Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
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这项工作得到了NIH R35GM133588对GLS，NIHT32GM008659培训补助金给L.E.的支持，美国国家医学院催化剂奖给GLS，以及亚利桑那州技术和研究计划基金由亚利桑那州董事会管理。

1. 食谱
注意：在开始微托盘板制备之前准备储备溶液。
<ol><li>低熔点琼脂糖线虫生长培养基 （lmNGM） 的储备溶液<ol><li>通过将 174.18 g K2HPO4 溶解在 1 L 瓶中的 1 L 无菌去离子水中来制备 1 MK 2HPO4。将溶液在121°C，15psi下高压灭菌30分钟，并将其储存在室温（RT）下。</li>
		<li>通过将136.09gKH2HPO4溶解在1L无菌去离子水中制备1M KP<...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research.">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021)</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

在这里，我们描述了一种新的培养系统，该系统适应最初为人类白细胞抗原组织分型测定开发的微托盘，以允许在固体培养基环境中随着时间的推移分离和表征单个 秀丽隐杆 线虫，该环境在上下文中类似于基于琼脂的NGM，这是 秀丽隐杆线虫 研究的标准。该系统与各种干预措施兼容，包括饮食限制、外源性药物治疗、化学或环境压力源的挑战以及 RNAi。它进一步允许纵向监测个体 <em...

