Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da NIH R35GM133588 a G.L.S., una borsa di formazione NIHT32GM008659 a L.E., un National Academy of Medicine Catalyst Award degli Stati Uniti a G.L.S. e lo State of Arizona Technology and Research Initiative Fund amministrato dall'Arizona Board of Regents.

1. Ricette
NOTA: Preparare le soluzioni stock prima di iniziare la preparazione della piastra del microvassoio.
<ol><li>Soluzioni stock per terreni di crescita di nematodi agarosio a basso punto di fusione (lmNGM)<ol><li>Preparare 1 M K 2 HPO4 sciogliendo 174,18 g di K2HPO4 in 1 Ldi acqua deionizzata sterile in una bottiglia da 1 L. Autoclavare la soluzione a 121 °C, 15 psi, per 30 minuti e conservarla a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research.">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. 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Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021)</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

Qui, descriviamo un nuovo sistema di coltura che adatta i microvassoi, originariamente sviluppati per i saggi di tipizzazione del tessuto dell'antigene leucocitario umano, per consentire l'isolamento e la caratterizzazione di singoli C. elegans nel tempo in un ambiente di media solidi che è contestualmente simile all'NGM basato su agar che è lo standard nella ricerca su C. elegans. Questo sistema è compatibile con una varietà di interventi, tra cui la restrizione dietetica, il trattamento farmacol...

