Name: long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices
Uploaded: 2022-12-09T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH R35GM133588 till G.L.S., en United States National Academy of Medicine Catalyst Award till G.L.S., State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administrerad av Arizona Board of Regents och Ellison Medical Foundation.

1. Beredning av stamlösningar och media
OBS: Innan du börjar förbereda flerbrunnsanordningarna, förbered följande stamlösningar och media.
<ol><li>Stamlösningar för tillväxtmedier för nematoder (NGM) och NGM med låg smältning (lmNGM):<ol><li>Bered 1 MK2 HPO4: Tillsätt 174,18 g K2HPO4 till en 1 L flaska och fyll den upp till 1 L med sterilt avjoniserat vatten. Autoklav (121 °C, 15 psig) i 30 minuter och förvaras i rumstemperatur...

<ol>
	<li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+A+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: A quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+A+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: A micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10, 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A., Liu, X., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+imaging+and+manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic devices for imaging and manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. 13, 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9, 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Jushaj, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+criteria+for+locomotion-based+healthspan+evaluation+in+C.+elegans+using+the+WorMotel+system.">Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system.</a> PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>Espejo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+individual+Caenorhabditis+elegans+on+solid+media+for+longitudinal+fluorescence+monitoring+and+aversive+interventions.">Long-term culture of individual Caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Freitas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm+Paparazzi+-+A+high+throughput+lifespan+and+healthspan+analysis+platform+for+individual+Caenorhabditis+elegans.">Worm Paparazzi - A high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans.</a> University of Arizona. , (2021).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+High-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: High-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PLoS One. 8 (2), e57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Grubbs, J. J., vander Linden, A. M., Raizen, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+sleep+by+KIN-29+is+not+developmental.">Regulation of sleep by KIN-29 is not developmental.</a> microPublication Biology. 2020, (2020).</li><li>Iannacone, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RFamide+receptor+DMSR-1+regulates+stress-induced+sleep+in+C.+elegans.">The RFamide receptor DMSR-1 regulates stress-induced sleep in C. elegans.</a> eLife. 6, 19837 (2017).</li><li>McClanahan, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quiescent+state+following+mild+sensory+arousal+in+Caenorhabditis+elegans+is+potentiated+by+stress.">A quiescent state following mild sensory arousal in Caenorhabditis elegans is potentiated by stress.</a> Scientific Reports. 10, 4140 (2020).</li><li>Churgin, M. A., McCloskey, R. J., Peters, E., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+serotonergic+and+octopaminergic+neural+circuits+mediate+food-dependent+locomotory+behavior+in+Caenorhabditis+elegans.">Antagonistic serotonergic and octopaminergic neural circuits mediate food-dependent locomotory behavior in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (33), 7811-7823 (2017).</li><li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type.">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366 (6454), 461-464 (1993).</li><li>Murphy, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+act+downstream+of+DAF-16+to+influence+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans.">Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).</li><li>Hulme, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifespan-on-a-chip:+Microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C+.+elegans.">Lifespan-on-a-chip: Microfluidic chambers for performing lifelong observation of C . elegans.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li><li>Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+and+longitudinal+analysis+of+aging+and+senescent+decline+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput and longitudinal analysis of aging and senescent decline in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 965, 485-500 (2013).</li><li>Szewczyk, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+development+and+lifespan+extension+as+features+of+metabolic+lifestyle+alteration+in+C.+elegans+under+dietary+restriction.">Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C. elegans under dietary restriction.</a> The Journal of Experimental Biology. 209, 4129-4139 (2006).</li><li>Ghosh, R., Emmons, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Episodic+swimming+behavior+in+the+nematode+C.+elegans.">Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 211, 3703-3711 (2008).</li><li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swimming+exercise+and+transient+food+deprivation+in+Caenorhabditis+elegans+promote+mitochondrial+maintenance+and+protect+against+chemical-induced+mitotoxicity.">Swimming exercise and transient food deprivation in Caenorhabditis elegans promote mitochondrial maintenance and protect against chemical-induced mitotoxicity.</a> Scientific Reports. 8, 8359 (2018).</li><li>Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+database+of+Caenorhabditis+elegans+behavioral+phenotypes.">A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes.</a> Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).</li></ol>

