Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH R35GM133588 für G.L.S., ein NIHT32GM008659-Ausbildungsstipendium für L.E., einen United States National Academy of Medicine Catalyst Award für G.L.S. und den State of Arizona Technology and Research Initiative Fund, der vom Arizona Board of Regents verwaltet wird.

1. Rezepte
Anmerkungen: Bereiten Sie Stammlösungen vor, bevor Sie mit der Vorbereitung der Mikroschalenplatte beginnen.
<ol><li>Lagerlösungen für niedrigschmelzende Agarosenematoden-Nährmedien (lmNGM)<ol><li>Bereiten Sie 1 M K 2 HPO4 vor, indem Sie 174,18 g K2HPO4in 1 l sterilem deionisiertem Wasser in einer 1-Liter-Flasche auflösen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psi, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei Raumtemperatur ...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. 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P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. 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Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

In dieser Arbeit beschreiben wir ein neuartiges Kultursystem, das Mikroschalen, die ursprünglich für humane Leukozytenantigen-Gewebetypisierungsassays entwickelt wurden, so anpasst, dass sie die Isolierung und Charakterisierung einzelner C. elegans im Laufe der Zeit in einer festen Medienumgebung ermöglichen, die kontextuell dem Agar-basierten NGM ähnelt, das der Standard in der C. elegans-Forschung ist. Dieses System ist mit einer Vielzahl von Interventionen kompatibel, darunter diätetische Restr...

