Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH R35GM133588 til G.L.S., et NIHT32GM008659 træningsstipendium til L.E., en United States National Academy of Medicine Catalyst Award til G.L.S. og State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administreret af Arizona Board of Regents.

1. Opskrifter
BEMÆRK: Forbered stamopløsninger, inden du starter forberedelsen af mikrobakkepladen.
<ol><li>Stamopløsninger til lavsmeltet agarosenematodevækstmedier (lmNGM)<ol><li>Der fremstilles 1 M K2HPO4 ved at opløse 174,18 gK2HPO4i1 liter sterilt deioniseret vand i en 1 liter flaske. Opløsningen autoklaveres ved 121 °C, 15 psi, i 30 minutter og opbevares ved stuetemperatur (RT).</li>
		<li>Der fremstilles 1 M KP i (pH6,0</su...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research.">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021)</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

Her beskriver vi et nyt kultursystem, der tilpasser mikrobakker, oprindeligt udviklet til humane leukocytantigenvævstypeassays, for at muliggøre isolering og karakterisering af enkelte C. elegans over tid i et solidt mediemiljø, der kontekstuelt ligner den agarbaserede NGM, der er standarden i C. elegans-forskning. Dette system er kompatibelt med en række interventioner, herunder diætbegrænsning, eksogen lægemiddelbehandling, en udfordring med kemiske eller miljømæssige stressfaktorer og RNAi...

