Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH R35GM133588 aan G.L.S., een NIHT32GM008659 trainingsbeurs aan L.E., een United States National Academy of Medicine Catalyst Award aan G.L.S., en het State of Arizona Technology and Research Initiative Fund beheerd door de Arizona Board of Regents.

1. Recepten
OPMERKING: Bereid voorraadoplossingen voor voordat u begint met de voorbereiding van microtrayplaten.
<ol><li>Voorraadoplossingen voor laagsmeltende agarose-nematodengroeimedia (lmNGM)<ol><li>Bereid 1 MK2 HPO4 door 174,18 g K2HPO4 op te lossen in 1 L steriel gedeïoniseerd water in een fles van 1 L. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C, 15 psi, gedurende 30 minuten en bewaar deze bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Bereid 1 M KP<s...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research.">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021)</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

Hier beschrijven we een nieuw kweeksysteem dat microtrays aanpast, oorspronkelijk ontwikkeld voor menselijke leukocytenantigeenweefseltyperingstests, om de isolatie en karakterisering van enkele C. elegans in de loop van de tijd mogelijk te maken in een solide mediaomgeving die contextueel vergelijkbaar is met de op agar gebaseerde NGM die de standaard is in C. elegans-onderzoek. Dit systeem is compatibel met een verscheidenheid aan interventies, waaronder dieetbeperking, exogene medicamenteuze behand...

