Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R35GM133588 ל- G.L.S., מענק הכשרה NIHT32GM008659 ל- L.E., פרס Catalyst של האקדמיה הלאומית לרפואה של ארצות הברית ל- G.L.S., וקרן יוזמת הטכנולוגיה והמחקר של מדינת אריזונה המנוהלת על ידי מועצת העוצרים של אריזונה.

1. מתכונים
הערה: הכינו תמיסות מלאי לפני שתתחילו בהכנת צלחת מיקרו-מגש.
<ol><li>פתרונות מלאי עבור מדיה לגידול נמטודות אגרוז נמטודות נמוכות (lmNGM)<ol><li>הכן 1 M K 2 HPO4 על ידי המסת 174.18 גרם של K2HPO4 ב 1 ליטר של מים סטריליים deionized בבקבוק 1 L. Autoclave התמיסה ב 121 ° C, 15 psi, במשך...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research.">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021)</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

כאן, אנו מתארים מערכת תרבית חדשנית המתאימה מיקרו-מגשים, שפותחה במקור עבור בדיקות הקלדת רקמות אנטיגן לויקוציטים אנושיים, כדי לאפשר בידוד ואפיון של C. elegans בודדים לאורך זמן בסביבת מדיה מוצקה הדומה מבחינה קונטקסטואלית ל- NGM מבוסס אגר שהוא הסטנדרט במחקר C. elegans. מערכת זו תואמת למגוון ה?...