WorMotel-systemet är ett kraftfullt verktyg för att samla in individualiserade data för hundratals isolerade C. elegans över tid. Efter de tidigare studierna med multibrunnsenheter för applikationer inom utvecklingslugn, rörelsebeteende och åldrande var målet med detta arbete att optimera förberedelsen av flerbrunnsenheter för långsiktig övervakning av aktivitet, hälsa och livslängd på ett högre genomströmningssätt. Detta arbete ger ett detaljerat protokoll för att förbereda flerbrunnsenheter...

Caenorhabditis elegans används ofta i åldrandestudier på grund av deras korta generationstid (cirka 3 dagar), korta livslängd (cirka 3 veckor), enkel odling i laboratoriet, hög grad av evolutionärt bevarande av molekylära processer och vägar med däggdjur och bred tillgänglighet av genetiska manipulationstekniker. I samband med åldrandestudier möjliggör C. elegans snabb generering av livslängdsdata och åldrade populationer för analys av sena fenotyper hos levande djur. Det typiska tillvägagångssättet för att genomföra maskåldringsstudier innefattar manuell mätning av livslängden hos en population av maskar som hålls i grupper om 20 till 70 djur på fasta agarnematodtillväxtmedier (NGM) i 6 cm Petri-plattor1. Genom att använda ålderssynkroniserade populationer kan man mäta livslängden eller tvärsnittsfenotyper hos enskilda djur över hela populationen, men denna metod utesluter övervakning av enskilda djurs egenskaper över tid. Detta tillvägagångssätt är också arbetsintensivt, vilket begränsar storleken på befolkningen som kan testas.
Det finns ett begränsat antal odlingsmetoder som möjliggör longitudinell övervakning av enskilda C. elegans under hela deras livslängd, och var och en har en distinkt uppsättning fördelar och nackdelar. Mikrofluidikanordningar, inklusive WormFarm2, NemaLife3 och "beteende" chip4, bland annat 5,6,7, möjliggör övervakning av enskilda djur över tid. Odling av maskar i flytande kultur med flerbrunnsplattor möjliggör på liknande sätt övervakning av antingen enskilda djur eller små populationer av C. elegans över tiden 8,9. Den flytande miljön representerar ett distinkt miljösammanhang från den vanliga odlingsmiljön på fasta medier i Petri-plattor, vilket kan förändra aspekter av djurfysiologi som är relevanta för åldrande, inklusive fettinnehåll och uttryck av stressresponsgener10,11. Möjligheten att direkt jämföra dessa studier med majoriteten av data som samlats in om åldrande C. elegans begränsas av skillnader i potentiellt viktiga miljövariabler. Worm Corral12 är ett tillvägagångssätt som utvecklats för att hysa enskilda djur i en miljö som närmare replikerar typisk solid mediekultur. Worm Corral innehåller en förseglad kammare för varje djur på ett mikroskopglas med hydrogel, vilket möjliggör longitudinell övervakning av isolerade djur. Denna metod använder standard ljusfältsavbildning för att registrera morfologiska data, såsom kroppsstorlek och aktivitet. Djur placeras dock i hydrogelmiljön som embryon, där de förblir ostörda under hela sin livslängd. Detta kräver användning av villkorligt steril mutant eller transgen genetisk bakgrund, vilket begränsar både kapaciteten för genetisk screening, eftersom varje ny mutation eller transgen måste korsas in i en bakgrund med villkorlig sterilitet, och kapaciteten för läkemedelsscreening, eftersom behandlingar endast kan tillämpas en gång på djuren som embryon.
En alternativ metod som utvecklats av Fang-Yen-laboratoriet möjliggör odling av maskar på fasta medier i enskilda brunnar i en mikrofabricerad polydimetylsiloxan (PDMS) -anordning som kallas WorMotel13,14. Varje enhet placeras i en bricka med en brunn (dvs. med samma dimensioner som en 96-brunnsplatta) och har 240 brunnar åtskilda av en vallgrav fylld med en aversiv lösning för att förhindra att maskarna reser mellan brunnar. Varje brunn kan hysa en enda mask under hela sin livslängd. Enheten är omgiven av vattenabsorberande polyakrylamidgelpellets (kallad "vattenkristaller") och brickan är förseglad med Parafilm laboratoriefilm för att bibehålla fuktigheten och minimera uttorkningen av mediet. Detta system gör det möjligt att samla in data om hälsa och livslängd för enskilda djur, medan användningen av fasta medier bättre rekapitulerar miljön som djuren upplever i de allra flesta publicerade C. elegans livslängdsstudier, vilket möjliggör mer direkta jämförelser. Nyligen har en liknande teknik utvecklats med användning av polystyrenmikrobrickor som ursprungligen användes för mikrocytotoxicitetsanalyser15 i stället för PDMS-enheten16. Mikrobrickmetoden möjliggör insamling av individualiserade data för maskar odlade på fasta medier och har förbättrad kapacitet för att innehålla maskar under förhållanden som vanligtvis skulle orsaka flykt (t.ex. stressorer eller kostbegränsning), med avvägningen att varje mikrobricka endast kan innehålla 96 djur16, medan multibrunnsenheten som används här kan innehålla upp till 240 djur.