C. elegans zijn een krachtig modelorganisme voor onderzoek in de genetica, cellulaire biologie en moleculaire biologie, omdat ze gemakkelijk in het laboratorium kunnen worden gekweekt, een korte generatietijd en levensduur hebben, een hoge mate van eiwit homologie delen met zoogdieren en een transparante lichaamsstructuur hebben die in vivo visualisatie van fluorescerende eiwitten en kleurstoffen mogelijk maakt1. Als gevolg van het langdurige gebruik van C. elegans als een belangrijk modelsysteem op een reeks gebieden, waaronder ontwikkelingsbiologie en veroudering, zijn hun groei en ontwikkeling goed begrepen, is hun genoom volledig gesequenced en zijn er een groot aantal krachtige genetische hulpmiddelen gecreëerd, waaronder genoombrede RNAi-voedingsbibliotheken en duizenden mutante en transgene stammen. Historisch gezien worden C. elegans gekweekt als populaties op vaste agarnematodengroeimedia (NGM) en fenotypen worden handmatig geëvalueerd door directe observatie of door beeldvorming en downstream-analyse. Fluorescerende microscopie wordt gebruikt om een verscheidenheid aan moleculaire fenotypes vast te leggen met behulp van kleurstoffen of transgeen tot expressie gebrachte fluorescerende tags in individuele C. elegans. Fluorescerende beeldvorming omvat meestal het fixeren of verlammen van een dier op dia's met dunne agarose-pads, wat invasief en vaak dodelijk is. Het omvat ook het gebruik van chemicaliën, zoals levamisol of natriumazide, die mogelijk het moleculaire proces van belang kunnen verstoren 2,3. Samen maken deze benaderingen het mogelijk om cross-sectionele gegevens op populatieniveau te verzamelen over een breed scala aan fenotypen, maar maken ze het niet mogelijk om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen.
In de afgelopen jaren zijn er verschillende benaderingen ontstaan om geïsoleerde C. elegans te cultiveren, waardoor onderzoekers dynamische veranderingen in fysiologische en moleculaire fenotypen van dieren in de loop van de tijd kunnen vastleggen met behulp van nieuwe beeldvormingstechnologieën. Een categorie van C. elegans cultuurbenadering is microfluïdica-apparaten, waaronder WormFarm4, de Nemalife-chip5 en de 'gedrags'-chip van Chronis et al.6, naast verschillende andere 7,8,9. Hieraan gerelateerd zijn op vloeistof gebaseerde kweekmethoden, die multi-well platen gebruiken om individuele wormen of kleine populaties in de loop van de tijd te karakteriseren10,11. Microfluïdica en microplaatsystemen bieden uitstekende kwantitatieve metingen van fenotypische reacties in C. elegans tot een enkel dier, maar de kweekomgeving vertoont een belangrijke beperking. De overgrote meerderheid van het eerdere onderzoek naar C. elegans, met name op het gebied van veroudering, is voltooid op vaste agar-gebaseerde media. Vloeibare cultuur zorgt ervoor dat C. elegans continu zwemmen en vertegenwoordigt een verschillende omgevingscontext die de onderliggende biologie kan veranderen. Dieren gekweekt in vloeibare media hebben bijvoorbeeld het vetgehalte en de genexpressie drastisch veranderd - met name voor genen die betrokken zijn bij de stressrespons - ten opzichte van dieren gekweekt op agar-gebaseerde vaste stof NGM12,13. Een alternatieve categorie van beeldvormingsmethoden voor één dier omvat polydimethylsiloxaan (PDMS) -apparaten die individuele dieren isoleren op vaste media, in een poging om de standaardomgeving die wordt ervaren door wormen gekweekt op vaste NGM in groepscultuur op petrischolen beter na te bootsen. De WorMotel is een 240-well PDMS-apparaat dat is ontworpen om individuele dieren op vaste media te kweken. Elke put is gevuld met een gemodificeerde NGM met behulp van laagsmeltende agarose in plaats van agar en bezaaid met bacterieel voedsel, waardoor een solide mediaomgeving ontstaat die vergelijkbaar is met het meest voorkomende kweeksysteem met petriplaten. De wanden van de put zijn rond, waardoor elk dier kan worden afgebeeld, ongeacht de locatie in de put (waardoor de visuele verduistering wordt vermeden die wordt veroorzaakt door een dier in de buurt van een muur in een plaat met meerdere putten). Kopersulfaat in een smalle gracht rond elke put wordt gebruikt als afschrikmiddel om dieren in hun putten te houden14,15. Een beperking van deze aanpak is dat het kopersulfaat niet effectief is in het voorkomen dat wormen vluchten wanneer aversieve omgevingsomstandigheden aanwezig zijn, waaronder dieetbeperking, pathogene bacteriën of chemicaliën die cellulaire stress veroorzaken (bijv. Paraquat).