C. elegans הם אורגניזם מודל רב עוצמה למחקר בגנטיקה, ביולוגיה תאית וביולוגיה מולקולרית, מכיוון שהם מתורבתים בקלות במעבדה, יש להם זמן ותוחלת חיים קצרים של דור, חולקים רמה גבוהה של הומולוגיה חלבונית עם יונקים, ויש להם מבנה גוף שקוף המאפשר הדמיה in vivo של חלבונים פלואורסצנטיים וצבעים1. כתוצאה מהשימוש ארוך השנים ב-C. elegans כמערכת מודל מרכזית במגוון תחומים, כולל ביולוגיה התפתחותית והזדקנות, גדילתם והתפתחותם מובנים היטב, הגנום שלהם רוצף במלואו, ונוצרו שורה של כלים גנטיים רבי עוצמה, כולל ספריות הזנת RNAi ברחבי הגנום ואלפי זנים מוטנטיים וטרנסגניים. מבחינה היסטורית, C. elegans מעובדים כאוכלוסיות על מצע גידול נמטודות אגר מוצק (NGM), ופנוטיפים מוערכים ידנית על ידי תצפית ישירה או על ידי הדמיה וניתוח במורד הזרם. מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש ללכידת מגוון פנוטיפים מולקולריים באמצעות צבעים או תגים פלואורסצנטיים המבוטאים באופן מהונדס ב- C. elegans בודדים. הדמיה פלואורסצנטית כוללת בדרך כלל קיבוע או שיתוק של בעל חיים על מגלשות המכילות רפידות אגרוז דקות, שהן פולשניות ולעתים קרובות קטלניות. זה גם כרוך בשימוש בכימיקלים, כגון levamisole או נתרן azide, אשר עלול להפריע לתהליך המולקולרי של עניין 2,3. יחד, גישות אלה מאפשרות לאסוף נתוני חתך ברמת האוכלוסייה על פני מגוון רחב של פנוטיפים, אך אינן מאפשרות מעקב אחר בעלי חיים בודדים לאורך זמן.
בשנים האחרונות התפתחו מספר גישות לגידול C. elegans מבודדים, המאפשרות לחוקרים ללכוד שינויים דינמיים בפנוטיפים פיזיולוגיים ומולקולריים של בעלי חיים לאורך זמן תוך שימוש בטכנולוגיות הדמיה חדשות. קטגוריה אחת של גישת התרבית של C. elegans היא מכשירי מיקרופלואידיקה, כולל WormFarm4, שבב Nemalife5, ושבב 'התנהגות' של Chronis et al.6, בין היתר 7,8,9. לאלה קשורות שיטות תרבית מבוססות נוזל, המשתמשות בצלחות מרובות בארות כדי לאפיין תולעים בודדות או אוכלוסיות קטנות לאורך זמן10,11. מיקרופלואידיקה ומערכות מיקרו-צלחות מספקות מדידות כמותיות מצוינות של תגובות פנוטיפיות ב-C. elegans עד לחיה אחת, אך סביבת התרבית מהווה מגבלה מרכזית. הרוב המכריע של מחקרי העבר ב- C. elegans, במיוחד בתחום ההזדקנות, הושלם על מדיה מוצקה מבוססת אגר. תרבית נוזלית גורמת ל-C. elegans לשחות ברציפות ומייצגת הקשר סביבתי מובהק שיכול לשנות את הביולוגיה הבסיסית. לדוגמה, בעלי חיים שגודלו בתרבית במדיה נוזלית שינו באופן דרסטי את תכולת השומן ואת ביטוי הגנים – במיוחד עבור גנים המעורבים בתגובת העקה – בהשוואה לבעלי חיים שגודלו בתרבית על NGM מוצקמבוסס אגר 12,13. קטגוריה חלופית של שיטות הדמיה של בעלי חיים בודדים כוללת מכשירי פולידימתילסילוקסאן (PDMS) המבודדים בעלי חיים בודדים על מדיה מוצקה, במאמץ לחקות בצורה קרובה יותר את הסביבה הסטנדרטית שחוו תולעים שגודלו בתרבית על גז טבעי מוצק בתרבית קבוצתית על לוחות פטרי. ה-WorMotel הוא מכשיר PDMS בעל 240 בארות שנועד לגדל בעלי חיים בודדים על מדיה מוצקה. כל באר ממולאת בגז טבעי טבעי שעבר שינוי באמצעות אגרוז נמס נמוך במקום אגר ונזרע במזון חיידקי, מה שיוצר סביבת מדיה מוצקה הדומה למערכת התרבית הנפוצה ביותר באמצעות צלחות פטרי. קירות הבאר עגולים, ומאפשרים לצלם כל בעל חיים ללא קשר למיקומו בבאר (תוך הימנעות מטשטוש חזותי שנגרם על ידי בעל חיים ליד קיר בצלחת מרובת בארות). נחושת גופרתית בחפיר צר המקיף כל באר משמשת כגורם מרתיע להחזקת בעלי חיים בבארות שלהם14,15. מגבלה של גישה זו היא שהנחושת הגופרתית אינה יעילה במניעת בריחת תולעים כאשר קיימים תנאים סביבתיים מרתיעים, כולל הגבלה תזונתית, חיידקים פתוגניים או כימיקלים הגורמים לעקה תאית (למשל, פרקוואט).