C. elegans sind ein leistungsfähiger Modellorganismus für die Forschung in Genetik, Zellbiologie und Molekularbiologie, da sie leicht im Labor kultiviert werden können, eine kurze Generationszeit und Lebensdauer haben, ein hohes Maß an Proteinhomologie mit Säugetieren teilen und eine transparente Körperstruktur aufweisen, die die In-vivo-Visualisierung von fluoreszierenden Proteinen und Farbstoffen ermöglicht1. Als Ergebnis der langjährigen Verwendung von C. elegans als wichtiges Modellsystem in einer Reihe von Bereichen, einschließlich der Entwicklungsbiologie und des Alterns, sind ihr Wachstum und ihre Entwicklung gut verstanden, ihr Genom wurde vollständig sequenziert und eine Vielzahl leistungsfähiger genetischer Werkzeuge wurde entwickelt, darunter genomweite RNAi-Fütterungsbibliotheken und Tausende von mutierten und transgenen Stämmen. Historisch gesehen werden C. elegans als Populationen auf soliden Agar-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) kultiviert, und Phänotypen werden manuell entweder durch direkte Beobachtung oder durch Bildgebung und nachgelagerte Analyse bewertet. Die Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um eine Vielzahl von molekularen Phänotypen mit Farbstoffen oder transgen exprimierten Fluoreszenzmarkierungen in einzelnen C. elegans zu erfassen.Bei der Fluoreszenzbildgebung wird in der Regel ein Tier auf Objektträgern mit dünnen Agarosepolstern fixiert oder gelähmt, was invasiv und oft tödlich ist. Es beinhaltet auch den Einsatz von Chemikalien wie Levamisol oder Natriumazid, die möglicherweise in den interessierenden molekularen Prozess eingreifen können 2,3. Zusammen ermöglichen diese Ansätze die Erhebung von Querschnittsdaten auf Populationsebene über ein breites Spektrum von Phänotypen, erlauben jedoch nicht die Verfolgung einzelner Tiere im Laufe der Zeit.
In den letzten Jahren haben sich mehrere Ansätze zur Kultivierung isolierter C. elegans herausgebildet, die es Forschern ermöglichen, dynamische Veränderungen der physiologischen und molekularen Phänotypen von Tieren im Laufe der Zeit mithilfe neuer Bildgebungstechnologien zu erfassen. Eine Kategorie des Ansatzes der C. elegans-Kultur sind mikrofluidische Geräte, darunter WormFarm4, der Nemalife-Chip5 und der "Verhaltens"-Chip von Chronis et al.6, neben verschiedenen anderen 7,8,9. Verwandt damit sind flüssige Kulturmethoden, die Multi-Well-Platten verwenden, um einzelne Würmer oder kleine Populationen über die Zeit zu charakterisieren10,11. Mikrofluidik und Mikrotiterplattensysteme liefern hervorragende quantitative Messungen der phänotypischen Reaktionen in C. elegans bis hinunter zu einem einzelnen Tier, aber die Kulturumgebung stellt eine wesentliche Einschränkung dar. Die überwiegende Mehrheit der bisherigen Forschungen zu C. elegans, insbesondere auf dem Gebiet des Alterns, wurde auf festen Agar-basierten Medien durchgeführt. Die Flüssigkultur führt dazu, dass C. elegans kontinuierlich schwimmt und stellt einen bestimmten Umweltkontext dar, der die zugrunde liegende Biologie verändern kann. Zum Beispiel haben Tiere, die in flüssigen Medien kultiviert wurden, einen drastisch veränderten Fettgehalt und eine drastische Genexpression – insbesondere für Gene, die an der Stressantwort beteiligt sind – im Vergleich zu Tieren, die auf agarbasiertem festem NGM12,13 kultiviert wurden. Eine alternative Kategorie von Einzeltier-Bildgebungsverfahren sind Polydimethylsiloxan (PDMS)-Geräte, die einzelne Tiere auf festen Medien isolieren, um die Standardumgebung von Würmern, die auf festem NGM kultiviert wurden, in Gruppenkultur auf Petriplatten besser nachzuahmen. Das WorMotel ist ein 240-Well-PDMS-Gerät, das für die Kultivierung einzelner Tiere auf festen Medien entwickelt wurde. Jede Vertiefung wird mit einem modifizierten NGM gefüllt, bei dem anstelle von Agar niedrigschmelzende Agarose verwendet wird, und mit bakterieller Nahrung besiedelt, wodurch eine feste Medienumgebung entsteht, die dem gängigsten Kultursystem mit Petriplatten ähnelt. Die Wände des Brunnens sind rund, so dass jedes Tier unabhängig von seinem Standort im Brunnen abgebildet werden kann (wodurch die visuelle Verschleierung durch ein Tier in der Nähe einer Wand in einer Multiwell-Platte vermieden wird). Kupfersulfat in einem schmalen Graben, der jeden Brunnen umgibt, wird als Abschreckungsmittel verwendet, um Tiere in ihren Brunnen zu halten14,15. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass das Kupfersulfat unwirksam ist, um Würmer an der Flucht zu hindern, wenn aversive Umweltbedingungen vorliegen, einschließlich Ernährungseinschränkungen, pathogener Bakterien oder Chemikalien, die zellulären Stress induzieren (z. B. Paraquat).