Een tweede systeem dat vaste media gebruikt, is de Worm Corral, die een hydrogel gebruikt om een kleine afgesloten omgeving te creëren voor elke worm op een dia, waardoor langdurige monitoring van individueel geïsoleerde dieren mogelijk is16. Een belangrijke beperking is dat dieren als eieren in het milieu moeten worden verzegeld, waardoor het gebruik van steriele dieren vereist is om voortplanting te voorkomen en medicamenteuze behandelingen worden beperkt tot één enkele toepassing. Multi-dosis medicijnproeven kunnen worden bereikt in het WorMotel, hetzij door meerdere blootstellingsrondes uit te voeren voorafgaand aan het overbrengen van wormen naar het apparaat of door tijdens het experiment topisch extra geneesmiddelen aan de putten toe te voegen; In het laatste geval is de werkelijke blootstellingsdosis na het toevoegen van een extra medicijn aan een bestaande put echter moeilijk precies te kwantificeren en hangt het af van hoe snel het medicijn afbreekt. Zowel het WorMotel als de Worm Corral zijn uitstekend geschikt voor brightfield- of darkfield-beeldvorming om informatie vast te leggen met betrekking tot activiteit en dierfysiologie (bijv. Groei en ontwikkeling). Hoewel deze systemen kunnen worden gebruikt om fluorescentie te monitoren, is onze ervaring dat het PDMS dat wordt gebruikt om de andere beeldvormingstechnologieën met één worm te maken, gevoelig voor het vormen van microbubbels, het vastleggen van deeltjes en andere kleine afwijkingen die onregelmatige fluorescerende artefacten genereren die interfereren met consistente fluorescentievisualisatie en kwantificering, vooral in het emissiebereik voor GFP, de meest voorkomende fluorofoor die wordt gebruikt in C. elegans-onderzoek. Tot op heden is live fluorescentiebeeldvorming van C. elegans individuele dieren op een longitudinale manier voornamelijk afhankelijk van microfluïdica-apparaten17.
Hier beschrijven we een nieuwe methode voor het kweken van individuele C. elegans op vaste media die compatibel is met zowel aversieve interventies als directe fluorescerende beeldvorming. Deze aanpak is qua concept vergelijkbaar met andere beeldvormingstechnologieën met één worm, behalve dat de op maat gemaakte PDMS-chip wordt vervangen door in de handel verkrijgbare polystyreenmicrotrays die oorspronkelijk zijn ontwikkeld voor microcytotoxiciteitstests (ook vaak Terasaki-trays genoemd)18. Deze microtrays zijn voorzien van putten die kunnen worden gevuld met vaste media en bezaaid met bacterieel voedsel, waarbij de omgeving die dieren ervaren nauw wordt nagebootst volgens de standaard vaste NGM-cultuurmethodologie. Elke put is omgeven door een aversieve barrière van palmitinezuur in plaats van kopersulfaat. Palmitinezuur wordt vaak gebruikt om te voorkomen dat wormen vaste media ontvluchten, met behulp van standaard groepscultuur op petrischlaten in experimenten waarbij wormen worden uitgedaagd met een aversieve omgeving zoals dieetbeperking of blootstelling aan een chemische stressor. De microtrays produceren ook een minimale en consistente fluorescerende achtergrond, waardoor fluorescerende beeldvorming van dieren direct in hun kweekomgeving mogelijk is. Dit nieuwe op vaste agar gebaseerde kweeksysteem voor één dier maakt het niet alleen mogelijk om individuele dieren gedurende het hele leven te volgen en groei, ontwikkeling, activiteit en levensduur te volgen, maar is ook compatibel met directe fluorescerende microscopie. Omdat de wormen kunnen worden afgebeeld zonder verlamming of fixatie, kunnen in vivo fluorescentiebiomarkers longitudinaal worden gekwantificeerd in individuele dieren die op hun kweekmedia blijven, waardoor dynamische veranderingen gedurende de levensduur van elk dier kunnen worden waargenomen. Dit cultuursysteem is ook compatibel met de huidige generatie geautomatiseerde systemen voor het bijhouden van de levensduur en andere gezondheidsstatistieken14,19. We bieden een gedetailleerd protocol voor het kweken van individuele C. elegans in dit op microtrays gebaseerde systeem, bespreken mogelijke valkuilen en probleemoplossing en bespreken de voordelen en beperkingen ten opzichte van andere systemen, en in het bijzonder een bijgewerkt en geoptimaliseerd WorMotel-protocol15.
Elke kweekomgeving met één worm bestaat uit een microtray die in een standaard lade met één put is gemonteerd met behulp van een aangepaste 3D-geprinte adapter (figuur 1A). De putten zijn gevuld met laagsmeltende agarose-nematodengroeimedia (lmNGM), bezaaid met geconcentreerde bacteriën als voedselbron en omgeven door een palmitinezuurcoating om te voorkomen dat wormen vluchten (figuur 1B). De ruimte tussen de microtray en de wanden van de single-well plaat is gevuld met verzadigde waterkristallen om de luchtvochtigheid te handhaven (figuur 1B). Op het deksel van de tray wordt een reinigingscoating aangebracht om condensatie te voorkomen. Aan elke put wordt een enkele worm toegevoegd en de lade met één put wordt afgesloten met Parafilm om vocht te behouden en zuurstofuitwisseling mogelijk te maken. Tot zes microtrays kunnen redelijkerwijs parallel worden bereid door een enkele geoefende onderzoeker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