מערכת שנייה המשתמשת במדיה מוצקה היא Worm Corral, המשתמשת בהידרוג'ל כדי ליצור סביבה אטומה קטנה לכל תולעת במגלשה, ומאפשרת ניטור ארוך טווח של בעלי חיים מבודדיםבנפרד 16. מגבלה מרכזית היא שבעלי חיים חייבים להיות אטומים לסביבה כביצים, מה שמחייב שימוש בבעלי חיים סטריליים כדי למנוע רבייה, והגבלת טיפולים תרופתיים ליישום יחיד. ניסויים בתרופות מרובות מינונים יכולים להתבצע בוורמוטל על ידי ביצוע סבבי חשיפה מרובים לפני העברת תולעים למכשיר או על ידי הוספה מקומית של תרופות נוספות לבארות במהלך הניסוי; עם זאת, במקרה האחרון, מנת החשיפה בפועל לאחר הוספת תרופה נוספת לבאר קיימת קשה לכימות מדויק ותלויה במהירות שבה התרופה מתפרקת. גם ה-WorMotel וגם ה-Worm Corral מצוינים להדמיית שדה בהיר או שדה אפל כדי ללכוד מידע הקשור לפעילות ולפיזיולוגיה של בעלי חיים (למשל, גדילה והתפתחות). בעוד שניתן להשתמש במערכות אלה כדי לנטר פלואורסצנטיות, מניסיוננו, PDMS המשמש ליצירת טכנולוגיות הדמיה אחרות של תולעת יחידה נוטה ליצור מיקרו-בועות, לכידת חלקיקים וחריגות קטנות אחרות היוצרות ממצאים פלואורסצנטיים לא סדירים המפריעים להדמיה וכימות פלואורסצנטיים עקביים, במיוחד בטווח הפליטה של GFP, הפלואורופור הנפוץ ביותר המשמש במחקר C. elegans. נכון להיום, הדמיה פלואורסצנטית חיה של בעלי חיים בודדים של C. elegans באופן אורכי מסתמכת בעיקר על התקנים מיקרופלואידים17.
כאן, אנו מתארים שיטה חדשנית לגידול C. elegans בודדים על מדיה מוצקה התואמת הן התערבויות מרתיעות והן הדמיה פלואורסצנטית ישירה. גישה זו דומה בקונספט שלה לטכנולוגיות הדמיה אחרות של תולעת יחידה, פרט לכך ששבב PDMS יצוק בהתאמה אישית מוחלף במיקרו-מגשי פוליסטירן הזמינים מסחרית שפותחו במקור עבור מבחני ציטוטוקסיות מיקרו (הנקראים גם מגשי טרסאקי)18. מיקרו-מגשים אלה כוללים בארות שניתן למלא במצע מוצק ולזרוע במזון חיידקי, המחקות באופן הדוק את הסביבה שחווים בעלי חיים תחת מתודולוגיית תרבית NGM מוצקה סטנדרטית. כל באר מוקפת במחסום מרתיע של חומצה פלמיטית ולא נחושת גופרתית. חומצה פלמיטית משמשת בדרך כלל למניעת בריחת תולעים ממדיה מוצקה, תוך שימוש בתרבית קבוצתית סטנדרטית על צלחות פטרי בניסויים שבהם תולעים מאותגרות עם סביבה מרתיעה כמו הגבלה תזונתית או חשיפה לגורם עקה כימי. המגשים הזעירים מייצרים גם רקע פלואורסצנטי מינימלי ועקבי, המאפשר הדמיה פלואורסצנטית של בעלי חיים ישירות בסביבת התרבית שלהם. מערכת תרבית חדשה זו המבוססת על אגר מוצק בעל חיים יחיד לא רק מאפשרת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך החיים ולנטר גדילה, התפתחות, פעילות ותוחלת חיים, אלא גם תואמת למיקרוסקופ פלואורסצנטי ישיר. מכיוון שניתן לצלם את התולעים ללא שיתוק או קיבוע, ניתן לכמת סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים in vivo בבעלי חיים בודדים שנותרו במצע התרבית שלהם, מה שמאפשר תצפית על שינויים דינמיים לאורך החיים של כל חיה. מערכת תרבות זו תואמת גם למערכות אוטומטיות מהדור הנוכחי למעקב אחר תוחלת חיים ומדדי בריאות אחרים14,19. אנו מספקים פרוטוקול מפורט לטיפוח C. elegans בודדים במערכת מבוססת מיקרו-מגש זו, דנים במלכודות פוטנציאליות ובפתרון בעיות, ודנים ביתרונות ובמגבלות ביחס למערכות אחרות, ובפרט, פרוטוקול WorMotel15 מעודכן וממוטב.
כל סביבת תרבית של תולעת יחידה מורכבת ממיקרו-מגש המורכב בתוך מגש סטנדרטי של באר אחת באמצעות מתאם מותאם אישית המודפס בתלת-ממד (איור 1A). הבארות מלאות במצע גידול נמטודות אגרוז (lmNGM) שנמס נמוך, שנזרעו בחיידקים מרוכזים כמקור מזון, ומוקפות בציפוי חומצה פלמיטית כדי למנוע מתולעים לברוח (איור 1B). החלל בין המגש הזעיר לדפנות הצלחת החד-בארית מלא בגבישי מים רוויים כדי לשמור על לחות (איור 1B). ציפוי חומר ניקוי מוחל על מכסה המגש כדי למנוע עיבוי. לכל באר מתווספת תולעת אחת, ומגש הבאר הבודדת אטום בפרפילם כדי לשמור על לחות ולאפשר חילופי חמצן. עד שישה מיקרו-מגשים יכולים להיות מוכנים באופן סביר במקביל על ידי חוקר מנוסה אחד.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