Här presenteras ett detaljerat protokoll för beredning av flerbrunnsenheter som är optimerat för platt-till-platt-konsistens och förberedelse av flera enheter parallellt. Detta protokoll anpassades från det ursprungliga protokollet från Fang-Yen-laboratoriet13. Specifikt finns det beskrivningar för tekniker för att minimera kontaminering, optimera konsekvent torkning av både det fasta mediet och den bakteriella matkällan och leverera RNAi och läkemedel. Detta system kan användas för att spåra individuell hälsa, livslängd och andra fenotyper, såsom kroppsstorlek och form. Dessa multi-well-enheter är kompatibla med befintliga system med hög genomströmning för att mäta livslängden, vilket kan ta bort mycket av det manuella arbetet som är involverat i traditionella livslängdsexperiment och ge möjlighet till automatiserad, direkt livslängdsmätning och hälsospårning i enskilda C. elegans i stor skala.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.5 lb weight</td>
			<td>CAP Barbell</td>
			<td>RP-002.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic sheets (6 in x 4 in x 3/8 in)</td>
			<td>Falken Design</td>
			<td>ACRYLIC-CL-3-8/1224</td>
			<td>Large sheet cut to smaller sizes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable squeeze bottle</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>2405-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basin, 25 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89094-664</td>
			<td>Disposable pipette basin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabinet style vacuum desiccator&#160;</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42400-4001</td>
			<td>Do not need to use dessicant, only using as a vacuum chamber.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin&#160;</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>360902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed oxygen tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C493-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry bead bath incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-718-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floxuridine</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>731-0177</td>
			<td>Used to cure PDMS mixture, any similar oven will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubators</td>
			<td>Shel Lab</td>
			<td>2020</td>
			<td>20 &#176;C incubator for maintaining worm strains and 37 &#176;C incubator to grow bacteria&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P286-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Sharp</td>
			<td>R-530DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel repeat pipette, 20&#8211;200 &#181;L LTS EDP3</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17013800</td>
			<td>The exact model used is no longer sold, a similar model&#39;s catalog number has been provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td>Clear polystyrene trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td>Double-wide (4 in)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 100 mM&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plate, 60 mM&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Plasma Etch, Inc.</td>
			<td>PE-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLATINUM vacuum pump</td>
			<td>JB Industries</td>
			<td>DV-142N&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyJet 3D printer</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>Objet500 Connex3</td>
			<td>PolyJet 3D printing services provided by ProtoCAM (Matrial: Vero Rigid; Finish: Matte; Color: Gloss; Resolution: X-axis: 600 dpi, Y-axis: 600 dpi, Z-axis: 1600 dpi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td>3526CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smartSpatula</td>
			<td>LevGo, Inc.</td>
			<td>17211</td>
			<td>Disposable spatula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superabsorbent polymer (AgSAP Type S)</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Referred to in main text as &#34;water crystals&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer base</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer curing agent</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>2085925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Nest Scientific USA Inc.&#160;</td>
			<td>380111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 10 mL&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14955453</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump oil</td>
			<td>VWR</td>
			<td>54996-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroBlackPlus</td>
			<td>Stratasys&#160;</td>
			<td>RGD875</td>
			<td>Rigid 3D printing filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boat</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>WB30304</td>
			<td>Large enough for PDMS mixture volume</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture and monitoring of isolated caenorhabditis elegans on solid media in multi-well devices