Caenorhabditis elegans worden veel gebruikt om verouderingsbiologie te bestuderen. De standaardpraktijk in C. elegans verouderingsstudies is het kweken van groepen wormen op vaste nematodengroeimedia (NGM), waardoor de efficiënte verzameling van gegevens op populatieniveau voor overleving en andere fysiologische fenotypen mogelijk is, en periodieke bemonstering van subpopulaties voor fluorescerende biomarkerkwantificering. Beperkingen van deze aanpak zijn het onvermogen om (1) individuele wormen in de loop van de tijd te volgen om leeftijdstrajecten te ontwikkelen voor fenotypes van belang en (2) fluorescerende biomarkers direct in de context van de kweekomgeving te monitoren. Alternatieve kweekbenaderingen gebruiken vloeibare cultuur of microfluïdica om individuele dieren in de loop van de tijd te volgen, in sommige gevallen inclusief fluorescentiekwantificering, met de afweging dat de kweekomgeving contextueel verschilt van vaste NGM. De WorMotel is een eerder beschreven microfabricated multi-well apparaat voor het kweken van geïsoleerde wormen op vaste NGM. Elke worm wordt bewaard in een put met vaste NGM omgeven door een gracht gevuld met kopersulfaat, een contactafweermiddel voor C. elegans, waardoor longitudinale monitoring van individuele dieren mogelijk is. We vinden kopersulfaat onvoldoende om te voorkomen dat wormen vluchten wanneer ze worden blootgesteld aan aversieve interventies die vaak voorkomen in verouderingsonderzoek, waaronder dieetbeperking, pathogene bacteriën en chemische agentia die cellulaire stress veroorzaken. De multi-well apparaten zijn ook gegoten uit polydimethylsiloxaan, dat hoge achtergrondartefacten produceert in fluorescentiebeeldvorming. Dit protocol beschrijft een nieuwe aanpak voor het kweken van geïsoleerde rondwormen op vaste NGM met behulp van in de handel verkrijgbare polystyreenmicrotrays, oorspronkelijk ontworpen voor humane leukocytenantigeenantigeen (HLA) typering, waardoor de overleving, fysiologische fenotypen en fluorescentie gedurende de levensduur kunnen worden gemeten. Een palmitinezuurbarrière voorkomt dat wormen vluchten, zelfs in de aanwezigheid van aversieve omstandigheden. Elke plaat kan tot 96 dieren kweken en past zich gemakkelijk aan verschillende omstandigheden aan, waaronder dieetbeperkingen, RNAi en chemische additieven, en is compatibel met geautomatiseerde systemen voor het verzamelen van levensduur- en activiteitsgegevens.