Caenorhabditis elegans נמצאים בשימוש נרחב לחקר ביולוגיה של הזדקנות. הנוהג המקובל במחקרי הזדקנות של C. elegans הוא תרבית קבוצות של תולעים על מצע גידול נמטודות מוצק (NGM), המאפשר איסוף יעיל של נתונים ברמת האוכלוסייה לצורך הישרדות ופנוטיפים פיזיולוגיים אחרים, ודגימה תקופתית של תת-אוכלוסיות לצורך כימות סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים. מגבלות לגישה זו הן חוסר היכולת (1) לעקוב אחר תולעים בודדות לאורך זמן כדי לפתח מסלולי גיל עבור פנוטיפים מעניינים ו-(2) לעקוב אחר סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים ישירות בהקשר של סביבת התרבית. גישות תרבית חלופיות משתמשות בתרבית נוזלית או מיקרופלואידיקה כדי לנטר בעלי חיים בודדים לאורך זמן, במקרים מסוימים כולל כימות פלואורסצנטי, עם הפשרה שסביבת התרבית שונה מבחינה קונטקסטואלית מגז טבעי מוצק. ה-WorMotel הוא מכשיר רב-באר מיקרו-מפוברק שתואר בעבר לגידול תולעים מבודדות על גז טבעי מוצק. כל תולעת נשמרת בבאר המכילה NGM מוצק המוקף בחפיר מלא נחושת גופרתית, דוחה מגע עבור C. elegans, המאפשר ניטור אורכי של בעלי חיים בודדים. אנו מוצאים כי נחושת גופרתית אינה מספיקה כדי למנוע מתולעים לברוח כאשר הן נחשפות להתערבויות מרתיעות הנפוצות במחקר הזדקנות, כולל הגבלה תזונתית, חיידקים פתוגניים וחומרים כימיים הגורמים לעקה תאית. המכשירים מרובי הבארות מעוצבים גם מפולידימתילסילוקסן, המייצר תוצרי רקע גבוהים בהדמיה פלואורסצנטית. פרוטוקול זה מתאר גישה חדשה לגידול תולעים עגולות מבודדות על גז טבעי טבעי מוצק באמצעות מיקרו-מגשי פוליסטירן הזמינים מסחרית, שתוכננו במקור עבור הקלדת אנטיגן לויקוציטים אנושי (HLA), המאפשרים מדידה של הישרדות, פנוטיפים פיזיולוגיים ופלואורסצנטיות לאורך תוחלת החיים. מחסום חומצה פלמיטית מונע מתולעים לברוח, אפילו בנוכחות תנאים מרתיעים. כל צלחת יכולה לגדל עד 96 בעלי חיים ומתאימה את עצמה בקלות למגוון מצבים, כולל מגבלות תזונתיות, RNAi ותוספים כימיים, והיא תואמת למערכות אוטומטיות לאיסוף נתוני תוחלת חיים ופעילות.

