Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par NIH R35GM133588 à G.L.S., une subvention de formation NIHT32GM008659 à L.E., un prix Catalyst de l’Académie nationale de médecine des États-Unis à G.L.S. et le State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administré par l’Arizona Board of Regents.

1. Recettes
REMARQUE: Préparez les solutions mères avant de commencer la préparation de la plaque de microplateau.
<ol><li>Solutions mères pour milieux de croissance de nématodes agarose à faible point de fusion (lmNGM)<ol><li>Préparer 1 M K2HPO4 en dissolvant 174,18 g deK2HPO4dans 1 L d’eau désionisée stérile dans un flacon de 1 L. Autoclaver la solution à 121 °C, 15 psi, pendant 30 min et la conserver à température ambiante ...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research.">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021)</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

Ici, nous décrivons un nouveau système de culture qui adapte les microplateaux, développé à l’origine pour les tests de typage tissulaire de l’antigène leucocytaire humain, afin de permettre l’isolement et la caractérisation de C. elegans uniques au fil du temps dans un environnement de milieux solides qui est contextuellement similaire au NGM à base d’agar qui est la norme dans la recherche sur C. elegans. Ce système est compatible avec une variété d’interventions, y compris la re...

C. elegans est un puissant organisme modèle pour la recherche en génétique, en biologie cellulaire et en biologie moléculaire, car ils sont facilement cultivés en laboratoire, ont une durée de vie et une durée de vie courtes, partagent un degré élevé d’homologie protéique avec les mammifères et ont une structure corporelle transparente qui permet la visualisation in vivo des protéines fluorescentes et des colorants1. En raison de l’utilisation de longue date de C. elegans comme système modèle majeur dans divers domaines, y compris la biologie du développement et le vieillissement, leur croissance et leur développement sont bien compris, leur génome a été entièrement séquencé et une foule d’outils génétiques puissants ont été créés, y compris des bibliothèques d’alimentation en ARNi à l’échelle du génome et des milliers de souches mutantes et transgéniques. Historiquement, C. elegans est cultivé en tant que population sur des milieux de croissance de nématodes gélose solides (NGM), et les phénotypes sont évalués manuellement soit par observation directe, soit par imagerie et analyse en aval. La microscopie fluorescente est utilisée pour capturer une variété de phénotypes moléculaires à l’aide de colorants ou de marqueurs fluorescents exprimés de manière transgénique chez des individus de C. elegans. L’imagerie fluorescente consiste généralement à fixer ou à paralyser un animal sur des lames contenant de minces pastilles d’agarose, ce qui est envahissant et souvent mortel. Elle implique également l’utilisation de produits chimiques, tels que le lévamisole ou l’azoture de sodium, qui peuvent potentiellement interférer avec le processus moléculaire d’intérêt 2,3. Ensemble, ces approches permettent de recueillir des données transversales à l’échelle de la population sur un large éventail de phénotypes, mais ne permettent pas le suivi des animaux individuels au fil du temps.
Au cours des dernières années, plusieurs approches ont émergé pour cultiver C. elegans isolé, permettant aux chercheurs de capturer les changements dynamiques dans les phénotypes physiologiques et moléculaires des animaux au fil du temps en utilisant de nouvelles technologies d’imagerie. Une catégorie d’approche de culture de C. elegans est constituée de dispositifs microfluidiques, notamment WormFarm4, la puce Nemalife5 et la puce « comportementale » de Chronis et al.6, entre autres 7,8,9. À cela s’ajoutent les méthodes de culture à base de liquide, qui utilisent des plaques multipuits pour caractériser des vers individuels ou de petites populations au fil du temps10,11. La microfluidique et les systèmes de microplaques fournissent d’excellentes mesures quantitatives des réponses phénotypiques chez C. elegans jusqu’à un seul animal, mais l’environnement de culture présente une limite clé. La grande majorité des recherches antérieures sur C. elegans, en particulier dans le domaine du vieillissement, ont été réalisées sur des milieux solides à base d’agar-agar. La culture liquide fait nager C. elegans en continu et représente un contexte environnemental distinct qui peut modifier la biologie sous-jacente. Par exemple, les animaux cultivés dans des milieux liquides ont considérablement modifié la teneur en matières grasses et l’expression des gènes – en particulier pour les gènes impliqués dans la réponse au stress – par rapport aux animaux cultivés sur NGM solide à base d’agar12,13. Une autre catégorie de méthodes d’imagerie sur un seul animal implique des dispositifs de polydiméthylsiloxane (PDMS) qui isolent des animaux individuels sur des milieux solides, dans le but d’imiter plus étroitement l’environnement standard rencontré par les vers cultivés sur NGM solide en culture de groupe sur plaques de Petri. Le WorMotel est un appareil PDMS de 240 puits conçu pour cultiver des animaux individuels sur des supports solides. Chaque puits est rempli d’un NGM modifié utilisant de l’agarose à faible fusion au lieu de gélose et ensemencé avec des aliments bactériens, créant un environnement de milieux solides similaire au système de culture le plus courant utilisant des plaques de Petri. Les parois du puits sont rondes, ce qui permet d’imager chaque animal quel que soit son emplacement dans le puits (en évitant l’obscurcissement visuel causé par un animal près d’un mur dans une plaque multipuits). Le sulfate de cuivre dans un fossé étroit entourant chaque puits est utilisé comme moyen de dissuasion pour garder les animaux dans leurs puits14,15. Une limite de cette approche est que le sulfate de cuivre est inefficace pour empêcher les vers de fuir lorsque des conditions environnementales aversives sont présentes, y compris des restrictions alimentaires, des bactéries pathogènes ou des produits chimiques qui induisent un stress cellulaire (par exemple, le paraquat).