Ein zweites System, das feste Medien verwendet, ist der Worm Corral, bei dem ein Hydrogel verwendet wird, um für jeden Wurm auf einem Objektträger eine kleine versiegelte Umgebung zu schaffen, die eine Langzeitüberwachung einzelner isolierter Tiere ermöglicht16. Eine wesentliche Einschränkung besteht darin, dass Tiere als Eier in der Umwelt versiegelt werden müssen, was die Verwendung steriler Tiere erfordert, um die Fortpflanzung zu verhindern, und die medikamentöse Behandlung auf eine einzige Anwendung beschränkt. Mehrdosis-Arzneimittelstudien können im WorMotel durchgeführt werden, indem entweder mehrere Expositionsrunden durchgeführt werden, bevor die Würmer auf das Gerät übertragen werden, oder indem während des Experiments zusätzliche Medikamente topisch in die Vertiefungen gegeben werden. Im letzteren Fall ist die tatsächliche Expositionsdosis nach Zugabe eines zusätzlichen Medikaments zu einer bestehenden Bohrung jedoch schwer genau zu quantifizieren und hängt davon ab, wie schnell das Medikament abgebaut wird. Sowohl das WorMotel als auch der Worm Corral eignen sich hervorragend für Hellfeld- oder Dunkelfeldaufnahmen, um Informationen über Aktivität und Tierphysiologie (z. B. Wachstum und Entwicklung) zu erfassen. Während diese Systeme zur Überwachung der Fluoreszenz verwendet werden können, ist das PDMS, das zur Herstellung der anderen Einzelwurm-Bildgebungstechnologien verwendet wird, unserer Erfahrung nach anfällig für die Bildung von Mikrobläschen, das Einfangen von Partikeln und andere kleine Anomalien, die unregelmäßige Fluoreszenzartefakte erzeugen, die eine konsistente Fluoreszenzvisualisierung und -quantifizierung beeinträchtigen, insbesondere im Emissionsbereich für GFP, den am häufigsten in der C. elegans-Forschung verwendeten Fluorophor. Bisher stützt sich die Live-Fluoreszenzbildgebung von C. elegans-Individuen im Längsschnitt hauptsächlich auf mikrofluidische Geräte17.
In dieser Arbeit beschreiben wir eine neuartige Methode zur Kultivierung einzelner C. elegans auf festen Medien, die sowohl mit aversiven Interventionen als auch mit direkter Fluoreszenzbildgebung kompatibel ist. Dieser Ansatz ähnelt vom Konzept her anderen Einzelwurm-Bildgebungstechnologien, mit der Ausnahme, dass der kundenspezifisch geformte PDMS-Chip durch kommerziell erhältliche Polystyrol-Mikroschalen ersetzt wird, die ursprünglich für Mikrozytotoxizitätsassays entwickelt wurden (auch allgemein als Terasaki-Schalen bezeichnet)18. Diese Mikroschalen verfügen über Vertiefungen, die mit festem Medium gefüllt und mit bakteriellem Futter besiedelt werden können, wodurch die Umgebung, die Tiere mit der Standardmethode der festen NGM-Kultur erleben, genau nachgeahmt wird. Jede Vertiefung ist von einer aversiven Barriere aus Palmitinsäure anstelle von Kupfersulfat umgeben. Palmitinsäure wird häufig verwendet, um Würmer daran zu hindern, aus festen Medien zu fliehen, wobei Standardgruppenkulturen auf Petriplatten in Experimenten verwendet werden, in denen Würmer mit einer aversiven Umgebung wie Ernährungseinschränkungen oder der Exposition gegenüber einem chemischen Stressor konfrontiert werden. Die Mikroschalen erzeugen auch einen minimalen und konsistenten fluoreszierenden Hintergrund, was eine fluoreszierende Bildgebung von Tieren direkt in ihrer Kulturumgebung ermöglicht. Dieses neue Kultursystem auf Basis von festem Agar ermöglicht nicht nur die lebenslange Verfolgung einzelner Tiere und die Überwachung von Wachstum, Entwicklung, Aktivität und Lebensdauer, sondern ist auch mit der direkten Fluoreszenzmikroskopie kompatibel. Da die Würmer ohne Lähmung oder Fixierung abgebildet werden können, können In-vivo-Fluoreszenz-Biomarker in einzelnen Tieren, die auf ihren Nährmedien verbleiben, longitudinal quantifiziert werden, was die Beobachtung dynamischer Veränderungen über die Lebenszeit jedes Tieres ermöglicht. Dieses Kultursystem ist auch mit automatisierten Systemen der aktuellen Generation kompatibel, um die Lebensdauer und andere Gesundheitsmetriken zu verfolgen14,19. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Kultivierung einzelner C. elegans in diesem Microtray-basierten System zur Verfügung, diskutieren mögliche Fallstricke und Fehlerbehebungen und diskutieren die Vorteile und Einschränkungen im Vergleich zu anderen Systemen und insbesondere ein aktualisiertes und optimiertes WorMotel-Protokoll15.
Jede Einzelschneckenkulturumgebung besteht aus einem Mikrotablett, das mit einem kundenspezifischen 3D-gedruckten Adapter in einem Standard-Single-Well-Tray montiert ist (Abbildung 1A). Die Vertiefungen sind mit niedrigschmelzenden Agarose-Nematoden-Wachstumsmedien (lmNGM) gefüllt, die mit konzentrierten Bakterien als Nahrungsquelle besiedelt und von einer Palmitinsäurebeschichtung umgeben sind, um die Flucht der Würmer zu verhindern (Abbildung 1B). Der Raum zwischen der Mikroschale und den Wänden der Single-Well-Platte ist mit gesättigten Wasserkristallen gefüllt, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten (Abbildung 1B). Der Tablettdeckel wird mit einer Reinigungsmittelbeschichtung versehen, um Kondensation zu verhindern. In jede Vertiefung wird eine einzelne Schnecke gegeben, und die Einvertiefungsschale ist mit Parafilm versiegelt, um die Feuchtigkeit zu erhalten und den Sauerstoffaustausch zu ermöglichen. Bis zu sechs Microtrays können von einem einzigen erfahrenen Forscher sinnvoll parallel präpariert werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