C. elegans è un potente organismo modello per la ricerca in genetica, biologia cellulare e biologia molecolare, perché sono facilmente coltivabili in laboratorio, hanno un breve tempo di generazione e durata della vita, condividono un alto grado di omologia proteica con i mammiferi e hanno una struttura corporea trasparente che consente la visualizzazione in vivo di proteine fluorescenti e coloranti1. Come risultato dell'uso di lunga data di C. elegans come importante sistema modello in una serie di campi, tra cui la biologia dello sviluppo e l'invecchiamento, la loro crescita e sviluppo sono ben compresi, il loro genoma è stato completamente sequenziato e sono stati creati una serie di potenti strumenti genetici, tra cui librerie di alimentazione RNAi a livello di genoma e migliaia di ceppi mutanti e transgenici. Storicamente, i C. elegans sono coltivati come popolazioni su terreni di crescita solidi di nematodi agar (NGM) e i fenotipi sono valutati manualmente mediante osservazione diretta o mediante imaging e analisi a valle. La microscopia fluorescente viene utilizzata per catturare una varietà di fenotipi molecolari utilizzando coloranti o tag fluorescenti espressi transgenicamente in singoli C. elegans. L'imaging fluorescente comporta tipicamente il fissaggio o la paralisi di un animale su vetrini contenenti sottili cuscinetti di agarosio, che è invasivo e spesso letale. Comporta anche l'uso di sostanze chimiche, come il levamisolo o l'azoturo di sodio, che possono potenzialmente interferire con il processo molecolare di interesse 2,3. Insieme, questi approcci consentono di raccogliere dati trasversali a livello di popolazione su un'ampia gamma di fenotipi, ma non consentono il monitoraggio dei singoli animali nel tempo.
Negli ultimi anni, sono emersi diversi approcci per coltivare C. elegans isolati, consentendo ai ricercatori di catturare i cambiamenti dinamici nei fenotipi fisiologici e molecolari degli animali nel tempo utilizzando nuove tecnologie di imaging. Una categoria di approccio colturale di C. elegans sono i dispositivi microfluidici, tra cui WormFarm4, il chip Nemalife5 e il chip "behavior" di Chronis et al.6, tra i vari altri 7,8,9. Correlati a questi sono metodi di coltura a base liquida, che utilizzano piastre multi-pozzetto per caratterizzare singoli vermi o piccole popolazioni nel tempo10,11. I sistemi di microfluidica e micropiastre forniscono eccellenti misurazioni quantitative delle risposte fenotipiche in C. elegans fino a un singolo animale, ma l'ambiente di coltura presenta una limitazione chiave. La stragrande maggioranza delle ricerche passate su C. elegans, in particolare nel campo dell'invecchiamento, è stata completata su terreni solidi a base di agar. La coltura liquida fa sì che C. elegans nuoti continuamente e rappresenti un contesto ambientale distinto che può alterare la biologia sottostante. Ad esempio, gli animali allevati in terreni liquidi hanno drasticamente alterato il contenuto di grassi e l'espressione genica - in particolare per i geni coinvolti nella risposta allo stress - rispetto agli animali coltivati su NGM solido12,13 a base di agar. Una categoria alternativa di metodi di imaging per singolo animale coinvolge dispositivi di polidimetilsilossano (PDMS) che isolano i singoli animali su supporti solidi, nel tentativo di imitare più da vicino l'ambiente standard sperimentato dai vermi coltivati su NGM solido in coltura di gruppo su piastre di Petri. Il WorMotel è un dispositivo PDMS a 240 pozzetti progettato per allevare singoli animali su supporti solidi. Ogni pozzetto è riempito con un NGM modificato utilizzando agarosio a basso punto di fusione al posto dell'agar e seminato con cibo batterico, creando un ambiente solido simile al sistema di coltura più comune che utilizza piastre di Petri. Le pareti del pozzo sono rotonde, consentendo a ciascun animale di essere ripreso indipendentemente dalla posizione nel pozzo (evitando l'oscuramento visivo causato da un animale vicino a un muro in una piastra multi-pozzo). Il solfato di rame in uno stretto fossato che circonda ogni pozzo è usato come deterrente per mantenere gli animali nei loro pozzi14,15. Una limitazione di questo approccio è che il solfato di rame è inefficace nel prevenire la fuga dei vermi quando sono presenti condizioni ambientali avverse, tra cui restrizioni dietetiche, batteri patogeni o sostanze chimiche che inducono stress cellulare (ad esempio, paraquat).