סביבת תרבית התולעת הבודדת המבוססת על מיקרו-מגש המתוארת כאן יכולה לשמש לניטור מגוון פנוטיפים, כולל תוחלת חיים ותוחלת בריאות, פעילות ותנועה, צורת גוף וגיאומטריית זחילה, וביטוי של סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים המתבטאים באופן טרנסגני בבעלי חיים בודדים לאורך זמן. מערכת תרבית המגש הזעיר תואמת...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית נמטודות בודדות על מדיה מוצקה למעקב אחר פרמטרים פיזיולוגיים לכל החיים וכימות פלואורסצנטי. מערכת תרבית זו כוללת מחסום חומצה פלמיטית סביב בארות תולעים בודדות כדי למנוע מבעלי חיים לברוח, ומאפשרת שימוש בהתערבויות מרתיעות, כולל חיידקים פתוגניים וגורמי עקה כימיים.

תרבות ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans בודדים על מדיה מוצקה לניטור פלואורסצנטי אורכי והתערבויות מרתיעות

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

בעוד שיטות אחרות של תרביות מוצקות קיימות, זוהי מערכת התרביות המוצקות הראשונה המאפשרת מעקב אורכי אוטומטי אחר חיי בעלי חיים בודדים ותוחלת בריאותם והדמיה אורכית של סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים במערכת אחת. פרוטוקול זה מספק תוצאות דומות לניסויים סטנדרטיים של C.elegans על גז טבעי מוצק תואם הן להתערבויות מרתיעות והן להדמיית פלואורסצנטיות חיה ישירה. מערכת זו תהיה רבת ערך לחקר ההזדקנות, במיוחד בכל הנוגע לחשיפה ארוכת טווח לגורמי עקה סביבתיים וצפייה בדינמיקה של גנים וחלבונים לאורך תקופות ממושכות.הימנעות מזיהום וייבוש עקבי על פני הבארות הן מאתגרות. הדגשנו נקודות מפתח בפרוטוקול הכתוב כדי למזער בעיות אלה. כדי להתחיל, לטחון 500 מיליגרם של חומצה פלמיטית מוצקה במכתש ו pestle.שלבו אותו עם 15 מיליליטר של TWEEN 20 בבקבוקון חרוטי של 50 מיליליטר, וערבבו על ידי מערבולות כדי להמיס את הגבישים. מוסיפים 17.5 מיליליטר של 100% אתנול, ומערבלים את התמיסה כדי להמיס כמה שיותר חומצה פלמיטית. לאחר מכן להוסיף 17.5 מיליליטר של מים טהורים במיוחד, מערבולת במרץ.מחממים בעדינות את התמיסה באמבט חרוזים ב 80 מעלות צלזיוס עד שהחומצה הפלמיטית מתמוססת לחלוטין. מחממים מחדש את אמבט החרוזים ל 80 מעלות צלזיוס. מיד לפני השימוש, aliquot מיליליטר אחד של תמיסת עבודה חומצה palmitic לכל Microtray לתוך מיכל סטרילי נפרד, ולהוסיף ארבעה מיקרוליטר של nystatin לכל מיליליטר אחד של תמיסת חומצה palmitic לפני חימום.כעת רססו בתוך ומחוץ למיקרוטרייד אתנול לרוויה, ונערו את עודפי האתנול. כדי לעקר את מגש המיקרו, הניחו את הצלחת והמכסה בנפרד בקרוסלינקר UV. לאחר 20 דקות, הופכים את הצלחת והמכסה.לאחר מכן, הניחו את בקבוקון החרוט של 15 מיליליטר עם תמיסת העבודה של חומצה פלמיטית באמבט החרוזים, ואפשרו לכל הגבישים הנראים לעין להתמוסס לחלוטין לפני השימוש. חממו את מגש המיקרו על ידי הנחתו על המדף המקיף את אמבט החרוזים עם המכסים למשך שתי דקות. הסירו את מכסה המיקרוטרייד והוסיפו באיטיות 200 מיקרוליטר של תמיסת עבודה עם חומצה פלמיטית על פני הקיר האחורי של המיקרוטריי.החליפו את המכסים והניחו למיקרוטר לשבת על אמבט החרוזים למשך שתיים עד שלוש דקות כדי לאפשר לתמיסת החומצה הפלמיטית לשקוע על פני תחתית המגש. סובבו את מגש המיקרו ב-180 מעלות, והוסיפו את תמיסת העבודה של חומצה פלמיטית כפי שהודגם קודם לכן. הכן lmNGM על ידי הוספת הרכיבים המתוארים בכתב היד.לאחר מכן פיפטה 20 מיקרוליטר של lmNGM לתוך כל Microtray מונח על הספסל. הקפד לכסות את מגש המיקרו בעת מילוי פיפטה כדי למזער זיהום. כדי לזרוע את בארות Microtray עם מזון חיידקי, צנטריפוגה תרבית גדל לילה ב 3, 500 גרם במשך 20 דקות.