Un deuxième système qui utilise des milieux solides est le Worm Corral, qui utilise un hydrogel pour créer un petit environnement étanche pour chaque ver sur une lame, permettant une surveillance à long terme des animaux isolés individuellement16. Une limitation clé est que les animaux doivent être scellés dans l’environnement sous forme d’œufs, ce qui nécessite l’utilisation d’animaux stériles pour empêcher la reproduction et limite les traitements médicamenteux à une seule application. Les essais de médicaments multidoses peuvent être réalisés dans le WorMotel soit en effectuant plusieurs cycles d’exposition avant de transférer les vers dans l’appareil, soit en ajoutant localement des médicaments supplémentaires aux puits pendant l’expérience; Cependant, dans ce dernier cas, la dose réelle d’exposition après l’ajout d’un médicament supplémentaire à un puits existant est difficile à quantifier avec précision et dépend de la rapidité avec laquelle le médicament se dégrade. Le WorMotel et le Worm Corral sont excellents pour l’imagerie en fond clair ou en fond noir afin de capturer des informations liées à l’activité et à la physiologie animale (par exemple, la croissance et le développement). Bien que ces systèmes puissent être utilisés pour surveiller la fluorescence, selon notre expérience, le PDMS utilisé pour créer les autres technologies d’imagerie à ver unique est susceptible de former des microbulles, de capturer des particules et d’autres petites anomalies qui génèrent des artefacts fluorescents irréguliers qui interfèrent avec la visualisation et la quantification cohérentes de la fluorescence, en particulier dans la plage d’émission de GFP, le fluorophore le plus couramment utilisé dans la recherche sur C. elegans. À ce jour, l’imagerie par fluorescence vivante de C. elegans d’animaux individuels de manière longitudinale repose principalement sur des dispositifs microfluidiques17.
Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de culture de C. elegans individuels sur des milieux solides qui est compatible à la fois avec les interventions aversives et l’imagerie fluorescente directe. Cette approche est similaire dans son concept à d’autres technologies d’imagerie à ver unique, sauf que la puce PDMS moulée sur mesure est remplacée par des microplateaux en polystyrène disponibles dans le commerce développés à l’origine pour les tests de microcytotoxicité (aussi communément appelés plateaux Terasaki)18. Ces microplateaux comportent des puits qui peuvent être remplis de milieux solides et ensemencés avec des aliments bactériens, imitant étroitement l’environnement vécu par les animaux selon la méthodologie standard de culture de NGM solide. Chaque puits est entouré d’une barrière aversive d’acide palmitique plutôt que de sulfate de cuivre. L’acide palmitique est couramment utilisé pour empêcher les vers de fuir les milieux solides, en utilisant une culture de groupe standard sur des plaques de Petri dans des expériences où les vers sont confrontés à un environnement aversif comme une restriction alimentaire ou une exposition à un facteur de stress chimique. Les microplateaux produisent également un fond fluorescent minimal et cohérent, permettant l’imagerie fluorescente des animaux directement dans leur environnement de culture. Ce nouveau système de culture à base de gélose solide à animal unique permet non seulement de suivre les animaux individuels tout au long de la vie et de surveiller la croissance, le développement, l’activité et la durée de vie, mais il est également compatible avec la microscopie fluorescente directe. Parce que les vers peuvent être imagés sans paralysie ni fixation, les biomarqueurs de fluorescence in vivo peuvent être quantifiés longitudinalement chez les animaux individuels restant sur leur milieu de culture, permettant l’observation des changements dynamiques au cours de la vie de chaque animal. Ce système de culture est également compatible avec les systèmes automatisés de la génération actuelle pour le suivi de la durée de vie et d’autres paramètres de santé14,19. Nous fournissons un protocole détaillé pour la culture individuelle de C. elegans dans ce système à base de microplateau, discutons des pièges potentiels et du dépannage, et discutons des avantages et des limites par rapport aux autres systèmes, et en particulier, un protocole WorMotel mis à jour et optimisé15.
Chaque environnement de culture à vis sans fin unique se compose d’un microplateau monté à l’intérieur d’un plateau standard à puits unique à l’aide d’un adaptateur personnalisé imprimé en 3D (Figure 1A). Les puits sont remplis de milieux de croissance de nématodes agarose à faible point de fusion (lmNGM), ensemencés de bactéries concentrées comme source de nourriture et entourés d’un revêtement d’acide palmitique pour empêcher les vers de fuir (figure 1B). L’espace entre le microplateau et les parois de la plaque à puits unique est rempli de cristaux d’eau saturés pour maintenir l’humidité (Figure 1B). Un revêtement détergent est appliqué sur le couvercle du plateau pour éviter la condensation. Un seul ver est ajouté à chaque puits, et le plateau à puits unique est scellé avec du parafilm pour maintenir l’humidité et permettre l’échange d’oxygène. Jusqu’à six microplateaux peuvent raisonnablement être préparés en parallèle par un seul chercheur expérimenté.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