C. elegans er en stærk modelorganisme til forskning inden for genetik, cellulær biologi og molekylærbiologi, fordi de let dyrkes i laboratoriet, har en kort generationstid og levetid, deler en høj grad af proteinhomologi med pattedyr og har en gennemsigtig kropsstruktur, der tillader in vivo-visualisering af fluorescerende proteiner og farvestoffer1. Som et resultat af den mangeårige brug af C. elegans som et vigtigt modelsystem på en række områder, herunder udviklingsbiologi og aldring, er deres vækst og udvikling godt forstået, deres genom er blevet fuldt sekventeret, og en lang række kraftfulde genetiske værktøjer er blevet skabt, herunder genom-wide RNAi fodring biblioteker og tusindvis af mutante og transgene stammer. Historisk set dyrkes C. elegans som populationer på fast agarnematodevækstmedie (NGM), og fænotyper evalueres manuelt enten ved direkte observation eller ved billeddannelse og nedstrømsanalyse. Fluorescerende mikroskopi bruges til at fange en række molekylære fænotyper ved hjælp af farvestoffer eller transgent udtrykte fluorescerende tags i individuelle C. elegans. Fluorescerende billeddannelse involverer typisk fastsættelse eller lammelse af et dyr på dias, der indeholder tynde agarosepuder, hvilket er invasivt og ofte dødeligt. Det involverer også brugen af kemikalier, såsom levamisol eller natriumazid, som potentielt kan forstyrre den molekylære proces af interesse 2,3. Tilsammen gør disse tilgange det muligt at indsamle tværsnitsdata på populationsniveau på tværs af en bred vifte af fænotyper, men tillader ikke sporing af individuelle dyr over tid.
I de senere år er der opstået flere tilgange til dyrkning af isolerede C. elegans, hvilket gør det muligt for forskere at fange dynamiske ændringer i fysiologiske og molekylære fænotyper af dyr over tid ved hjælp af nye billeddannelsesteknologier. En kategori af C. elegans kultur tilgang er mikrofluidik enheder, herunder WormFarm4, Nemalife chip5, og 'adfærd' chip af Chronis et al.6, blandt forskellige andre 7,8,9. Relateret til disse er væskebaserede dyrkningsmetoder, der bruger multibrøndplader til at karakterisere individuelle orme eller små populationer over tid10,11. Mikrofluidik og mikropladesystemer giver fremragende kvantitative målinger af fænotypiske reaktioner i C. elegans ned til et enkelt dyr, men kulturmiljøet udgør en vigtig begrænsning. Langt størstedelen af tidligere forskning i C. elegans, især inden for aldring, er blevet afsluttet på faste agarbaserede medier. Flydende kultur får C. elegans til at svømme kontinuerligt og repræsenterer en særskilt miljømæssig kontekst, der kan ændre den underliggende biologi. For eksempel har dyr, der dyrkes i flydende medier, drastisk ændret fedtindhold og genekspression - især for gener, der er involveret i stressresponsen - i forhold til dyr, der dyrkes på agarbaseret fast NGM12,13. En alternativ kategori af billeddannelsesmetoder med et enkelt dyr involverer polydimethylsiloxan (PDMS) enheder, der isolerer individuelle dyr på faste medier i et forsøg på nærmere at efterligne standardmiljøet, der opleves af orme dyrket på fast NGM i gruppekultur på petriplader. WorMotel er en 240-brønds PDMS-enhed designet til at dyrke individuelle dyr på faste medier. Hver brønd er fyldt med en modificeret NGM ved hjælp af lavsmeltet agarose i stedet for agar og podet med bakteriel mad, hvilket skaber et solidt mediemiljø svarende til det mest almindelige kultursystem ved hjælp af petriplader. Brøndvæggene er runde, så hvert dyr kan afbildes uanset placering i brønden (undgå visuel tilsløring forårsaget af et dyr nær en væg i en plade med flere brønde). Kobbersulfat i en smal voldgrav, der omgiver hver brønd, bruges som afskrækkende middel til at holde dyr i deres brønde14,15. En begrænsning af denne tilgang er, at kobbersulfatet er ineffektivt til at forhindre orme i at flygte, når aversive miljøforhold er til stede, herunder diætbegrænsning, patogene bakterier eller kemikalier, der fremkalder cellulær stress (f.eks. Paraquat).
