largo del tiempo. Después de los estudios anteriores que utilizaron dispositivos de múltiples pocillos para aplicaciones en la inactividad del desarrollo, el comportamiento locomotor y el envejecimiento, el objetivo de este trabajo fue optimizar la preparación de dispositivos de pocillos múltiples para el monitoreo a largo plazo de la actividad, la salud y la vida útil de una manera...

Caenorhabditis elegans se usa comúnmente en estudios de envejecimiento debido a su corto tiempo de generación (aproximadamente 3 días), corta vida útil (aproximadamente 3 semanas), facilidad de cultivo en el laboratorio, alto grado de conservación evolutiva de procesos moleculares y vías con mamíferos y amplia disponibilidad de técnicas de manipulación genética. En el contexto de los estudios de envejecimiento, C. elegans permite la rápida generación de datos de longevidad y poblaciones envejecidas para el análisis de fenotipos tardíos en animales vivos. El enfoque típico para realizar estudios de envejecimiento de gusanos consiste en medir manualmente la vida útil de una población de gusanos mantenidos en grupos de 20 a 70 animales en medios de crecimiento de nematodos de agar sólido (NGM) en placas de Petri de 6 cm1. El uso de poblaciones sincronizadas por edad permite la medición de la esperanza de vida o fenotipos transversales en animales individuales en toda la población, pero este método impide monitorear las características de animales individuales a lo largo del tiempo. Este enfoque también requiere mucha mano de obra, lo que restringe el tamaño de la población que se puede probar.
Hay un número limitado de métodos de cultivo que permiten el monitoreo longitudinal de C. elegans individuales a lo largo de su vida útil, y cada uno tiene un conjunto distinto de ventajas y desventajas. Los dispositivos de microfluídica, incluidos WormFarm2, NemaLife3 y el chipde "comportamiento" 4, entre otros 5,6,7, permiten el monitoreo de animales individuales a lo largo del tiempo. El cultivo de gusanos en cultivo líquido utilizando placas de pocillos múltiples permite de manera similar el monitoreo de animales individuales o pequeñas poblaciones de C. elegans a lo largo del tiempo 8,9. El ambiente líquido representa un contexto ambiental distinto del ambiente de cultivo común en medios sólidos en placas de Petri, que puede alterar aspectos de la fisiología animal que son relevantes para el envejecimiento, incluido el contenido de grasa y la expresión de genes de respuesta al estrés10,11. La capacidad de comparar directamente estos estudios con la mayoría de los datos recopilados sobre el envejecimiento de C. elegans está limitada por las diferencias en variables ambientales potencialmente importantes. El Worm Corral12 es un enfoque desarrollado para albergar animales individuales en un entorno que replica más de cerca la cultura típica de medios sólidos. El Corral de Gusanos contiene una cámara sellada para cada animal en un portaobjetos de microscopio utilizando hidrogel, lo que permite el monitoreo longitudinal de animales aislados. Este método utiliza imágenes estándar de campo claro para registrar datos morfológicos, como el tamaño corporal y la actividad. Sin embargo, los animales se colocan en el ambiente de hidrogel como embriones, donde permanecen inalterados durante toda su vida. Esto requiere el uso de antecedentes genéticos mutantes o transgénicos condicionalmente estériles, lo que limita tanto la capacidad de cribado genético, ya que cada nueva mutación o transgén necesita ser cruzado a un fondo con esterilidad condicional, como la capacidad de cribado de fármacos, ya que los tratamientos solo se pueden aplicar una vez a los animales como embriones.
Un método alternativo desarrollado por el laboratorio Fang-Yen permite el cultivo de gusanos en medios sólidos en pozos individuales de un dispositivo microfabricado de polidimetilsiloxano (PDMS) llamado WorMotel13,14. Cada dispositivo se coloca en una bandeja de un solo pozo (es decir, con las mismas dimensiones que una placa de 96 pocillos) y tiene 240 pozos separados por un foso lleno de una solución aversiva para evitar que los gusanos viajen entre pozos. Cada pozo puede albergar un solo gusano durante toda su vida útil. El dispositivo está rodeado por gránulos de gel de poliacrilamida que absorben agua (denominados "cristales de agua"), y la bandeja está sellada con una película de laboratorio Parafilm para mantener la humedad y minimizar la desecación de los medios. Este sistema permite recopilar datos de salud y vida útil para animales individuales, mientras que el uso de medios sólidos recapitula mejor el entorno experimentado por los animales en la gran mayoría de los estudios de vida de C. elegans publicados, lo que permite comparaciones más directas. Recientemente, se ha desarrollado una técnica similar utilizando microbandejas de poliestireno que se utilizaron originalmente para ensayos de microcitotoxicidad15 en lugar del dispositivo PDMS16. El método de microbandejas permite la recopilación de datos individualizados para gusanos cultivados en medios sólidos y ha mejorado la capacidad de contener gusanos en condiciones que normalmente causarían huida (por ejemplo, factores estresantes o restricciones dietéticas), con la desventaja de que cada microbandeja solo puede contener 96 animales16, mientras que el dispositivo de múltiples pocillos utilizado aquí puede contener hasta 240 animales.
Aquí se presenta un protocolo detallado para preparar dispositivos de múltiples pocillos que está optimizado para la consistencia de placa a placa y la preparación de múltiples dispositivos en paralelo. Este protocolo fue adaptado del protocolo original del laboratorio Fang-Yen13. Específicamente, hay descripciones de técnicas para minimizar la contaminación, optimizar el secado constante tanto de los medios sólidos como de la fuente de alimento bacteriano, y administrar ARNi y medicamentos. Este sistema se puede utilizar para rastrear la duración de la salud individual, la vida útil y otros fenotipos, como el tamaño y la forma del cuerpo. Estos dispositivos de múltiples pozos son compatibles con los sistemas de alto rendimiento existentes para medir la vida útil, lo que puede eliminar gran parte del trabajo manual involucrado en los experimentos tradicionales de vida útil y brindar la oportunidad de una medición automatizada y directa de la longevidad y el seguimiento de la salud en C. elegans individuales a escala.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