Nematoden Caenorhabditis elegans är bland de vanligaste modellsystemen som används inom åldringsforskning på grund av dess enkla och billiga odlingstekniker, snabba reproduktionscykel (~3 dagar), korta livslängd (~3 veckor) och många tillgängliga verktyg för genetisk manipulation och molekylär analys. Det vanligaste tillvägagångssättet för att genomföra åldringsstudier i C. elegans, inklusive överlevnadsanalys, innebär odling av populationer av tiotals till hundratals djur tillsammans på fasta nematodtillväxtmedier (NGM) i Petri-plattor. Även om detta tillvägagångssätt samlar in data om en population av djur, spårar de flesta protokoll inte enskilda djur över tid. Här presenteras ett optimerat protokoll för långsiktig odling av enskilda djur på mikrofabricerade polydimetylsiloxanenheter (PDMS) som kallas WorMotels. Varje anordning gör det möjligt att odla upp till 240 djur i små brunnar som innehåller NGM, där varje brunn isoleras av en kopparsulfathaltig vallgrav som hindrar djuren från att fly. Baserat på den ursprungliga WorMotel-beskrivningen ger detta dokument ett detaljerat protokoll för gjutning, förberedelse och fyllning av varje enhet, med beskrivningar av vanliga tekniska komplikationer och råd för felsökning. Inom detta protokoll finns tekniker för konsekvent laddning av NGM med små volymer, konsekvent torkning av både NGM och bakteriemat, alternativ för att leverera farmakologiska ingrepp, instruktioner för och praktiska begränsningar för återanvändning av PDMS-enheter och tips för att minimera uttorkning, även i miljöer med låg luftfuktighet. Denna teknik möjliggör longitudinell övervakning av olika fysiologiska parametrar, inklusive stimulerad aktivitet, ostimulerad aktivitet, kroppsstorlek, rörelsegeometri, hälsospan och överlevnad, i en miljö som liknar standardtekniken för gruppkultur på fasta medier i Petri-plattor. Denna metod är kompatibel med datainsamling med hög genomströmning när den används tillsammans med automatiserad mikroskopi och analysprogramvara. Slutligen diskuteras begränsningarna med denna teknik, liksom en jämförelse av detta tillvägagångssätt med en nyligen utvecklad metod som använder mikrobrickor för att odla isolerade nematoder på fasta medier.

WorMotels kultursystem kan användas för att samla in en mängd olika data, bland annat om livslängd, hälsa och aktivitet. Publicerade studier har använt multi-well-enheter för att studera livslängd och hälsa 13,14, lugn och sömn 22,23,24 och beteende 25. Livslängden kan poängsättas manuellt eller genom en samling bilder och nedströms ...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices at JoVE.com

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Här presenteras ett optimerat protokoll för odling av isolerade enskilda nematoder på fasta medier i mikrofabricerade flerbrunnsanordningar. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för enskilda djur att övervakas under hela livet för en mängd olika fenotyper relaterade till åldrande och hälsa, inklusive aktivitet, kroppsstorlek och form, rörelsegeometri och överlevnad.