秀丽隐杆线虫是遗传学、细胞生物学和分子生物学研究的强大模式生物，因为它们易于在实验室中培养，生成时间和寿命短，与哺乳动物共享高度的蛋白质同源性，并且具有透明的身体结构，可以对荧光蛋白和染料进行体内可视化1。由于秀丽隐杆线虫在包括发育生物学和衰老在内的一系列领域长期使用作为主要模型系统，它们的生长和发育得到了很好的理解，它们的基因组已经完全测序，并且已经创建了一系列强大的遗传工具，包括全基因组RNAi喂养文库和数千种突变和转基因菌株。从历史上看，秀丽隐杆线虫在固体琼脂线虫生长培养基（NGM）上作为种群培养，并且通过直接观察或通过成像和下游分析手动评估表型。荧光显微镜用于在单个秀丽隐杆线虫中使用染料或转基因表达的荧光标签捕获各种分子表型。荧光成像通常涉及在含有薄琼脂糖垫的载玻片上固定或麻痹动物，这是侵入性的，通常是致命的。它还涉及使用化学品，例如左旋咪唑或叠氮化钠，这可能会干扰感兴趣的分子过程2，3。总之，这些方法允许在广泛的表型中收集横断面，种群水平的数据，但不允许随着时间的推移跟踪单个动物。
近年来，出现了几种培养分离秀丽隐杆线虫的方法，使研究人员能够利用新的成像技术捕获动物生理和分子表型随时间变化的动态变化。一类秀丽隐杆线虫培养方法是微流体装置，包括WormFarm4，Nemalife芯片5和Chronis等人的“行为”芯片6，以及其他各种7，8，9。与此相关的是基于液体的培养方法，该方法使用多孔板来表征单个蠕虫或随时间变化的小种群10，11。微流体和微孔板系统可以对秀丽隐杆线虫到单个动物的表型反应进行出色的定量测量，但培养环境存在关键限制。过去对秀丽隐杆线虫的绝大多数研究，特别是在衰老领域，都是在固体琼脂基培养基上完成的。液体培养使秀丽隐杆线虫不断游泳，并代表了一种独特的环境背景，可以改变潜在的生物学。例如，与在琼脂基固体NGM12，13上培养的动物相比，在液体培养基培养基中培养的动物具有显着改变的脂肪含量和基因表达 - 特别是对于参与应激反应的基因。另一类单一动物成像方法涉及在固体培养基上分离单个动物的聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置，以更紧密地模拟在培养皿上的群体培养中在固体NGM上培养的蠕虫所经历的标准环境。WorMotel是一款240孔PDMS设备，设计用于在固体培养基上培养个体动物。每个孔都填充使用低熔点琼脂糖代替琼脂的改良NGM，并接种细菌食物，形成类似于使用培养皿的最常见培养系统的固体培养基环境。井壁是圆形的，无论在孔中的位置如何，都可以对每只动物进行成像（避免多孔板中动物靠近壁造成的视觉遮挡）。每口井周围狭窄护城河中的硫酸铜被用作威慑动物在井中14，15。这种方法的局限性在于，当存在厌恶的环境条件（包括饮食限制、致病菌或诱发细胞应激的化学物质（例如百草枯））时，硫酸铜无法有效防止蠕虫逃跑。
第二个使用固体介质的系统是蠕虫畜栏，它采用水凝胶为载玻片上的每条蠕虫创建一个小型密封环境，允许对单独分离的动物进行长期监测16。一个关键的限制是动物必须作为卵子密封在环境中，需要使用不育动物来防止繁殖，并将药物治疗限制在单一应用。多剂量药物试验可以在WorMotel中完成，方法是在将蠕虫转移到设备之前进行多露，或者在实验期间向孔中局部添加其他药物;然而，在后一种情况下，向现有孔中添加额外药物后的实际暴露剂量难以精确量化，并且取决于药物降解的速度。WorMotel和Worm Corral都非常适合明场或暗场成像，以捕获与活动和动物生理学（例如生长和发育）相关的信息。虽然这些系统可用于监测荧光，但根据我们的经验，用于创建其他单虫成像技术的PDMS容易形成微泡，捕获颗粒和其他小异常，产生不规则的荧光伪影，干扰一致的荧光可视化和定量，特别是在GFP的发射范围内，GFP是 秀丽隐杆线虫 研究中最常用的荧光团。迄今为止， 秀丽隐杆线虫 个体动物的纵向实时荧光成像主要依赖于微流体装置17。
在这里，我们描述了一种在固体培养基上培养单个 秀丽隐杆线虫 的新方法，该方法与厌恶干预和直接荧光成像兼容。这种方法在概念上与其他单蠕虫成像技术相似，只是定制模制的PDMS芯片被最初为微细胞毒性测定开发的市售聚苯乙烯微托盘（通常也称为寺崎托盘）所取代18。这些微托盘具有可以填充固体培养基并接种细菌食物的孔，与标准固体NGM培养方法下的动物所经历的环境非常相似。每口井都被棕榈酸而不是硫酸铜的厌恶屏障包围。棕榈酸通常用于防止蠕虫逃离固体培养基，在实验中使用培养皿上的标准组培养物，其中蠕虫受到厌恶环境（如饮食限制或暴露于化学应激源）的挑战。微托盘还产生最小且一致的荧光背景，允许直接在动物的培养环境中对动物进行荧光成像。这种基于琼脂的新型单动物固体培养系统不仅可以跟踪个体动物的整个生命并监测生长、发育、活动和寿命，而且还与直接荧光显微镜兼容。由于蠕虫可以在没有麻痹或固定的情况下成像，因此可以在留在培养基上的个体动物中纵向量化体内荧光生物标志 物，从而 可以观察每只动物一生中的动态变化。该培养系统还与用于跟踪寿命和其他健康指标的当前一代自动化系统兼容14，19。我们提供了在这个基于微托盘的系统中培养单个 秀丽隐杆线虫 的详细协议，讨论了潜在的陷阱和故障排除，并讨论了相对于其他系统的优势和局限性，特别是更新和优化的WorMotel协议15。
每个单虫培养环境由一个微型托盘组成，该微托盘使用定制的3D打印适配器安装在标准单孔托盘内（图1A）。孔中充满低熔点琼脂糖线虫生长培养基（lmNGM），接种浓缩细菌作为食物来源，并被棕榈酸涂层包围以防止蠕虫逃跑（图1B）。微托盘和单孔板壁之间的空间充满饱和水晶体以保持湿度（图1B）。在托盘盖上涂上洗涤剂涂层以防止冷凝。每个孔中加入一个蠕虫，单孔托盘用石蜡膜密封以保持水分并允许氧气交换。一个经验丰富的研究人员可以合理地并行制备多达六个微量托盘。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