Un secondo sistema che utilizza mezzi solidi è il Worm Corral, che impiega un idrogel per creare un piccolo ambiente sigillato per ogni verme su un vetrino, consentendo il monitoraggio a lungo termine di animali isolati individualmente16. Una limitazione chiave è che gli animali devono essere sigillati nell'ambiente come uova, richiedendo l'uso di animali sterili per prevenire la riproduzione e limitando i trattamenti farmacologici a una singola applicazione. Le sperimentazioni multidose di farmaci possono essere eseguite nel WorMotel conducendo più cicli di esposizione prima di trasferire i vermi al dispositivo o aggiungendo localmente ulteriori farmaci ai pozzetti durante l'esperimento; Tuttavia, in quest'ultimo caso, la dose di esposizione effettiva dopo l'aggiunta di un farmaco aggiuntivo a un pozzetto esistente è difficile da quantificare con precisione e dipende dalla rapidità con cui il farmaco si degrada. Sia il WorMotel che il Worm Corral sono eccellenti per l'imaging in campo chiaro o in campo oscuro per acquisire informazioni relative all'attività e alla fisiologia animale (ad esempio, crescita e sviluppo). Mentre questi sistemi possono essere utilizzati per monitorare la fluorescenza, nella nostra esperienza, il PDMS utilizzato per creare le altre tecnologie di imaging a singolo verme è incline a formare microbolle, catturare il particolato e altre piccole anomalie che generano artefatti fluorescenti irregolari che interferiscono con la visualizzazione e la quantificazione della fluorescenza coerente, specialmente nell'intervallo di emissione per GFP, il fluoroforo più comune utilizzato nella ricerca su C. elegans. Ad oggi, l'imaging a fluorescenza vivo di singoli animali di C. elegans in modo longitudinale si basa principalmente su dispositivi microfluidici17.
Qui, descriviamo un nuovo metodo per la coltura di singoli C. elegans su supporti solidi che è compatibile sia con gli interventi avversivi che con l'imaging fluorescente diretto. Questo approccio è concettualmente simile ad altre tecnologie di imaging a singolo verme, tranne per il fatto che il chip PDMS stampato su misura viene sostituito con microvassoi in polistirene disponibili in commercio originariamente sviluppati per saggi di microcitotossicità (comunemente chiamati anche vassoi Terasaki)18. Questi microvassoi sono dotati di pozzetti che possono essere riempiti con terreni solidi e seminati con cibo batterico, imitando da vicino l'ambiente sperimentato dagli animali con la metodologia standard di coltura NGM solida. Ogni pozzetto è circondato da una barriera avversiva di acido palmitico piuttosto che di solfato di rame. L'acido palmitico è comunemente usato per impedire ai vermi di fuggire dai mezzi solidi, utilizzando la coltura di gruppo standard su piastre di Petri in esperimenti in cui i vermi sono sfidati con un ambiente avversivo come la restrizione dietetica o l'esposizione a un fattore di stress chimico. I microvassoi producono anche uno sfondo fluorescente minimo e coerente, consentendo l'imaging fluorescente degli animali direttamente nel loro ambiente di coltura. Questo nuovo sistema di coltura a base di agar solido per singolo animale non solo consente di tracciare i singoli animali per tutta la vita e monitorare la crescita, lo sviluppo, l'attività e la durata della vita, ma è anche compatibile con la microscopia fluorescente diretta. Poiché i vermi possono essere fotografati senza paralisi o fissazione, i biomarcatori di fluorescenza in vivo possono essere quantificati longitudinalmente nei singoli animali che rimangono sui loro terreni di coltura, consentendo l'osservazione dei cambiamenti dinamici nel corso della vita di ciascun animale. Questo sistema di coltura è anche compatibile con i sistemi automatizzati di attuale generazione per il monitoraggio della durata della vita e altre metriche sanitarie14,19. Forniamo un protocollo dettagliato per la coltura di singoli C. elegans in questo sistema basato su microvassoi, discutiamo potenziali insidie e risoluzione dei problemi e discutiamo i vantaggi e le limitazioni relativi ad altri sistemi e, in particolare, un protocollo WorMotel aggiornato e ottimizzato15.
Ogni ambiente di coltura a singolo verme è costituito da un microvassoio montato all'interno di un vassoio standard a pozzetto singolo utilizzando un adattatore personalizzato stampato in 3D (Figura 1A). I pozzetti sono riempiti con terreni di crescita di nematodi agarosio a basso punto di fusione (lmNGM), seminati con batteri concentrati come fonte di cibo e circondati da un rivestimento di acido palmitico per impedire ai vermi di fuggire (Figura 1B). Lo spazio tra il microvassoio e le pareti della piastra a pozzetto singolo è riempito con cristalli di acqua satura per mantenere l'umidità (Figura 1B). Un rivestimento detergente viene applicato al coperchio del vassoio per evitare la formazione di condensa. Un singolo verme viene aggiunto a ciascun pozzetto e il vassoio a pozzetto singolo viene sigillato con Parafilm per mantenere l'umidità e consentire lo scambio di ossigeno. Fino a sei microvassoi possono ragionevolmente essere preparati in parallelo da un singolo ricercatore praticato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