Långtidsodling och övervakning av isolerade Caenorhabditis elegans på fasta medier i flerbrunnsenheter

The nematode Caenorhabditis elegans is among the most common model systems used in aging research owing to its simple and inexpensive culture techniques, ...

När vi studerar åldrande och havseleganer följer vi vanligtvis en population av djur över tiden. Detta ger oss en glimt av vad den processen du studerar gör i befolkningen vid varje tidpunkt, men det berättar inte hur processen förändras hos enskilda djur över tiden. Dessa enskilda djurkulturmiljöer gör det möjligt för oss att följa dynamiska förändringar i molekylära processer och fysiologiska processer hos enskilda djur över tid för hundratals djur parallellt.Vi finner att det finns två viktiga saker som verkligen kan påverka kvaliteten på dessa multi-well kultursystem. En är antingen över eller under torkning av brunnarna och den andra är förorening. Och vi försöker notera i hela protokollet specifika steg där du kan försöka mildra dessa problem.Demonstrerar protokollet idag kommer att vara Emily Gardea. Hon är tekniker i mitt labb och har gjort mycket arbete för att optimera detta protokoll. Efter beredning av alla reagens, blanda 60 gram PDMS-bas och sex gram härdningsmedel per form i en stor engångsbåt med en engångsspatel.Placera PDMS-blandningen i en vakuumkammare i 30 minuter vid minus 0,08 Mega Pascal för att ta bort bubblor. Häll och fyll PDMS-blandningen i varje 3D-tryckt form. Sätt den fyllda formen och eventuell extra PDMS-blandning i vakuumkammaren i 25 minuter vid minus 0,08 Mega Pascal.Ta bort den fyllda formen från vakuumkammaren och poppa eventuella kvarvarande bubblor med en engångsspatel. Börja med en kant, sänk långsamt ett platt akrylark ovanpå den PDMS-fyllda formen. Om bubbelbildning uppstår, fortsätt enligt beskrivningen i manuskriptet.Lägg en vikt på 2,5 pund på akrylen och placera de viktade formarna i ugnen. Låt dem härda vid 55 grader Celsius över natten. Vid slutet av inkubationen, ta bort vikterna och formarna från ugnen.Arbeta sedan ett rakblad mellan akryl och härdat PDMS För att bryta tätningen Använd en rakhyvel eller en metallspatel, lossa försiktigt sidorna på det härdade PDMS och ta bort dem från formen. Förpacka PDMS-enheten i aluminiumfolie. Försegla den med autoklavtejp och sterilisera genom autoklav på en torr cykel i minst 15 minuter vid 121 grader Celsius och 15 pund per kvadrattum mättryck.För att förbereda multibrunnsanordningen, förvärm en torr pärlbadinkubator till 90 grader Celsius. Packa upp en autoklaverad multibrunnsenhet och skär ett litet hack i enhetens övre högra hörn. Placera upp till tre oinslagna enheter i plasmarenaren med brunnarna uppåt och kör plasmarenaren.Sterilisera en polystyrenbricka med en brunn per enhet genom att spraya insidan av brickan med 70% etanol och torka den torr med en arbetsduk. Ta bort varje enhet från plasmarenaren med en handske och placera den i ett rengjort fack. Placera sedan ett 25 ml engångspipettbassäng i pärlbadinkubatorn förvärmd vid 90 grader Celsius.Ta ett rör stelnad LMNGM-förblandning per enhet som ska fyllas och placera det i en 200 ml glasbägare. Ta av locket och Parafilm och mikrovågsugn tills mediet smälter tillräckligt för att hälla. Häll den smälta LMNGM-förblandningen i en annan steril 200 ml-bägare.Flera provrör kan kombineras i denna bägare om mer än en enhet fylls åt gången. Mikrovågsugn LMNGM-förblandningen i ytterligare 20 sekunder. Om förblandningen börjar koka över, stoppa mikrovågsugnen och låt den sätta sig.Ta bort den smälta LMNGM-förblandningen från mikrovågsugnen och kyla den till 60 grader Celsius. Tillsätt de återstående LMNGM-ingredienserna till förblandningsblandningen och häll den smälta LMNGM i 25 ml-bassängen i pärlbadet. Fyll enhetens brunnar med en 200 mikroliter flerkanalig repeaterpipett.Ställ in repeatern på att dosera alikvoter på 14 mikroliter och montera fem