Caenorhabditis elegans wird häufig zur Erforschung der Biologie des Alterns verwendet. Die Standardpraxis in Studien zum Altern von C. elegans besteht darin, Gruppen von Würmern auf soliden Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) zu kultivieren, was die effiziente Erfassung von Daten auf Populationsebene für das Überleben und andere physiologische Phänotypen sowie die regelmäßige Probenahme von Subpopulationen zur Quantifizierung fluoreszierender Biomarker ermöglicht. Einschränkungen dieses Ansatzes sind die Unfähigkeit, (1) einzelne Würmer über die Zeit zu verfolgen, um Altersverläufe für Phänotypen von Interesse zu entwickeln, und (2) fluoreszierende Biomarker direkt im Kontext der Kulturumgebung zu überwachen. Alternative Kulturansätze verwenden Flüssigkultur oder Mikrofluidik, um einzelne Tiere im Laufe der Zeit zu überwachen, in einigen Fällen einschließlich Fluoreszenzquantifizierung, mit dem Kompromiss, dass sich die Kulturumgebung kontextuell von festem NGM unterscheidet. Das WorMotel ist ein zuvor beschriebenes mikrofabriziertes Multi-Well-Gerät zur Kultivierung isolierter Würmer auf festem NGM. Jeder Wurm wird in einem Brunnen mit festem NGM gehalten, der von einem mit Kupfersulfat gefüllten Graben umgeben ist, einem Kontaktschutzmittel für C. elegans, das eine longitudinale Überwachung der einzelnen Tiere ermöglicht. Wir stellen fest, dass Kupfersulfat nicht ausreicht, um Würmer an der Flucht zu hindern, wenn sie aversiven Eingriffen ausgesetzt sind, die in der Alternsforschung üblich sind, einschließlich Ernährungseinschränkungen, pathogenen Bakterien und chemischen Wirkstoffen, die zellulären Stress induzieren. Die Multi-Well-Geräte sind ebenfalls aus Polydimethylsiloxan geformt, das bei der Fluoreszenzbildgebung hohe Hintergrundartefakte erzeugt. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Ansatz für die Kultivierung isolierter Fadenwürmer auf festem NGM unter Verwendung kommerziell erhältlicher Polystyrol-Mikroschalen, die ursprünglich für die Typisierung des humanen Leukozytenantigens (HLA) entwickelt wurden und die Messung des Überlebens, der physiologischen Phänotypen und der Fluoreszenz über die gesamte Lebensspanne ermöglichen. Eine Palmitinsäurebarriere verhindert die Flucht von Würmern, auch bei aversiven Bedingungen. Jede Platte kann bis zu 96 Tiere kultivieren und passt sich leicht an eine Vielzahl von Bedingungen an, einschließlich diätetischer Restriktionen, RNAi und chemischer Zusätze, und ist mit automatisierten Systemen zur Erfassung von Lebensdauer- und Aktivitätsdaten kompatibel.