De microtray-gebaseerde single-worm kweekomgeving die hier wordt beschreven, kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan fenotypen te volgen, waaronder levensduur en gezondheidsspanne, activiteit en beweging, lichaamsvorm en kruipgeometrie, en de expressie van transgeen tot expressie gebrachte fluorescerende biomarkers in individuele dieren in de loop van de tijd. Het microtray-kweeksysteem is compatibel met levensduuranalyse door middel van handmatige scoring of beeldverzameling en downstream beeldanalyse. Net als bi...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Hier presenteren we een protocol om geïsoleerde individuele nematoden op vaste media te kweken voor levenslange fysiologische parametertracking en fluorescentiekwantificering. Dit kweeksysteem omvat een palmitinezuurbarrière rond putten met één worm om te voorkomen dat dieren vluchten, waardoor aversieve interventies mogelijk zijn, waaronder pathogene bacteriën en chemische stressoren.

Langetermijnkweek van individuele Caenorhabditis elegans op vaste media voor longitudinale fluorescentiemonitoring en aversieve interventies

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Hoewel er andere vaste kweekmethoden bestaan, is dit het eerste solide kweeksysteem dat geautomatiseerde longitudinale tracking van het leven en de gezondheid van individuele dieren en longitudinale beeldvorming van fluorescerende biomarkers in één systeem mogelijk maakt. Dit protocol biedt vergelijkbare resultaten als standaard C.elegans experimenten op vaste NGM is compatibel met zowel aversieve interventies als directe live fluorescentie beeldvorming. Dit systeem zal van onschatbare waarde zijn voor verouderingsonderzoek, vooral met betrekking tot langdurige blootstelling aan omgevingsstressoren en het observeren van gen- en eiwitdynamiek gedurende langere perioden.Het vermijden van verontreiniging en het consistent drogen van de putten zijn beide een uitdaging. We hebben belangrijke punten in het schriftelijke protocol benadrukt om deze problemen te minimaliseren. Maal om te beginnen 500 milligram vast palmitinezuur in een vijzel en stamper.Combineer het met 15 milliliter TWEEN 20 in een conische injectieflacon van 50 milliliter en meng door vortexing om de kristallen op te lossen. Voeg 17,5 milliliter 100% ethanol toe en vortex de oplossing om zoveel mogelijk palmitinezuur op te lossen. Voeg vervolgens 17,5 milliliter ultrapuur water toe en vortex krachtig.Verwarm de oplossing voorzichtig in een kralenbad op 80 graden Celsius totdat het palmitinezuur volledig is opgelost. Verwarm het kralenbad opnieuw tot 80 graden Celsius. Onmiddellijk voor gebruik, aliquoteer één milliliter van de palmitinezuurwerkoplossing per microtray in een afzonderlijke steriele container en voeg vier microliter nystatine per één milliliter palmitinezuuroplossing toe voor verhitting.Spuit nu binnen en buiten de Microtray met ethanol tot verzadiging en schud de overtollige ethanol af. Om de Microtray te steriliseren, plaatst u de plaat en het deksel afzonderlijk in de UV-crosslinker. Draai na 20 minuten de plaat en het deksel om.Plaats vervolgens de conische injectieflacon van 15 milliliter met de palmitinezuurwerkoplossing in het kralenbad en laat eventuele zichtbare kristallen volledig oplossen voor gebruik. Warm de Microtray op door deze twee minuten op de richel rond het kralenbad te plaatsen met de deksels erop. Verwijder het Microtray-deksel en voeg langzaam 200 microliter palmitinezuurwerkoplossing toe aan de achterwand van de Microtray.Vervang de deksels en laat de Microtray twee tot drie minuten op het kralenbad zitten om de palmitinezuuroplossing over de bodem van de Microtray te laten bezinken. Draai de Microtray 180 graden en voeg de palmitinezuurwerkoplossing toe zoals eerder gedemonstreerd. Bereid lmNGM voor door de componenten toe te voegen die in het manuscript worden beschreven.Pipetteer vervolgens 20 microliter lmNGM in elke Microtray die op de bank wordt geplaatst. Zorg ervoor dat u de Microtray afdekt wanneer u de pipet bijvult om vervuiling te minimaliseren. Om de Microtray-putten te bezaaien met bacterieel voedsel, centrifugeert u een cultuur die 's nachts gedurende 20 minuten op 3.500 G is gekweekt.Verwijder het supernatant en resuspensie van de bacteriecultuur in een tienvoudige concentratie met 85 millimolaire natriumchlorideoplossing. Pipetteer