pipettspetsar. Fyll spetsarna med smält LMNGM och fördela de första 14 mikroliterna tillbaka i LMNGM-innehållande bassängen. Rör dig snabbt men försiktigt, fördela 14 mikroliter i enhetens inre brunnar och fördela återstående LMNGM tillbaka i bassängen eftersom den slutliga alikvoten vanligtvis är mindre än 14 mikroliter.Ställ sedan in repeatern för att dispensera alikvoter på 15 mikroliter och fyll den yttersta brunnsringen. Använd en 200 mikroliter pipett och fördela 200 mikroliter kopparsulfatlösning i enhetens vallgrav i varje hörn. Undvik överfyllning av vallgraven och se till att kopparsulfatet inte vidrör brunnarnas övre yta.Om kopparsulfatet inte flyter lätt genom hela vallgraven, använd en kort platinatrådplockning för att bryta spänningen och dra kopparsulfatet genom vallgraven. Efter att kopparsulfatet har flödat genom hela vallgraven, ta bort så mycket kopparsulfat som möjligt med en 200 mikroliter pipett eller aspiration med vakuum. Använd en pressflaska, tillsätt vattenkristallerna i mellanrummen mellan enheten och brickväggarna.Stäng bricklocket och linda alla fyra sidorna med en bit Parafilm. Lägg till ytterligare två Parafilm-bitar för att försegla plattan helt. Använd en repeaterpipett, spot varje brunn med fem mikroliter koncentrerade bakterier.Undvik direktkontakt med LMNGM-ytan. Torka enheterna med en specialbyggd torklåda som kan konstrueras till minimal kostnad med hjälp av datorfläktar och HEPA-filter. Under ett dissektionsområde, inspektera brunnar för att säkerställa att alla brunnar har torkat framgångsrikt.Använd en platinaplockning, överför djuren från de förberedda maskplattorna och tillsätt en mask per brunn. Tillsätt en droppe beredd tvättmedelslösning på insidan av bricklocket och gnugga med en arbetsduk tills tvättmedelslösningen har torkat. Slå in brickan med tre bitar Parafilm enligt beskrivningen i manuskriptet.Livslängdsförlängningen från daf-2(RNAi)blockeras av daf-16-nollmutationen. Hälsospannet minskade också i närvaro av daf-2(RNAi)Det tre dagars rullande medelvärdet av aktivitet över livslängden reduceras med daf-16-mutant och daf-2(RNAi)Variationen i livslängd och hälsospann mellan enskilda djur jämfört antingen i absoluta termer eller som en bråkdel av den totala livslängden visas. Den kumulativa aktiviteten över livslängden för enskilda djur korrelerar bättre med livslängden än aktiviteten för enskilda djur på en viss dag under hela livslängden.Det är viktigt att fylla brunnarna och lägga till maskarna så snabbt som möjligt. Annars kan brunnarna torka ut och maskarna kommer inte att överleva. Detta system är kompatibelt med automatiserad bildbehandling som kan användas för att samla in data med hög genomströmning som livslängd, aktivitet och kroppsstorlek eller form.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture and Monitoring of Isolated Caenorhabditis elegans on Solid Media in Multi-Well Devices

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Mätning Caenorhabditis elegans Livslängd på fasta medier

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-baserade dietrestriktioner i Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Långsiktig kultur för mänskliga Prover bröstcancer och deras analys Använda optisk Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Långsiktig Dödligt toxicitetstest med Crustacean Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraktion och analys i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Odling<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; I axenisk Liquid Media och Skapande av transgena maskarna från mikropartikelbombardemang

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolering, Transfection, och långsiktig kultur av vuxna Mus och Råtta Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Etikettfri bildbehandling av Lipid Storage Dynamics i Caenorhabditis elegans med stimulerad Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...