Caenorhabditis elegans est largement utilisé pour étudier la biologie du vieillissement. La pratique courante dans les études sur le vieillissement de C. elegans consiste à cultiver des groupes de vers sur des milieux de croissance de nématodes solides (NGM), ce qui permet la collecte efficace de données au niveau de la population pour la survie et d’autres phénotypes physiologiques, et l’échantillonnage périodique des sous-populations pour la quantification des biomarqueurs fluorescents. Les limites de cette approche sont l’incapacité (1) de suivre les vers individuels au fil du temps pour développer des trajectoires d’âge pour les phénotypes d’intérêt et (2) de surveiller les biomarqueurs fluorescents directement dans le contexte de l’environnement de culture. Les approches de culture alternatives utilisent la culture liquide ou la microfluidique pour surveiller les animaux individuels au fil du temps, dans certains cas, y compris la quantification de la fluorescence, avec le compromis que l’environnement de culture est contextuellement distinct du NGM solide. Le WorMotel est un dispositif multipuits microfabriqué décrit précédemment pour la culture de vers isolés sur NGM solide. Chaque ver est maintenu dans un puits contenant des NGM solides entouré d’un fossé rempli de sulfate de cuivre, un répulsif de contact pour C. elegans, permettant une surveillance longitudinale des animaux individuels. Nous trouvons que le sulfate de cuivre est insuffisant pour empêcher les vers de fuir lorsqu’ils sont soumis à des interventions aversives courantes dans la recherche sur le vieillissement, y compris la restriction alimentaire, les bactéries pathogènes et les agents chimiques qui induisent un stress cellulaire. Les dispositifs multipuits sont également moulés à partir de polydiméthylsiloxane, qui produit des artefacts de fond élevés en imagerie par fluorescence. Ce protocole décrit une nouvelle approche pour la culture de vers ronds isolés sur NGM solide à l’aide de microplateaux en polystyrène disponibles dans le commerce, conçus à l’origine pour le typage de l’antigène leucocytaire humain (HLA), permettant de mesurer la survie, les phénotypes physiologiques et la fluorescence tout au long de la vie. Une barrière d’acide palmitique empêche les vers de fuir, même en présence de conditions aversives. Chaque plaque peut cultiver jusqu’à 96 animaux et s’adapte facilement à une variété de conditions, y compris les restrictions alimentaires, l’ARNi et les additifs chimiques, et est compatible avec les systèmes automatisés de collecte de données sur la durée de vie et l’activité.