Caenorhabditis elegans sono ampiamente utilizzati per studiare la biologia dell'invecchiamento. La pratica standard negli studi sull'invecchiamento di C. elegans è quella di coltivare gruppi di vermi su terreni di crescita di nematodi solidi (NGM), consentendo la raccolta efficiente di dati a livello di popolazione per la sopravvivenza e altri fenotipi fisiologici e il campionamento periodico delle sottopopolazioni per la quantificazione dei biomarcatori fluorescenti. I limiti di questo approccio sono l'incapacità di (1) seguire i singoli vermi nel tempo per sviluppare traiettorie di età per fenotipi di interesse e (2) monitorare biomarcatori fluorescenti direttamente nel contesto dell'ambiente di coltura. Gli approcci di coltura alternativi utilizzano la coltura liquida o la microfluidica per monitorare i singoli animali nel tempo, in alcuni casi inclusa la quantificazione della fluorescenza, con il compromesso che l'ambiente di coltura è contestualmente distinto dal NGM solido. Il WorMotel è un dispositivo multi-pozzo microfabbricato precedentemente descritto per la coltura di vermi isolati su NGM solido. Ogni verme è mantenuto in un pozzo contenente NGM solido circondato da un fossato riempito di solfato di rame, un repellente da contatto per C. elegans, che consente il monitoraggio longitudinale dei singoli animali. Troviamo che il solfato di rame non è sufficiente per impedire ai vermi di fuggire quando sottoposti a interventi avversivi comuni nella ricerca sull'invecchiamento, tra cui restrizioni dietetiche, batteri patogeni e agenti chimici che inducono stress cellulare. I dispositivi multi-pozzetto sono anche stampati da polidimetilsilossano, che produce artefatti di fondo elevati nell'imaging a fluorescenza. Questo protocollo descrive un nuovo approccio per la coltura di nematodi isolati su NGM solido utilizzando microvassoi di polistirene disponibili in commercio, originariamente progettati per la tipizzazione dell'antigene leucocitario umano (HLA), consentendo la misurazione della sopravvivenza, dei fenotipi fisiologici e della fluorescenza per tutta la durata della vita. Una barriera di acido palmitico impedisce ai vermi di fuggire, anche in presenza di condizioni avverse. Ogni piastra può coltivare fino a 96 animali e si adatta facilmente a una varietà di condizioni, tra cui restrizioni dietetiche, RNAi e additivi chimici, ed è compatibile con i sistemi automatizzati per la raccolta di dati sulla durata della vita e sull'attività.