vervolgens voorzichtig vijf microliter tienvoudig geconcentreerde bacteriecultuur op het oppervlak van de lmNGM in elke put. Laat de bacteriecultuur niet over de zijkant van de put en in het palmitinezuur lopen, omdat dit wormen zal aantrekken om de put te verlaten.Plaats het steriele 3D-geprinte inzetstuk in een steriele plaat met één put. Plaats de Microtray in de 3D-geprinte adapter in de single-well plaat. Doseer royaal waterkristallen bovenop het 3D-geprinte inzetstuk tussen de buitenste put van de Microtray en de binnenwand van de single-well plaat.Als wormen niet onmiddellijk worden toegevoegd, sluit u de Microtray af om de volgende dag te gebruiken. Sluit het deksel van de lade en gebruik een enkel stuk Parafilm om alle vier de zijden te wikkelen om de Microtray af te sluiten. Herhaal de afdichtingsstap met Parafilm nog twee keer gedurende drie lagen.Voeg één worm per put toe zodra ze de gewenste levensfase hebben bereikt. Voeg 40 microliter wasmiddeloplossing toe aan het deksel van een plaat met één put en gebruik een taakdoekje om het deksel gelijkmatig te bedekken. Gebruik extra taakdoekjes om de reinigingsmiddeloplossing te verspreiden totdat het zicht door het deksel niet wordt vervormd.Rek het eerste stuk Parafilm iets uit om twee zijden van de lade te bedekken. Veeg de bovenkant van de lade schoon met een taakveeg en bevochtig deze met 70% ethanol om eventuele vingerafdrukken te verwijderen. Meet de levensduur door zachtjes op de zijkant of bovenkant van de plaat te tikken, of een felblauw licht op de plaat te schijnen en elk dier te observeren.Scoor een dier dood als het niet binnen een paar seconden beweegt. Herhaal deze taak elke één tot drie dagen totdat alle wormen zijn gestorven. Voer fluorescerende beeldvorming uit op enkele putten.Blootstelling aan kopersulfaat en dithiothreitol verminderde de levensduur en gezondheidsspanne van de worm aanzienlijk. Daarentegen verminderde kopersulfaat het aandeel van het leven dat in goede gezondheid werd doorgebracht, terwijl dithiothreitol dat niet deed. Kopersulfaat verminderde de gemiddelde activiteit van individuen binnen de bevolking in grotere mate dan dithiothreitol op alle leeftijden.Het populatiegemiddelde van het individuele dierlijke gebied onder de levenslange activiteitscurve wordt aanzienlijk aangetast door kopersulfaat of dithiothreitol. Cumulatieve activiteit voor individuele dieren tot dag 10 correleert met hun levensduur voor dithiothreitol uitgedaagde dieren, maar niet voor onbehandelde controles of kopersulfaat uitgedaagde dieren. Een drastische toename van KYNU-1-expressie wordt waargenomen tussen dag drie en acht van de volwassenheid, en er is een progressieve afname met de leeftijd daarna.Cumulatieve KYNU-1 mScarlet-expressie tot en met dag 14 van de volwassenheid correleert met de levensduur van dieren. Omdat KYNU-1-expressie dynamisch is gedurende een hele levensduur, vergeleken we KYNU-1-expressie op verschillende leeftijden met de algehele overleving van individuele dieren. Op geen enkel moment was kynu-1-expressie significant gecorreleerd met overleving.Bij het proberen van deze procedure zijn de belangrijkste stappen toevoeging van het palmitinezuur, het pipetteren van de agar en het introduceren van de wormen. Deze techniek maakt longitudinale tracking van levensduur en gezondheidsspanne mogelijk, evenals fluorescerende biomarkers in individuele wormen op een manier die direct vergelijkbaar is met NGM-assays.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Het meten van Caenorhabditis elegans Levensduur over Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based dieetbeperking in Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Multilayer Montage voor langdurig licht Sheet Microscopie van zebravis

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Kweken<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In Axenische Liquid Media en Creatie van transgene Worms door bombardement met microdeeltjes

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolatie, transfectie, en lange termijn cultuur van volwassen muis en rat cardiomyocyten

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Labelvrije beeldvorming van lipideopslagdynamiek bij Caenorhabditis elegans met behulp van gestimuleerde Raman-verstrooiingscopie

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...