Et andet system, der bruger faste medier, er Worm Corral, som anvender en hydrogel til at skabe et lille forseglet miljø for hver orm på et dias, hvilket muliggør langsigtet overvågning af individuelt isolerede dyr16. En vigtig begrænsning er, at dyr skal forsegles i miljøet som æg, hvilket kræver brug af sterile dyr for at forhindre reproduktion og begrænser lægemiddelbehandlinger til en enkelt applikation. Multi-dosis lægemiddelforsøg kan udføres i WorMotel enten ved at gennemføre flere eksponeringsrunder inden overførsel af orme til enheden eller ved topisk at tilføje yderligere lægemidler til brøndene under eksperimentet; I sidstnævnte tilfælde er den faktiske eksponeringsdosis efter tilsætning af et yderligere lægemiddel til en eksisterende brønd imidlertid vanskelig at kvantificere præcist og afhænger af, hvor hurtigt lægemidlet nedbrydes. Både WorMotel og Worm Corral er fremragende til brightfield eller darkfield billeddannelse for at fange information relateret til aktivitet og dyrefysiologi (fx vækst og udvikling). Mens disse systemer kan bruges til at overvåge fluorescens, er det vores erfaring, at PDMS, der bruges til at skabe de andre enkeltormsbilleddannelsesteknologier, er tilbøjelige til at danne mikrobobler, fange partikler og andre små abnormiteter, der genererer uregelmæssige fluorescerende artefakter, der forstyrrer konsekvent fluorescensvisualisering og kvantificering, især i emissionsområdet for GFP, den mest almindelige fluorofor, der anvendes i C. elegans-forskning. Hidtil er levende fluorescensbilleddannelse af C. elegans individuelle dyr på langsgående måde primært afhængig af mikrofluidiske enheder17.
Her beskriver vi en ny metode til dyrkning af individuelle C. elegans på faste medier, der er kompatibel med både aversive indgreb og direkte fluorescerende billeddannelse. Denne tilgang ligner i koncept andre enkeltormsbilleddannelsesteknologier, bortset fra at den specialstøbte PDMS-chip erstattes med kommercielt tilgængelige polystyrenmikrobakker, der oprindeligt blev udviklet til mikrocytotoksicitetsassays (også almindeligvis kaldet Terasaki-bakker)18. Disse mikrobakker har brønde, der kan fyldes med faste medier og podes med bakteriel mad, der nøje efterligner det miljø, som dyr oplever under standard solid NGM-kulturmetode. Hver brønd er omgivet af en aversiv barriere af palmitinsyre snarere end kobbersulfat. Palmitinsyre bruges almindeligvis til at forhindre orme i at flygte fra faste medier ved hjælp af standardgruppekultur på petriplader i forsøg, hvor orme udfordres med et aversivt miljø som diætbegrænsning eller udsættelse for en kemisk stressor. Mikrobakkerne producerer også minimal og konsistent fluorescerende baggrund, hvilket muliggør fluorescerende billeddannelse af dyr direkte i deres kulturmiljø. Dette nye enkeltdyrs faste agarbaserede dyrkningssystem giver ikke kun mulighed for at spore individuelle dyr gennem hele livet og overvåge vækst, udvikling, aktivitet og levetid, men er også kompatibelt med direkte fluorescerende mikroskopi. Fordi ormene kan afbildes uden lammelse eller fiksering, kan in vivo fluorescensbiomarkører kvantificeres i længderetningen hos individuelle dyr, der forbliver på deres kulturmedier, hvilket muliggør observation af dynamiske ændringer i løbet af hvert dyrs levetid. Dette kultursystem er også kompatibelt med den nuværende generation af automatiserede systemer til sporing af levetid og andre sundhedsmålinger14,19. Vi leverer en detaljeret protokol til dyrkning af individuelle C. elegans i dette mikrobakkebaserede system, diskutere potentielle faldgruber og fejlfinding og diskutere fordele og begrænsninger i forhold til andre systemer, og især en opdateret og optimeret WorMotel-protokol15.
Hvert kulturmiljø med en enkelt orm består af en mikrobakke monteret inde i en standard enkeltbrøndsbakke ved hjælp af en brugerdefineret 3D-printet adapter (figur 1A). Brøndene er fyldt med lavsmeltet agarosenematodevækstmedier (lmNGM), podet med koncentrerede bakterier som fødekilde og omgivet af en palmitinsyrebelægning for at forhindre orme i at flygte (figur 1B). Mellemrummet mellem mikrobakken og væggene på enkeltbrøndpladen er fyldt med mættede vandkrystaller for at opretholde fugtighed (figur 1B). En vaskemiddelbelægning påføres bakkelåget for at forhindre kondens. En enkelt orm tilsættes til hver brønd, og enkeltbrøndbakken forsegles med Parafilm for at opretholde fugt og tillade iltudveksling. Op til seks mikrobakker kan med rimelighed fremstilles parallelt af en enkelt praktiseret forsker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