L’environnement de culture de vers uniques à base de microplateaux décrit ici peut être utilisé pour surveiller une variété de phénotypes, y compris la durée de vie et la durée de santé, l’activité et le mouvement, la forme du corps et la géométrie rampante, et l’expression de biomarqueurs fluorescents exprimés transgéniquement chez des animaux individuels au fil du temps. Le système de culture de microplateaux est compatible avec l’analyse de la durée de vie par notation manuelle ou collecte d?...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Ici, nous présentons un protocole de culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides pour le suivi des paramètres physiologiques tout au long de la vie et la quantification de la fluorescence. Ce système de culture comprend une barrière d’acide palmitique autour des puits à ver unique pour empêcher les animaux de fuir, ce qui permet l’utilisation d’interventions aversives, y compris des bactéries pathogènes et des facteurs de stress chimiques.

Culture à long terme de Caenorhabditis elegans individuelle sur milieu solide pour la surveillance longitudinale de la fluorescence et les interventions aversives

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Bien qu’il existe d’autres méthodes de culture solide, il s’agit du premier système de culture solide qui permet un suivi longitudinal automatisé de la vie et de la santé des animaux individuels et l’imagerie longitudinale de biomarqueurs fluorescents dans un seul système. Ce protocole fournit des résultats comparables aux expériences standard de C. elegans sur NGM solide et compatible avec les interventions aversives et l’imagerie directe par fluorescence en direct. Ce système sera inestimable pour la recherche sur le vieillissement, en particulier en ce qui concerne l’exposition à long terme aux facteurs de stress environnementaux et l’observation de la dynamique des gènes et des protéines sur de longues périodes.Éviter la contamination et obtenir un séchage constant à travers les puits sont tous deux difficiles. Nous avons souligné les points clés du protocole écrit afin de minimiser ces problèmes. Pour commencer, broyez 500 milligrammes d’acide palmitique solide dans un mortier et un pilon.Combinez-le avec 15 millilitres de TWEEN 20 dans un flacon conique de 50 millilitres et mélangez par vortex pour dissoudre les cristaux. Ajouter 17,5 millilitres d’éthanol à 100% et vortex la solution pour dissoudre autant d’acide palmitique que possible. Ajoutez ensuite 17,5 millilitres d’eau ultrapure et vortex vigoureusement.Chauffer doucement la solution dans un bain de billes à 80 degrés Celsius jusqu’à ce que l’acide palmitique se dissolve complètement. Réchauffez le bain de perles à 80 degrés Celsius. Immédiatement avant utilisation, aliquote d’un millilitre de solution de travail d’acide palmitique par microplateau dans un récipient stérile séparé et ajouter quatre microlitres de nystatine par millilitre de solution d’acide palmitique avant chauffage.Maintenant, vaporisez à l’intérieur et à l’extérieur du microplateau avec de l’éthanol jusqu’à saturation et secouez l’excès d’éthanol. Pour stériliser le microplateau, placez la plaque et le couvercle séparément dans la réticulation UV. Après 20 minutes, retournez l’assiette et le couvercle.Ensuite, placez le flacon de 15 millilitres avec la solution de travail d’acide palmitique dans le bain de billes et laissez les cristaux visibles se dissoudre complètement avant utilisation. Réchauffez le microplateau en le plaçant sur le rebord entourant le bain de perles avec les couvercles pendant deux minutes. Retirez le couvercle du microplateau et ajoutez lentement 200 microlitres de solution de travail à l’acide palmitique sur la paroi arrière du microplateau.Replacez les couvercles et laissez le microplateau reposer sur le bain de billes pendant deux à trois minutes pour permettre à la solution d’acide palmitique de se déposer au fond du microplateau. Faites pivoter le microplateau de 180 degrés et ajoutez la solution de travail à l’acide palmitique comme démontré précédemment. Préparez lmNGM en ajoutant les composants décrits dans le manuscrit.Ensuite, pipeter 20 microlitres de lmNGM dans chaque microplateau placé sur le banc. Assurez-vous de couvrir le microplateau lors du remplissage de la pipette pour minimiser la contamination. Pour ensemencer les puits Microtray avec de la nourriture bactérienne, centrifuger une culture cultivée pendant la nuit à 3 500 G pendant 20 minutes.Retirer le surnageant et remettre en suspension la culture bactérienne à une concentration décuplée avec une solution de chlorure de sodium de 85 millimolaires. Ensuite, versez soigneusement cinq microlitres de culture bactérienne concentrée dix fois sur la surface du lmNGM dans chaque puits. Évitez de laisser la culture bactérienne couler sur le côté du puits et dans l’acide palmitique, car cela inciterait les vers à quitter le puits.Placez l’insert stérile