El nematodo Caenorhabditis elegans se encuentra entre los sistemas modelo más comunes utilizados en la investigación del envejecimiento debido a sus técnicas de cultivo simples y económicas, ciclo de reproducción rápido (~ 3 días), vida útil corta (~ 3 semanas) y numerosas herramientas disponibles para la manipulación genética y el análisis molecular. El enfoque más común para realizar estudios de envejecimiento en C. elegans, incluido el análisis de supervivencia, implica cultivar poblaciones de decenas a cientos de animales juntos en medios sólidos de crecimiento de nematodos (NGM) en placas de Petri. Si bien este enfoque recopila datos sobre una población de animales, la mayoría de los protocolos no rastrean animales individuales a lo largo del tiempo. Aquí se presenta un protocolo optimizado para el cultivo a largo plazo de animales individuales en dispositivos microfabricados de polidimetilsiloxano (PDMS) llamados WorMotels. Cada dispositivo permite cultivar hasta 240 animales en pequeños pozos que contienen NGM, con cada pozo aislado por un foso que contiene sulfato de cobre que evita que los animales huyan. Sobre la base de la descripción original de WorMotel, este documento proporciona un protocolo detallado para moldear, preparar y rellenar cada dispositivo, con descripciones de complicaciones técnicas comunes y consejos para la resolución de problemas. Dentro de este protocolo se encuentran técnicas para la carga consistente de NGM de pequeño volumen, el secado consistente tanto del NGM como de los alimentos bacterianos, opciones para administrar intervenciones farmacológicas, instrucciones y limitaciones prácticas para reutilizar dispositivos PDMS y consejos para minimizar la desecación, incluso en ambientes de baja humedad. Esta técnica permite el monitoreo longitudinal de varios parámetros fisiológicos, incluida la actividad estimulada, la actividad no estimulada, el tamaño corporal, la geometría del movimiento, la duración de la salud y la supervivencia, en un entorno similar a la técnica estándar para el cultivo grupal en medios sólidos en placas de Petri. Este método es compatible con la recopilación de datos de alto rendimiento cuando se utiliza junto con software automatizado de microscopía y análisis. Finalmente, se discuten las limitaciones de esta técnica, así como una comparación de este enfoque con un método recientemente desarrollado que utiliza microbandejas para cultivar nematodos aislados en medios sólidos.