L'ambiente di coltura a singolo verme basato su microvassoi qui descritto può essere utilizzato per monitorare una varietà di fenotipi, tra cui durata della vita e durata della salute, attività e movimento, forma del corpo e geometria strisciante e l'espressione di biomarcatori fluorescenti espressi transgenicamente nei singoli animali nel tempo. Il sistema di coltura microtray è compatibile con l'analisi della durata di vita attraverso il punteggio manuale o la raccolta di immagini e l'analisi di imaging a valle. Co...

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Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Qui, presentiamo un protocollo per la coltura di singoli nematodi isolati su terreni solidi per il monitoraggio dei parametri fisiologici permanenti e la quantificazione della fluorescenza. Questo sistema di coltura include una barriera di acido palmitico attorno ai pozzi a singolo verme per impedire agli animali di fuggire, consentendo l'uso di interventi avversivi, inclusi batteri patogeni e fattori di stress chimici.

Coltura a lungo termine di singoli Caenorhabditis elegans su terreni solidi per il monitoraggio longitudinale della fluorescenza e interventi avversivi

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Sebbene esistano altri metodi di coltura solida, questo è il primo sistema di coltura solida che consente il monitoraggio longitudinale automatizzato della durata della vita e della salute dei singoli animali e l'imaging longitudinale di biomarcatori fluorescenti in un unico sistema. Questo protocollo fornisce risultati comparabili agli esperimenti standard di C.elegans su NGM solido è compatibile sia con interventi avversivi che con imaging a fluorescenza diretta dal vivo. Questo sistema sarà prezioso per la ricerca sull'invecchiamento, in particolare per quanto riguarda l'esposizione a lungo termine a fattori di stress ambientali e l'osservazione delle dinamiche geniche e proteiche per periodi prolungati.Evitare la contaminazione e ottenere un'essiccazione costante attraverso i pozzi sono entrambi impegnativi. Abbiamo evidenziato i punti chiave del protocollo scritto per ridurre al minimo questi problemi. Per iniziare, macinare 500 milligrammi di acido palmitico solido in un mortaio e pestello.Combinarlo con 15 millilitri di TWEEN 20 in una fiala conica da 50 millilitri e mescolare a vortice per sciogliere i cristalli. Aggiungere 17,5 millilitri di etanolo al 100% e vortice la soluzione per sciogliere quanto più acido palmitico possibile. Quindi aggiungere 17,5 millilitri di acqua ultrapura e vortice vigorosamente.Riscaldare delicatamente la soluzione in un bagno di perline a 80 gradi Celsius fino a quando l'acido palmitico si dissolve completamente. Riscaldare il bagno di perline a 80 gradi Celsius. Immediatamente prima dell'uso, aliquotare un millilitro della soluzione di lavoro di acido palmitico per Microtray in un contenitore sterile separato e aggiungere quattro microlitri di nistatina per un millilitro di soluzione di acido palmitico prima del riscaldamento.Ora spruzzare all'interno e all'esterno del Microtray con etanolo fino alla saturazione e scrollarsi di dosso l'etanolo in eccesso. Per sterilizzare il Microtray, posizionare la piastra e il coperchio separatamente nel reticolante UV. Dopo 20 minuti, capovolgere il piatto e il coperchio.Quindi, posizionare la fiala conica da 15 millilitri con la soluzione di lavoro di acido palmitico nel bagno di perline e lasciare che eventuali cristalli visibili si dissolvano completamente prima dell'uso. Riscaldare il Microtray posizionandolo sulla sporgenza che circonda il bagno di perline con i coperchi per due minuti. Rimuovere il coperchio Microtray e aggiungere lentamente 200 microlitri di soluzione di lavoro di acido palmitico sulla parete posteriore del Microtray.Riposizionare i coperchi e lasciare riposare il Microtray sul bagno di perline per due o tre minuti per consentire alla soluzione di acido palmitico di depositarsi sul fondo del Microtray. Ruotare il Microtray di 180 gradi e aggiungere la soluzione di lavoro di acido palmitico come dimostrato in precedenza. Preparare lmNGM aggiungendo i componenti descritti nel manoscritto.Quindi pipettare 20 microlitri di lmNGM in ogni Microtray posizionato sul banco. Assicurarsi di coprire il Microtray quando si ricarica la pipetta per ridurre al minimo la contaminazione. Per seminare i pozzetti Microtray con cibo batterico, centrifugare una coltura coltivata durante la notte a 3.500 G per 20 minuti.Rimuovere il surnatante e risospendere la coltura batterica a una concentrazione di dieci volte con una soluzione di cloruro di sodio a 85 millimolari. Quindi pipetare con cura cinque microlitri di coltura batterica concentrata di dieci volte sulla superficie del lmNGM in ciascun pozzetto. Evitare che la coltura batterica scorra sul lato del pozzo e nell'acido palmitico, poiché ciò attirerà i vermi a lasciare il pozzo.Posizionare l'inserto sterile stampato in 3D in una piastra sterile a pozzetto singolo. Posizionare il Microtray nell'adattatore stampato in 3D nella piastra a pozzetto singolo. Erogare liberamente cristalli d'acqua sulla parte superiore dell'inserto stampato in 3D tra il pozzetto esterno del Microtray e la parete interna della piastra a pozzetto singolo.Se i worm non vengono aggiunti immediatamente, sigillare il Microtray per utilizzarlo il giorno successivo. Chiudere il coperchio del vassoio e utilizzare un singolo pezzo di Parafilm per avvolgere tutti e quattro i lati per sigillare il Microtray. Ripetere la fase di sigillatura con Parafilm altre due volte per tre strati.Aggiungi un verme per pozzetto una volta raggiunta la fase di vita desiderata. Aggiungere 40 microlitri di soluzione detergente al coperchio di una piastra a pozzetto singolo e utilizzare una salvietta per rivestire uniformemente il coperchio. Utilizzare salviette aggiuntive per distribuire la soluzione detergente fino a quando la visione attraverso il coperchio non viene distorta.Allungare leggermente il primo pezzo di Parafilm per coprire due lati del vassoio. Pulire la parte superiore del vassoio con una salvietta da attività e inumidirla con etanolo al 70% per rimuovere eventuali impronte digitali. Misura la durata della vita toccando delicatamente il lato o la parte superiore del piatto, o facendo brillare una luce blu brillante sul piatto e osservando ogni animale.Segna un animale morto se non si muove entro pochi secondi. Ripeti questo compito ogni uno o tre giorni fino a quando tutti i vermi sono morti. Eseguire immagini fluorescenti su singoli pozzetti.L'esposizione al solfato di rame e al ditiotreitolo ha ridotto significativamente la durata della vita e la salute del verme. Al contrario, il solfato di rame ha diminuito la percentuale di vita trascorsa in buona salute, mentre il ditiotreitolo no. Il solfato di rame ha ridotto l'attività media tra gli individui all'interno della popolazione in misura maggiore rispetto al ditiotreitolo a tutte le età.La media della popolazione della singola area animale sotto la curva dell'attività nel corso della vita è sostanzialmente compromessa dal solfato di rame o dal ditiotreitolo. L'attività cumulativa per i singoli animali fino al giorno 10 è correlata alla loro durata di vita per gli animali sottoposti a ditiotreitolo, ma non per i controlli non trattati o gli animali con solfato di rame. Un drastico aumento dell'espressione di KYNU-1 è osservato tra il terzo e l'ottavo giorno dell'età adulta, e c'è un progressivo declino con l'età successiva.L'espressione cumulativa di KYNU-1 mScarlet fino al giorno 14 dell'età adulta è correlata alla durata della vita animale. Poiché l'espressione di KYNU-1 è dinamica per tutta la durata della vita, abbiamo confrontato l'espressione di KYNU-1 in età diverse con la sopravvivenza globale tra i singoli animali. In nessun singolo punto temporale l'espressione di KYNU-1 è stata significativamente correlata alla sopravvivenza.Quando si tenta questa procedura, i passaggi più importanti sono l'aggiunta dell'acido palmitico, il pipettaggio dell'agar e l'introduzione dei vermi. Questa tecnica consente il monitoraggio longitudinale della durata della vita e della durata della salute, nonché biomarcatori fluorescenti nei singoli vermi in un modo che è direttamente paragonabile ai saggi NGM.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

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