imprimé en 3D dans une plaque stérile à puits unique. Placez le microbac dans l’adaptateur imprimé en 3D dans la plaque à puits unique. Distribuez généreusement des cristaux d’eau sur le dessus de l’insert imprimé en 3D entre le puits extérieur du microplateau et la paroi interne de la plaque à puits unique.Si les vers ne sont pas ajoutés immédiatement, scellez le microbac pour l’utiliser le lendemain. Fermez le couvercle du plateau et utilisez un seul morceau de Parafilm pour envelopper les quatre côtés afin de sceller le microplateau. Répétez l’étape d’étanchéité avec Parafilm deux fois de plus pour trois couches.Ajoutez un ver par puits une fois qu’ils ont atteint le stade de vie souhaité. Ajoutez 40 microlitres de solution détergente au couvercle d’une plaque à puits unique et utilisez une lingette de travail pour enduire le couvercle uniformément. Utilisez des lingettes de travail supplémentaires pour étaler la solution détergente jusqu’à ce que la vision à travers le couvercle ne soit pas déformée.Étirez légèrement le premier morceau de Parafilm pour couvrir deux côtés du plateau. Essuyez le haut du plateau avec une lingette de tâche et humidifiez-le avec de l’éthanol à 70% pour éliminer les empreintes digitales. Mesurez la durée de vie en tapotant doucement le côté ou le haut de la plaque, ou en faisant briller une lumière bleue brillante sur l’assiette et en observant chaque animal.Marquez un animal mort s’il ne bouge pas en quelques secondes. Répétez cette tâche tous les un à trois jours jusqu’à ce que tous les vers soient morts. Effectuez une imagerie fluorescente sur des puits uniques.L’exposition au sulfate de cuivre et au dithiothréitol a considérablement réduit la durée de vie et la durée de vie des vers. En revanche, le sulfate de cuivre a diminué la proportion de vie passée en bonne santé, alors que le dithiothréitol ne l’a pas fait. Le sulfate de cuivre a réduit l’activité moyenne chez les individus de la population dans une plus grande mesure que le dithiothréitol à tous les âges.La moyenne de la population de la zone animale individuelle sous la courbe d’activité de la vie est considérablement altérée par le sulfate de cuivre ou le dithiothréitol. L’activité cumulative pour les animaux individuels jusqu’au jour 10 est en corrélation avec leur durée de vie pour les animaux exposés au dithiothréitol, mais pas pour les témoins non traités ou les animaux exposés au sulfate de cuivre. Une augmentation drastique de l’expression de KYNU-1 est observée entre les jours trois et huit de l’âge adulte, et il y a une diminution progressive avec l’âge après cela.L’expression cumulative de KYNU-1 mScarlet jusqu’au jour 14 de l’âge adulte est en corrélation avec la durée de vie des animaux. Étant donné que l’expression de KYNU-1 est dynamique tout au long de la vie, nous avons comparé l’expression de KYNU-1 à différents âges à la survie globale des animaux individuels. À aucun moment donné, l’expression de KYNU-1 n’a été significativement corrélée à la survie.Lors de la tentative de cette procédure, les étapes les plus importantes sont l’ajout de l’acide palmitique, le pipetage de l’agar et l’introduction des vers. Cette technique permet un suivi longitudinal de la durée de vie et de la durée de santé, ainsi que des biomarqueurs fluorescents chez des vers individuels d’une manière directement comparable aux tests NGM.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Mesure Caenorhabditis elegans</emDurée de vie> sur des milieux solides

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Recherche

Biologie

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solide plaque à base de restriction alimentaire Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Culture à long terme des spécimens humains de cancer du sein et leur analyse en utilisant la tomographie optique de projection

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

À long terme des essais de toxicité létale avec le Crustacé Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

De base<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Méthodes: Synchronisation et d&#39;observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Multicouche de montage pour à long terme Fiche microscopie optique de poisson zèbre

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culture<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; En Axenic Liquid Media et création d&#39;transgéniques Worms par bombardement de microparticules

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolation, transfection et culture à long terme des cardiomyocytes adultes de souris et de rats

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Imagerie sans étiquette de la dynamique de stockage des lipides chez Caenorhabditis elegans à l’aide de la microscopie de diffusion Raman stimulée

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisation de la quantification agrégée chez Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...