El sistema de cultivo WorMotel se puede utilizar para recopilar una variedad de datos, incluso sobre la vida útil, la duración de la salud y la actividad. Los estudios publicados han utilizado dispositivos de múltiples pocillos para estudiar la esperanza de vida y la duración de la salud 13,14, la quietud y el sueño 22,23,24, y el comportamiento 25.<sup class="xref"...

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Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Aquí se presenta un protocolo optimizado para cultivar nematodos individuales aislados en medios sólidos en dispositivos microfabricados de múltiples pocillos. Este enfoque permite que los animales individuales sean monitoreados a lo largo de sus vidas para una variedad de fenotipos relacionados con el envejecimiento y la salud, incluida la actividad, el tamaño y la forma del cuerpo, la geometría del movimiento y la supervivencia.

Cultivo a largo plazo y monitorización de Caenorhabditis elegans aislada en medios sólidos en dispositivos multipocillos

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

Cuando estudiamos el envejecimiento y los elegans marinos, generalmente seguimos una población de animales a lo largo del tiempo. Esto nos da una idea de lo que ese proceso que estás estudiando está haciendo en la población en cada punto de tiempo, pero no te dice cómo está cambiando el proceso en animales individuales a lo largo del tiempo. Estos entornos de cultivo animal individuales nos permiten seguir los cambios dinámicos en los procesos moleculares y los procesos fisiológicos en animales individuales a lo largo del tiempo para cientos de animales en paralelo.Encontramos que hay dos cosas principales que realmente pueden afectar la calidad de estos sistemas de cultivo de múltiples pozos. Uno es el secado excesivo o insuficiente de los pozos y el segundo es la contaminación. Y tratamos de anotar a lo largo del protocolo pasos específicos donde puede intentar mitigar estos problemas.Demostrando el protocolo hoy estará Emily Gardea. Ella es una técnica en mi laboratorio y ha trabajado mucho para optimizar este protocolo. Después de preparar todos los reactivos, mezcle 60 gramos de PDMS base y seis gramos de agente de curado por molde en un bote grande desechable utilizando una espátula desechable.Coloque la mezcla PDMS en una cámara de vacío durante 30 minutos a menos 0,08 Mega Pascal para eliminar las burbujas. Vierta y rellene la mezcla PDMS en cada molde impreso en 3D. Coloque el molde lleno y cualquier mezcla adicional de PDMS en la cámara de vacío durante 25 minutos a menos 0.08 Mega Pascal.Retire el molde lleno de la cámara de vacío y haga estallar las burbujas restantes con una espátula desechable. Comenzando con un borde, baje lentamente una lámina acrílica plana sobre el molde relleno de PDMS. Si se produce la formación de burbujas, proceda como se describe en el manuscrito.Coloque un peso de 2.5 libras en el acrílico y coloque los moldes pesados en el horno. Déjelos curar a 55 grados centígrados durante la noche. Al final de la incubación, retire los pesos y los moldes del horno.A continuación, trabaje una cuchilla de afeitar entre el acrílico y el PDMS curado Para romper el sello Con una navaja de afeitar o una espátula de metal, afloje con cuidado los lados del PDMS curado y retírelos del molde. Envuelva el dispositivo PDMS en papel de aluminio. Séllelo con cinta de autoclave y esterilícelo en autoclave en un ciclo seco durante al menos 15 minutos a 121 grados centígrados y 15 libras por pulgada cuadrada de presión manométrica.Para preparar el dispositivo de pocillos múltiples, precaliente una incubadora de baño de perlas secas a 90 grados centígrados. Desenvuelva un dispositivo multipocillo esterilizado en autoclave y corte una pequeña muesca en la esquina superior derecha del dispositivo. Coloque hasta tres dispositivos sin envolver en el limpiador de plasma con los pocillos hacia arriba y haga funcionar el limpiador de plasma.Esterilice una bandeja de poliestireno de un solo pozo por dispositivo rociando el interior de la bandeja con etanol al 70% y secándola con una toallita de tareas. Retire cada dispositivo del limpiador de plasma con una mano enguantada y colóquelo en una bandeja limpia. Luego coloque un recipiente de pipeta desechable de 25 mililitros en la incubadora de baño de perlas precalentada a 90 grados centígrados.Tome un tubo de premezcla LMNGM solidificada por dispositivo para llenarlo y colóquelo en un vaso de precipitados de vidrio de 200 mililitros. Retire la tapa y el Parafilm y el microondas hasta que el medio se derrita lo suficiente como