秀丽隐杆线虫 被广泛用于研究衰老生物学。 秀丽隐杆 线虫衰老研究的标准做法是在固体线虫生长培养基（NGM）上培养蠕虫群，从而可以有效地收集存活和其他生理表型的种群水平数据，并定期对亚群进行采样以进行荧光生物标志物定量。这种方法的局限性在于无法（1）随着时间的推移跟踪单个蠕虫，以开发感兴趣的表型的年龄轨迹，以及（2）直接在培养环境中监测荧光生物标志物。替代培养方法使用液体培养或微流体来监测单个动物随时间的变化，在某些情况下包括荧光定量，但代价是培养环境在上下文中与固体NGM不同。WorMotel是前面描述的微加工多孔装置，用于在固体NGM上培养分离的蠕虫。每条蠕虫都保存在含有固体NGM的井中，周围环绕着充满硫酸铜的护城河，硫酸铜是 秀丽隐杆线虫的接触驱虫剂，可以对个体动物进行纵向监测。我们发现硫酸铜不足以防止蠕虫在受到衰老研究中常见的厌恶性干预时逃跑，包括饮食限制、致病菌和诱导细胞应激的化学制剂。多孔设备也由聚二甲基硅氧烷模制而成，在荧光成像中会产生高背景伪影。该协议描述了一种使用市售聚苯乙烯微托盘在固体NGM上培养分离蛔虫的新方法，最初设计用于人白细胞抗原（HLA）分型，允许在整个生命周期内测量存活，生理表型和荧光。棕榈酸屏障可防止蠕虫逃跑，即使在存在厌恶条件的情况下也是如此。每个平板可以培养多达 96 只动物，并轻松适应各种条件，包括饮食限制、RNAi 和化学添加剂，并与用于收集寿命和活动数据的自动化系统兼容。

这里描述的基于微托盘的单虫培养环境可用于监测各种表型，包括寿命和健康跨度、活动和运动、体型和爬行几何形状，以及随着时间的推移在个体动物中转基因表达的荧光生物标志物的表达。微托盘培养系统通过手动评分或图像采集和下游成像分析与寿命分析兼容。与培养皿21上的标准培养一样，可以根据刺激后的运动（例如，敲击平板或暴露在蓝光下）手动将蠕虫评分为死?...

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Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

在这里，我们提出了一种在固体培养基上培养分离的单个线虫的协议，用于终身生理参数跟踪和荧光定量。该培养系统包括单虫孔周围的棕榈酸屏障，以防止动物逃跑，允许使用厌恶性干预措施，包括致病细菌和化学应激源。