הסר את supernatant, ו resuspend את תרבית החיידקים בריכוז פי עשרה עם תמיסת נתרן כלורי 85 מילימולר. לאחר מכן הזרימו בזהירות חמישה מיקרוליטרים של תרבית חיידקים מרוכזת פי עשרה על פני השטח של lmNGM בכל באר. הימנעו מלאפשר לתרבות החיידקים לדרוס את צד הבאר אל תוך החומצה הפלמיטית, מכיוון שהדבר ימשוך תולעים לעזוב את הבאר.הניחו את העלון הסטרילי המודפס בתלת-ממד בתוך לוח סטרילי בעל באר אחת. הנח את מגש המיקרו במתאם המודפס בתלת-ממד בלוח בעל באר יחידה. יש לפזר בנדיבות גבישי מים על גבי התוספת המודפסת בתלת-ממד בין הבאר החיצונית של המיקרוטרייד לבין הדופן הפנימית של הצלחת בעלת הבאר היחידה.אם לא מוסיפים תולעים מיד, אטמו את מגש המיקרו לשימוש למחרת. סגור את מכסה המגש והשתמש בחתיכה אחת של Parafilm כדי לעטוף את כל ארבעת הצדדים כדי לאטום את מגש המיקרו. חזור על שלב האיטום עם Parafilm פעמיים נוספות עבור שלוש שכבות.הוסיפו תולעת אחת לכל באר ברגע שהן הגיעו לשלב החיים הרצוי. הוסיפו 40 מיקרוליטר של תמיסת חומרי ניקוי למכסה של צלחת בעלת באר אחת, והשתמשו במגבון משימה כדי לצפות את המכסה באופן שווה. השתמש במגבוני משימה נוספים כדי לפזר את תמיסת חומרי הניקוי עד שהראייה דרך המכסה אינה מעוותת.מתחו מעט את החתיכה הראשונה של Parafilm כדי לכסות שני צדדים של המגש. נגבו את החלק העליון של המגש במגבון משימה, והרטיבו אותו באתנול 70% כדי להסיר טביעות אצבע. מדדו את תוחלת החיים על ידי הקשה עדינה על הצד או החלק העליון של הצלחת, או הקרנת אור כחול בוהק על הצלחת, והתבוננות בכל חיה.ציון בעל חיים מת אם הוא לא זז בתוך כמה שניות. חזור על משימה זו כל יום עד שלושה ימים עד שכל התולעים מתו. בצע הדמיה פלואורסצנטית על בארות בודדות.חשיפה לנחושת גופרתית ודיתותריטול הפחיתה באופן משמעותי את תוחלת החיים ואת תוחלת הבריאות של התולעים. לעומת זאת, נחושת גופרתית הפחיתה את שיעור החיים בבריאות טובה, בעוד dithiothreitol לא. נחושת גופרתית הפחיתה את הפעילות הממוצעת בקרב פרטים באוכלוסייה במידה רבה יותר מאשר dithiothreitol בכל הגילאים.ממוצע האוכלוסייה של אזור בעלי החיים הבודדים מתחת לעקומת הפעילות לכל החיים נפגע באופן משמעותי על ידי נחושת גופרתית או דיתיותריטול. הפעילות המצטברת של בעלי חיים בודדים עד היום ה-10 נמצאת בקורלציה עם תוחלת החיים של בעלי חיים מאותגרים של דיתיותרייטול, אך לא עבור בעלי חיים מאותגרים של נחושת גופרתית או של נחושת גופרתית. עלייה דרסטית בביטוי KYNU-1 נצפית בין הימים השלישי לשמיני של הבגרות, ויש ירידה הדרגתית עם הגיל לאחר מכן.ביטוי מצטבר של KYNU-1 mScarlet עד היום ה-14 לבגרות נמצא בקורלציה עם תוחלת החיים של בעלי חיים. מכיוון שביטוי KYNU-1 הוא דינמי לאורך תוחלת החיים, השווינו את ביטוי KYNU-1 בגילאים שונים להישרדות הכוללת בקרב בעלי חיים בודדים. בשום נקודת זמן לא היה מתאם משמעותי בין ביטוי KYNU-1 להישרדות.כאשר מנסים הליך זה, השלבים החשובים ביותר הם תוספת של חומצה פלמיטית, pipetting אגר, והחדרת התולעים. טכניקה זו מאפשרת מעקב אורכי של תוחלת החיים ותוחלת הבריאות, כמו גם סמנים ביולוגיים פלואורסצנטיים בתולעים בודדות באופן שניתן להשוות ישירות לבדיקות NGM.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

לטווח ארוך של תרבות האדם סרטן השד דוגמאות וניתוח שלהם באמצעות טומוגרפיה הקרנה אופטית

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

רב שכבתי וההרכבה למיקרוסקופיה גיליון אור לטווח ארוך של דג הזברה

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em &gt; בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

אוטומציה של כימות מצטבר ב - Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...