Die hier beschriebene Mikroschalen-basierte Einzelwurmkulturumgebung kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Phänotypen zu überwachen, einschließlich Lebens- und Gesundheitsspanne, Aktivität und Bewegung, Körperform und Krabbelgeometrie sowie die Expression transgen exprimierter fluoreszierender Biomarker in einzelnen Tieren über die Zeit. Das Mikroschalen-Kultursystem ist mit der Lebensdaueranalyse kompatibel, entweder durch manuelles Scoring oder durch Bilderfassung und nachgeschaltete Bildgebungsanalyse. Wie...

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Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um isolierte einzelne Nematoden auf festen Medien zu kultivieren, um eine lebenslange Verfolgung physiologischer Parameter und eine Fluoreszenzquantifizierung zu ermöglichen. Dieses Kultursystem umfasst eine Palmitinsäurebarriere um einzelne Wurmbrunnen, um die Flucht der Tiere zu verhindern, was den Einsatz aversiver Interventionen, einschließlich pathogener Bakterien und chemischer Stressoren, ermöglicht.

Langzeitkultur einzelner Caenorhabditis elegans auf festen Medien für longitudinales Fluoreszenzmonitoring und aversive Interventionen

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Während es andere feste Kulturmethoden gibt, ist dies das erste feste Kultursystem, das eine automatisierte longitudinale Verfolgung des Lebens und der Gesundheitsspanne einzelner Tiere sowie die longitudinale Bildgebung von fluoreszierenden Biomarkern in einem System ermöglicht. Dieses Protokoll liefert vergleichbare Ergebnisse wie Standard-C.elegans-Experimente an festem NGM und ist sowohl mit aversiven Interventionen als auch mit direkter Live-Fluoreszenzbildgebung kompatibel. Dieses System wird für die Alternsforschung von unschätzbarem Wert sein, insbesondere im Hinblick auf die langfristige Exposition gegenüber Umweltstressoren und die Beobachtung der Gen- und Proteindynamik über längere Zeiträume.Sowohl die Vermeidung von Verunreinigungen als auch die gleichmäßige Trocknung der Bohrlöcher sind eine Herausforderung. Wir haben wichtige Punkte im schriftlichen Protokoll hervorgehoben, um diese Probleme zu minimieren. Mahlen Sie zunächst 500 Milligramm feste Palmitinsäure in einem Mörser und Stößel.Kombinieren Sie es mit 15 Millilitern TWEEN 20 in einem konischen 50-Milliliter-Fläschchen und mischen Sie es durch Wirbeln, um die Kristalle aufzulösen. Fügen Sie 17,5 Milliliter 100%iges Ethanol hinzu und wirbeln Sie die Lösung, um so viel Palmitinsäure wie möglich aufzulösen. Dann 17,5 Milliliter Reinstwasser dazugeben und kräftig wirbeln.Erhitzen Sie die Lösung vorsichtig in einem Perlenbad bei 80 Grad Celsius, bis sich die Palmitinsäure vollständig aufgelöst hat. Das Perlenbad auf 80 Grad Celsius erhitzen. Aliquotieren Sie unmittelbar vor Gebrauch einen Milliliter der Palmitinsäure-Arbeitslösung pro Microtray in einen separaten sterilen Behälter und fügen Sie vor dem Erhitzen vier Mikroliter Nystatin pro einem Milliliter Palmitinsäurelösung hinzu.Besprühen Sie nun innen und außen mit Ethanol bis zur Sättigung und schütteln Sie das überschüssige Ethanol ab. Um das Microtray zu sterilisieren, legen Sie die Platte und den Deckel separat in den UV-Vernetzer. Nach 20 Minuten den Teller und den Deckel umdrehen.Als nächstes stellen Sie die konische 15-Milliliter-Durchstechflasche mit der Palmitinsäure-Arbeitslösung in das Perlenbad und lassen Sie alle sichtbaren Kristalle vor Gebrauch vollständig auflösen. Erwärmen Sie das Microtray, indem Sie es zwei Minuten lang mit aufgesetzten Deckeln auf die Kante legen, die das Perlenbad umgibt. Entfernen Sie den Deckel des Microtrays und geben Sie langsam 200 Mikroliter Palmitinsäure-Arbeitslösung über die Rückwand des Microtrays.Setzen Sie die Deckel wieder auf und lassen Sie das Microtray zwei bis drei Minuten auf dem Perlenbad stehen, damit sich die Palmitinsäurelösung auf dem Boden des Microtrays absetzen kann. Drehen Sie das Microtray um 180 Grad und fügen Sie die Palmitinsäure-Arbeitslösung hinzu, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie lmNGM vor, indem Sie die im Manuskript beschriebenen Komponenten hinzufügen.Pipettieren Sie dann 20 Mikroliter lmNGM in jedes Mikrotablett, das auf der Bank platziert ist. Achten Sie darauf, das Microtray beim Nachfüllen der Pipette abzudecken, um eine Kontamination zu minimieren. Um die Microtray-Vertiefungen mit bakteriellem Futter zu besiedeln, zentrifugieren Sie eine Kultur, die über Nacht bei 3.500 G gezüchtet wurde, 20 Minuten lang.Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Bakterienkultur in zehnfacher Konzentration mit 85 millimolarer Natriumchloridlösung. Pipettieren Sie dann vorsichtig fünf Mikroliter zehnfach konzentrierte Bakterienkultur auf die Oberfläche des lmNGM in jede Vertiefung. Vermeiden Sie es, die Bakterienkultur über die Seite des Brunnens und in die Palmitinsäure laufen zu lassen, da dies Würmer anlockt, die Vertiefung zu verlassen.Legen Sie den sterilen 3D-gedruckten Einsatz in eine sterile Single-Well-Platte. Setzen Sie das Microtray in den 3D-gedruckten Adapter in der Single-Well-Platte ein. Verteilen Sie die Wasserkristalle großzügig auf den 3D-gedruckten Einsatz zwischen der äußeren Vertiefung des Microtrays und der Innenwand der Single-Well-Platte.Wenn Würmer nicht sofort hinzugefügt werden, verschließen Sie die Microtray, um sie am nächsten Tag zu verwenden. Schließen Sie den Deckel des Tabletts und wickeln Sie alle vier Seiten mit einem einzigen Stück Parafilm ein, um das Microtray zu versiegeln. Wiederholen Sie den Versiegelungsschritt mit Parafilm noch zweimal für drei Schichten.Fügen Sie einen Wurm pro Vertiefung hinzu, sobald sie das gewünschte Lebensstadium erreicht haben. Geben Sie 40 Mikroliter Waschmittellösung auf den Deckel einer Single-Well-Platte und verwenden Sie ein Arbeitstuch, um den Deckel gleichmäßig zu beschichten. Verwenden Sie zusätzliche Tücher, um die Waschmittellösung zu verteilen, bis die Sicht durch den Deckel nicht mehr verzerrt ist.Dehnen Sie das erste Stück Parafilm leicht, um zwei Seiten des Tabletts zu bedecken. Wischen Sie die Oberseite des Fachs mit einem Task-Tuch ab und befeuchten Sie es mit 70%igem Ethanol, um Fingerabdrücke zu entfernen. Messen Sie die Lebensdauer, indem Sie vorsichtig auf die Seite oder Oberseite der Platte klopfen oder ein helles blaues Licht auf die Platte leuchten lassen und jedes Tier beobachten.Erziele ein totes Tier, wenn es sich nicht innerhalb weniger Sekunden bewegt. Wiederholen Sie diese Aufgabe alle ein bis drei Tage, bis alle Würmer abgestorben sind. Führen Sie Fluoreszenzbildgebung an einzelnen Wells durch.Die Exposition gegenüber Kupfersulfat und Dithiothreitol verkürzte die Lebensdauer und Gesundheit der Würmer signifikant. Im Gegensatz dazu verringerte Kupfersulfat den Anteil des Lebens, der bei guter Gesundheit verbracht wurde, während Dithiothreitol dies nicht tat. Kupfersulfat reduzierte die durchschnittliche Aktivität bei Individuen innerhalb der Bevölkerung in größerem Ausmaß als Dithiothreitol in allen Altersgruppen.Der Populationsdurchschnitt der Einzeltierfläche unter der Lebenszeitaktivitätskurve wird durch Kupfersulfat oder Dithiothreitol erheblich beeinträchtigt. Die kumulative Aktivität für einzelne Tiere bis zum 10. Tag korreliert mit ihrer Lebensspanne für Dithiothreitol-herausgeforderte Tiere, nicht jedoch für unbehandelte Kontrollen oder kupfersulfatbelastete Tiere. Zwischen dem dritten und achten Tag des Erwachsenenalters wird ein drastischer Anstieg der KYNU-1-Expression beobachtet, und danach kommt es mit zunehmendem Alter zu einem progressiven Rückgang.Die kumulative Expression von KYNU-1 mScarlet bis zum 14. Tag des Erwachsenenalters korreliert mit der Lebenserwartung der Tiere. Da die Expression von KYNU-1 über die gesamte Lebensspanne dynamisch ist, verglichen wir die Expression von KYNU-1 in verschiedenen Altersstufen mit dem Gesamtüberleben einzelner Tiere. Zu keinem Zeitpunkt korrelierte die KYNU-1-Expression signifikant mit dem Überleben.Bei diesem Verfahren sind die wichtigsten Schritte die Zugabe der Palmitinsäure, das Pipettieren des Agars und das Einbringen der Würmer. Diese Technik ermöglicht die longitudinale Verfolgung der Lebens- und Gesundheitsspanne sowie fluoreszierender Biomarker in einzelnen Würmern in einer Weise, die direkt mit NGM-Assays vergleichbar ist.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Forschung

Biologie

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solide Plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Langfristige Culture of Human Breast Cancer Proben und deren Analyse mit Hilfe von optischen Projektion Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Multilayer-Halterung für Langzeit-Licht-Mikroskopie Blatt der Zebrafisch

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Die Züchtung<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolation, Transfektion und Langzeitkultur von Erwachsenenmaus und Rattenkardiomyozyten

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Markierungsfreie Bildgebung der Lipidspeicherdynamik in Caenorhabditis elegans mit stimulierter Raman-Streumikroskopie

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...