在固体培养基上长期培养单个 秀丽隐杆线虫 ，用于纵向荧光监测和厌恶干预

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

虽然存在其他固体培养方法，但这是第一个固体培养系统，可以在一个系统中自动纵向跟踪个体动物的生命和健康跨度以及荧光生物标志物的纵向成像。该协议提供与固体NGM上的标准秀丽隐杆线虫实验相当的结果，与厌恶干预和直接实时荧光成像兼容。该系统对于衰老研究将是无价的，特别是关于长期暴露于环境压力源和长期观察基因和蛋白质动力学。避免污染和在井中实现一致的干燥都是具有挑战性的。我们强调了书面协议中的关键点，以尽量减少这些问题。首先，在研钵和研杵中研磨500毫克固体棕榈酸。将其与 15 毫升吐温 20 在 50 毫升锥形小瓶中混合，并通过涡旋混合以溶解晶体。加入17.5毫升100%乙醇，涡旋溶液以溶解尽可能多的棕榈酸。然后加入17.5毫升超纯水，剧烈涡旋。在80摄氏度的珠浴中轻轻加热溶液，直到棕榈酸完全溶解。将珠浴重新加热至 80 摄氏度。使用前，将每个微托盘中的棕榈酸工作溶液分装一毫升到单独的无菌容器中，并在加热前每一毫升棕榈酸溶液中加入四微升制霉菌素。现在用乙醇在微托盘内外喷洒至饱和，然后甩掉多余的乙醇。要对微托盘进行灭菌，请将板和盖子分别放入UV交联剂中。20分钟后，翻转盘子和盖子。接下来，将装有棕榈酸工作溶液的15毫升锥形小瓶放入珠浴中，并在使用前让任何可见晶体完全溶解。将微托盘放在珠浴周围的壁架上并盖上盖子两分钟，以预热微托盘。取下微托盘盖，在微托盘后壁上缓慢加入200微升棕榈酸工作溶液。盖上盖子，让微托盘在珠浴上放置两到三分钟，让棕榈酸溶液沉淀在微托盘的底部。将微托盘旋转180度，然后如前所述加入棕榈酸工作溶液。通过添加手稿中描述的组件来制备lmNGM。然后将 20 微升 lmNGM 移液到放置在工作台上的每个微托盘中。重新填充移液器时，请务必盖上微量托盘，以尽量减少污染。为了用细菌食物播种微托盘孔，将以3， 500 G生长过夜的培养物离心20分钟。除去上清液，并用85毫摩尔氯化钠溶液以十倍浓度重悬细菌培养物。然后小心地将五微升十倍浓缩的细菌培养物移液到每个孔中的lmNGM表面上。避免让细菌培养物越过孔的侧面并进入棕榈酸，因为这会吸引蠕虫离开孔。将无菌3D打印插入物放入无菌单孔板中。将微托盘放入单孔板中的3D打印适配器中。在微托盘外孔和单孔板内壁之间的3D打印插入物顶部自由分配水晶体。如果没有立即添加蠕虫，请密封微托盘以备第二天使用。合上托盘盖，用单片封口膜包裹所有四个侧面以密封微托盘。用石蜡膜重复密封步骤两次，共三层。一旦它们达到所需的生命阶段，每孔添加一个蠕虫。将40微升洗涤剂溶液加入单孔板的盖子上，并使用工作擦拭均匀地涂覆盖子。使用额外的工作湿巾涂抹洗涤剂溶液，直到通过盖子的视力不失真。稍微拉伸第一片石蜡像，以覆盖托盘的两侧。用任务擦拭擦拭托盘顶部，并用 70% 乙醇将其浸湿以去除任何指纹。通过轻轻敲击盘子的侧面或顶部，或在盘子上照射明亮的蓝光并观察每只动物来测量寿命。如果动物在几秒钟内没有移动，则对其进行评分。每隔一到三天重复一次此任务，直到所有蠕虫都死亡。对单孔进行荧光成像。暴露于硫酸铜和二硫苏糖醇会显着缩短蠕虫的寿命和健康寿命。相比之下，硫酸铜降低了健康生活的比例，而二硫苏糖醇则没有。硫酸铜在所有年龄段降低人群中个体的平均活性的程度大于二硫苏糖醇。终生活动曲线下个体动物面积的种群平均值受到硫酸铜或二硫苏糖醇的显着损害。个体动物的累积活动直到第10天与二硫苏糖醇挑战动物的寿命相关，但与未处理的对照或硫酸铜攻击动物的寿命无关。在成年期的第3天和第8天之间观察到KYNU-1表达急剧增加，之后随着年龄的增长而逐渐下降。成年期第14天的累积KYNU-1 mScarlet表达与动物寿命相关。由于KYNU-1的表达在整个生命周期中都是动态的，我们将不同年龄的KYNU-1表达与个体动物的总生存率进行了比较。没有一个时间点KYNU-1表达与存活率显着相关。尝试此过程时，最重要的步骤是添加棕榈酸，移液琼脂并引入蠕虫。该技术允许纵向跟踪寿命和健康寿命，以及单个蠕虫中的荧光生物标志物，其方式可直接与NGM测定相媲美。

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

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测量线虫固体介质的寿命

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

科研

生物学

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

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实心板为基础的饮食限制在线虫</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

长期培养的人类乳腺癌标本，并利用光学投影层析成像分析

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

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致命的甲壳类动物长期毒性试验卤虫franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

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基本的<em&gt;线虫</em&gt;方法：同步和观察

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

多层安装于斑马鱼的长期光表镜

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

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培养<em&gt;秀丽隐杆线虫</em &gt;在无菌液体介质与创造转基因蠕虫通过微粒轰击

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

成年小鼠和大鼠心肌细胞的隔离、转染和长期培养

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

使用刺激拉曼散射显微镜对 卡诺哈布迪炎电子人 中的脂质存储动力学进行无标签成像

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

在固体培养基上长期培养单个 秀丽隐杆线虫 ，用于纵向荧光监测和厌恶干预

在固体培养基上长期培养单个秀丽隐杆线虫，用于纵向荧光监测和厌恶干预