Caenorhabditis elegans bruges i vid udstrækning til at studere aldringsbiologi. Standardpraksis i C. elegans aldringsundersøgelser er at dyrke grupper af orme på faste nematodevækstmedier (NGM), hvilket muliggør effektiv indsamling af data på populationsniveau for overlevelse og andre fysiologiske fænotyper og periodisk prøveudtagning af subpopulationer til fluorescerende biomarkørkvantificering. Begrænsninger for denne tilgang er manglende evne til (1) at følge individuelle orme over tid for at udvikle aldersbaner for fænotyper af interesse og (2) overvåge fluorescerende biomarkører direkte i forbindelse med kulturmiljøet. Alternative dyrkningsmetoder bruger flydende kultur eller mikrofluidik til at overvåge individuelle dyr over tid, i nogle tilfælde inklusive fluorescenskvantificering, med den afvejning, at kulturmiljøet er kontekstuelt adskilt fra fast NGM. WorMotel er en tidligere beskrevet mikrofabrikeret multi-well enhed til dyrkning af isolerede orme på fast NGM. Hver orm opretholdes i en brønd, der indeholder fast NGM omgivet af en voldgrav fyldt med kobbersulfat, et kontaktafvisende middel til C. elegans, hvilket muliggør langsgående overvågning af individuelle dyr. Vi finder kobbersulfat utilstrækkeligt til at forhindre orme i at flygte, når de udsættes for aversive indgreb, der er almindelige i aldringsforskning, herunder diætbegrænsning, patogene bakterier og kemiske agenser, der fremkalder cellulær stress. Multibrøndindretningerne er også støbt af polydimethylsiloxan, som producerer artefakter med høj baggrund i fluorescensbilleddannelse. Denne protokol beskriver en ny tilgang til dyrkning af isolerede rundorme på fast NGM ved hjælp af kommercielt tilgængelige polystyrenmikrobakker, oprindeligt designet til human leukocytantigen (HLA) typning, hvilket muliggør måling af overlevelse, fysiologiske fænotyper og fluorescens over hele levetiden. En palmitinsyrebarriere forhindrer orme i at flygte, selv i nærvær af aversive forhold. Hver plade kan dyrke op til 96 dyr og tilpasser sig let til en række forhold, herunder diætbegrænsning, RNAi og kemiske tilsætningsstoffer, og er kompatibel med automatiserede systemer til indsamling af levetids- og aktivitetsdata.