para verter. Vierta la premezcla LMNGM fundida en otro vaso estéril de precipitados de 200 mililitros.Se pueden combinar múltiples tubos de ensayo en este vaso de precipitados si se llena más de un dispositivo a la vez. Calienta en el microondas la premezcla LMNGM durante 20 segundos adicionales. Si la premezcla comienza a hervir, detenga el microondas y deje que se asiente.Retire la premezcla LMNGM fundida del microondas y enfríela a 60 grados centígrados. Agregue los ingredientes restantes de LMNGM a la mezcla previa a la mezcla y vierta el LMNGM fundido en el recipiente de 25 mililitros en el baño de cuentas. Llene los pocillos del dispositivo con una pipeta repetidora multicanal de 200 microlitros.Ajuste el repetidor para dispensar alícuotas de 14 microlitros y monte cinco puntas de pipeta. Cargue las puntas con LMNGM fundido y dispense los primeros 14 microlitros de nuevo en el recipiente que contiene LMNGM. Moviéndose rápida pero cuidadosamente, dispense 14 microlitros en los pocillos internos del dispositivo y dispense el LMNGM restante de nuevo en el recipiente, ya que la alícuota final suele ser inferior a 14 microlitros.A continuación, configure el repetidor para dispensar alícuotas de 15 microlitros y llenar el anillo más externo de pozos. Usando una pipeta de 200 microlitros, dispense 200 microlitros de solución de sulfato de cobre en el foso del dispositivo en cada esquina. Evite llenar demasiado el foso y asegúrese de que el sulfato de cobre no toque la superficie superior de los pozos.Si el sulfato de cobre no fluye fácilmente a través de todo el foso, use un pico corto de alambre de platino para ayudar a romper la tensión y arrastre el sulfato de cobre a través del foso. Después de que el sulfato de cobre haya fluido a través de todo el foso, retire la mayor cantidad posible de sulfato de cobre usando una pipeta de 200 microlitros o aspiración con vacío. Con una botella de presión, agregue los cristales de agua en los espacios entre el dispositivo y las paredes de la bandeja.Cierre la tapa de la bandeja y envuelva los cuatro lados con un trozo de Parafilm. Agregue dos piezas adicionales de Parafilm para sellar la placa por completo. Usando una pipeta repetidora, localice cada pocillo con cinco microlitros de bacterias concentradas.Evite el contacto directo con la superficie LMNGM. Seque los dispositivos utilizando una caja de secado hecha a medida que se puede construir a un costo mínimo utilizando ventiladores de caja de computadora y filtros HEPA. Bajo un alcance de disección, inspeccione los pozos para asegurarse de que todos los pozos se hayan secado correctamente.Usando una púa de platino, transfiera los animales de las placas de gusanos preparadas y agregue un gusano por pozo. Agregue una gota de solución detergente preparada al interior de la tapa de la bandeja y frote con una toallita de tareas hasta que la solución detergente se haya secado. Envuelva la bandeja con tres piezas de Parafilm como se describe en el manuscrito.La extensión de la vida útil de daf-2 (RNAi) está bloqueada por la mutación nula daf-16. La media móvil de actividad de tres días a lo largo de la vida se reduce por daf-16 mutante y daf-2 (RNAi)Se muestra la variación en la esperanza de vida y la duración de la salud entre animales individuales en comparación con términos absolutos o como una fracción de la vida útil total. La actividad acumulada a lo largo de la vida de los animales individuales se correlaciona mejor con la esperanza de vida que la actividad de los animales individuales en un día específico a lo largo de la vida.Es importante llenar los pozos y agregar los gusanos lo más rápido posible. De lo contrario, los pozos pueden secarse y los gusanos no sobrevivirán. Este sistema es compatible con imágenes automatizadas que se pueden utilizar para recopilar datos de alto rendimiento, como la vida útil, la actividad y el tamaño o la forma del cuerpo.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Investigación

Biología

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse microscopía de embriogénesis temprana en Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

A largo plazo la cultura de muestras humanas del cáncer de pecho y su análisis mediante tomografía óptica de proyección

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Extracción y análisis de prostaglandina en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

El cultivo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; En axénico Liquid Media y Creación de transgénicos Worms por bombardeo de micropartículas

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...