Det mikrobakkebaserede enkeltormskulturmiljø, der er beskrevet her, kan bruges til at overvåge en række fænotyper, herunder levetid og sundhedsperiode, aktivitet og bevægelse, kropsform og kravlegeometri og ekspression af transgent udtrykte fluorescerende biomarkører hos individuelle dyr over tid. Mikrobakkekultursystemet er kompatibelt med levetidsanalyse gennem enten manuel scoring eller billedindsamling og downstream-billedanalyse. Som med standardkultur på petriplader21 kan orme manuelt...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Her præsenterer vi en protokol til dyrkning af isolerede individuelle nematoder på faste medier til livslang fysiologisk parametersporing og fluorescenskvantificering. Dette kultursystem omfatter en palmitinsyrebarriere omkring enkeltormbrønde for at forhindre dyr i at flygte, hvilket tillader anvendelse af aversive indgreb, herunder patogene bakterier og kemiske stressorer.

Langtidsdyrkning af individuelle Caenorhabditis elegans på faste medier til langsgående fluorescensovervågning og aversive indgreb

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Mens der findes andre faste kulturmetoder, er dette det første faste kultursystem, der muliggør automatiseret langsgående sporing af individuelt dyreliv og sundhedsspændvidde og langsgående billeddannelse af fluorescerende biomarkører i ét system. Denne protokol giver resultater, der kan sammenlignes med standard C.elegans-eksperimenter på fast NGM, er kompatibel med både aversive interventioner og direkte levende fluorescensbilleddannelse. Dette system vil være uvurderligt for aldringsforskning, især med hensyn til langvarig eksponering for miljømæssige stressfaktorer og observation af gen- og proteindynamik over længere perioder.At undgå forurening og få ensartet tørring på tværs af brøndene er begge udfordrende. Vi fremhævede nøglepunkter i den skriftlige protokol for at minimere disse problemer. Til at begynde med skal du male 500 milligram fast palmitinsyre i en mørtel og støder.Kombiner det med 15 ml TWEEN 20 i et 50 ml konisk hætteglas, og bland ved hvirvelstrøm for at opløse krystallerne. Tilsæt 17,5 ml 100% ethanol, og hvirvel opløsningen for at opløse så meget palmitinsyre som muligt. Derefter tilsættes 17,5 ml ultrarent vand og hvirvel kraftigt.Opvarm forsigtigt opløsningen i et perlebad ved 80 grader Celsius, indtil palmitinsyren opløses fuldstændigt. Opvarm perlebadet til 80 grader Celsius. Umiddelbart før brug alikvote en milliliter af palmitinsyrearbejdsopløsningen pr. Mikrobakke i en separat steril beholder, og der tilsættes fire mikroliter nystatin pr. Milliliter palmitinsyreopløsning før opvarmning.Sprøjt nu i og uden for mikrobakken med ethanol til mætning, og ryst det overskydende ethanol af. For at sterilisere mikrobakken skal du placere pladen og låget separat i UV-tværbinderen. Efter 20 minutter vendes pladen og låget.Anbring derefter det 15 ml koniske hætteglas med palmitinsyrearbejdsløsningen i perlebadet, og lad eventuelle synlige krystaller opløses fuldstændigt før brug. Varm mikrobakken op ved at placere den på afsatsen omkring perlebadet med lågene på i to minutter. Fjern mikrobakkelåget, og tilsæt langsomt 200 mikroliter palmitinsyrearbejdsopløsning over mikrobakkens bagvæg.Sæt lågene på igen, og lad mikrobakken sidde på perlebadet i to til tre minutter, så palmitinsyreopløsningen kan sætte sig hen over bunden af mikrobakken. Drej mikrobakken 180 grader, og tilsæt arbejdsløsningen med palmitinsyre som vist tidligere. Forbered lmNGM ved at tilføje de komponenter, der er beskrevet i manuskriptet.Derefter pipetteres 20 mikroliter lmNGM i hver mikrobakke, der er placeret på bænken. Sørg for at dække mikrobakken, når pipetten genopfyldes for at minimere kontaminering. For at frø Microtray-brøndene med bakteriel mad, centrifuger en kultur dyrket natten over ved 3.500 G i 20 minutter.Supernatanten fjernes, og bakteriekulturen resuspenderes i en tidoblet koncentration med 85 millimolær natriumchloridopløsning. Derefter pipetteres forsigtigt fem mikroliter ti gange koncentreret bakteriekultur på overfladen af lmNGM i hvert hul. Undgå at lade bakteriekulturen løbe over siden af brønden og ind i palmitinsyren, da dette vil tiltrække orme til at forlade brønden.Anbring det sterile 3D-printede skær i en steril enkeltbrøndsplade. Anbring mikrobakken i den 3D-printede adapter i enkeltbrøndspladen. Dispenser rigeligt vandkrystaller oven på den 3D-printede indsats mellem mikrobakkens ydre hul og den indvendige væg på enkeltbrøndpladen.Hvis orme ikke tilsættes med det samme, skal du forsegle mikrobakken til brug den næste dag. Luk bakkens låg, og brug et enkelt stykke parafilm til at vikle alle fire sider for at forsegle mikrobakken. Gentag tætningstrinnet med Parafilm to gange mere i tre lag.Tilføj en orm pr. brønd, når de har nået det ønskede livsstadium. Tilsæt 40 mikroliter vaskemiddelopløsning til låget på en enkeltbrøndplade, og brug en opgaveserviet til at belægge låget jævnt. Brug yderligere opgaveservietter til at sprede vaskemiddelopløsningen, indtil synet gennem låget ikke er forvrænget.Stræk det første stykke Parafilm lidt for at dække to sider af bakken. Tør toppen af bakken af med en opgaveserviet, og fugt den med 70 % ethanol for at fjerne fingeraftryk. Mål levetiden ved forsigtigt at banke på siden eller toppen af pladen eller skinne et klart blåt lys på pladen og observere hvert dyr.Scor et dyr dødt, hvis det ikke bevæger sig inden for få sekunder. Gentag denne opgave hver til tredje dag, indtil alle orme er døde. Udfør fluorescerende billeddannelse på enkeltbrønde.Eksponering for kobbersulfat og dithiothreitol reducerede signifikant ormens levetid og sundhedsperiode. I modsætning hertil reducerede kobbersulfat andelen af livet brugt ved godt helbred, mens dithiothreitol ikke gjorde det. Kobbersulfat reducerede den gennemsnitlige aktivitet på tværs af individer i befolkningen i større grad end dithiothreitol i alle aldre.Populationsgennemsnittet for det enkelte dyreområde under levetidsaktivitetskurven er væsentligt svækket af kobbersulfat eller dithiothreitol. Kumulativ aktivitet for individuelle dyr op til dag 10 korrelerer med deres levetid for dithiothreitoludfordrede dyr, men ikke for ubehandlede kontroller eller kobbersulfatudfordrede dyr. En drastisk stigning i KYNU-1-ekspression observeres mellem dag tre og otte i voksenalderen, og der er et progressivt fald med alderen efter det.Kumulativ KYNU-1 mScarlet ekspression gennem dag 14 i voksenalderen korrelerer med dyrelivets levetid. Da KYNU-1-ekspression er dynamisk gennem hele livet, sammenlignede vi KYNU-1-ekspression i forskellige aldre med den samlede overlevelse på tværs af individuelle dyr. På intet enkelt tidspunkt var KYNU-1-ekspression signifikant korreleret med overlevelse.Når du forsøger denne procedure, er de vigtigste trin tilsætning af palmitinsyren, pipettering agar og introduktion af ormene. Denne teknik tillader langsgående sporing af levetid og sundhedslængde samt fluorescerende biomarkører i individuelle orme på en måde, der er direkte sammenlignelig med NGM-assays.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsigtet dødelige toksicitet Test med krebsdyr Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Multilayer Beslag for Langsigtet Light ark mikroskopi af zebrafisk

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Dyrkning<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; I Axeniske Liquid Media og fremstilling af transgene Worms ved mikropartikelbombardement

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolation, transfektion og langsigtet kultur af voksne mus og rat kardiomyocytter

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging af Lipid Storage Dynamics i Caenorhabditis elegans ved hjælp af stimuleret Raman Scattering Mikroskopi

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisering af aggregeret kvantificering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...