Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH R35GM133588 til GLS, et NIHT32GM008659 treningsstipend til LE, en United States National Academy of Medicine Catalyst Award til GLS, og State of Arizona Technology and Research Initiative Fund administrert av Arizona Board of Regents.

1. Oppskrifter
NOTAT: Forbered lagerløsninger før du starter klargjøring av mikrobrettplater.
<ol><li>Stamløsninger for vekstmedier med agarosenematode med lav smeltekraft (lmNGM)<ol><li>Forbered 1 MK2 HPO4 ved å oppløse 174,18 g K2HPO4 i 1 liter sterilt avionisert vann i en 1 l flaske. Autoklav oppløsningen ved 121 °C, 15 psi, i 30 minutter og oppbevar den ved romtemperatur (RT).</li>
		<li>Forbered 1 M KP i (pH 6,0) ved å oppløse ...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research.">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021)</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

Her beskriver vi et nytt kultursystem som tilpasser mikroskuffer, opprinnelig utviklet for humane leukocyttantigenvevstypingsanalyser, for å tillate isolering og karakterisering av enkelt C. elegans over tid i et solid mediemiljø som er kontekstuelt lik den agarbaserte NGM som er standarden i C. elegans forskning. Dette systemet er kompatibelt med en rekke inngrep, inkludert diettbegrensning, eksogen medikamentell behandling, en utfordring med kjemiske eller miljømessige stressorer og RNAi. Det till...

C. elegans er en kraftig modellorganisme for forskning innen genetikk, cellulær biologi og molekylærbiologi, fordi de lett dyrkes i laboratoriet, har kort generasjonstid og levetid, deler en høy grad av proteinhomologi med pattedyr og har en gjennomsiktig kroppsstruktur som tillater in vivo visualisering av fluorescerende proteiner og fargestoffer1. Som et resultat av den langvarige bruken av C. elegans som et viktig modellsystem på en rekke felt, inkludert utviklingsbiologi og aldring, er deres vekst og utvikling godt forstått, deres genom har blitt fullstendig sekvensert, og en rekke kraftige genetiske verktøy er opprettet, inkludert genombrede RNAi-fôringsbiblioteker og tusenvis av mutante og transgene stammer. Historisk dyrkes C. elegans som populasjoner på faste agarnematodevekstmedier (NGM), og fenotyper evalueres manuelt enten ved direkte observasjon eller ved avbildning og nedstrømsanalyse. Fluorescerende mikroskopi brukes til å fange en rekke molekylære fenotyper ved hjelp av fargestoffer eller transgent uttrykte fluorescerende koder i individuelle C. elegans. Fluorescerende avbildning innebærer vanligvis å fikse eller lamme et dyr på lysbilder som inneholder tynne agaroseputer, noe som er invasivt og ofte dødelig. Det innebærer også bruk av kjemikalier, som levamisol eller natriumazid, som potensielt kan forstyrre den molekylære prosessen av interesse 2,3. Sammen gjør disse tilnærmingene det mulig å samle inn data på tverrsnittsnivå på populasjonsnivå over et bredt spekter av fenotyper, men tillater ikke sporing av individuelle dyr over tid.
I de senere år har flere tilnærminger dukket opp for å dyrke isolerte C. elegans, slik at forskere kan fange dynamiske endringer i fysiologiske og molekylære fenotyper av dyr over tid ved hjelp av nye bildebehandlingsteknologier. En kategori av C. elegans kultur tilnærming er microfluidics enheter, inkludert WormFarm4, Nemalife chip5, og "atferd" chip av Chronis et al.6, blant annet 7,8,9. Relatert til disse er væskebaserte kulturmetoder, som bruker flerbrønnsplater for å karakterisere individuelle ormer eller små populasjoner over tid10,11. Mikrofluidikk og mikroplatesystemer gir gode kvantitative målinger av fenotypiske responser i C. elegans ned til et enkelt dyr, men kulturmiljøet presenterer en viktig begrensning. Det store flertallet av tidligere forskning i C. elegans, spesielt innen aldring, har blitt fullført på solide agarbaserte medier. Flytende kultur får C. elegans til å svømme kontinuerlig og representerer en distinkt miljøkontekst som kan endre den underliggende biologien. For eksempel har dyr dyrket i flytende medier drastisk endret fettinnhold og genuttrykk - spesielt for gener involvert i stressresponsen - i forhold til dyr dyrket på agarbasert fast NGM12,13. En alternativ kategori av enkeltdyravbildningsmetoder involverer polydimetylsiloksan (PDMS) enheter som isolerer individuelle dyr på faste medier, i et forsøk på å etterligne standardmiljøet som oppleves av ormer dyrket på fast NGM i gruppekultur på petrisklater. WorMotel er en 240-brønns PDMS-enhet designet for å dyrke individuelle dyr på faste medier. Hver brønn er fylt med en modifisert NGM ved bruk av lavsmelteagarose i stedet for agar og frøet med bakteriell mat, noe som skaper et solid mediemiljø som ligner på det vanligste kultursystemet ved bruk av petrisklater. Brønnveggene er runde, slik at hvert dyr kan avbildes uavhengig av plassering i brønnen (unngå visuell tilsløring forårsaket av et dyr nær en vegg i en flerbrønnsplate). Kobbersulfat i en smal vollgrav som omgir hver brønn brukes som avskrekkende for å holde dyr i brønnenesine 14,15. En begrensning av denne tilnærmingen er at kobbersulfatet er ineffektivt for å hindre ormer i å flykte når aversive miljøforhold er tilstede, inkludert diettbegrensning, patogene bakterier eller kjemikalier som induserer cellulær stress (f.eks. Paraquat).
Et annet system som bruker faste medier er Worm Corral, som benytter en hydrogel for å skape et lite forseglet miljø for hver orm på et lysbilde, noe som muliggjør langsiktig overvåking av individuelt isolerte dyr16. En viktig begrensning er at dyr må forsegles i miljøet som egg, noe som krever bruk av sterile dyr for å forhindre reproduksjon, og begrenser medikamentell behandling til en enkelt applikasjon. Multi-dose narkotika forsøk kan oppnås i WorMotel enten ved å gjennomføre flere runder med eksponering før overføring av ormer til enheten eller ved lokalt å legge til flere legemidler til brønnene under forsøket; I sistnevnte tilfelle er imidlertid den faktiske eksponeringsdosen etter tilsetning av et ekstra legemiddel til en eksisterende brønn vanskelig å nøyaktig kvantifisere og avhenger av hvor raskt stoffet nedbrytes. Både WorMotel og Worm Corral er utmerket for brightfield eller darkfield imaging for å fange opp informasjon relatert til aktivitet og dyrefysiologi (f.eks. Vekst og utvikling). Selv om disse systemene kan brukes til å overvåke fluorescens, er PDMS som brukes til å lage de andre enkeltormbildeteknologiene, etter vår erfaring tilbøyelige til å danne mikrobobler, fange partikler og andre små abnormiteter som genererer uregelmessige fluorescerende artefakter som forstyrrer konsistent fluorescensvisualisering og kvantifisering, spesielt i utslippsområdet for GFP, den vanligste fluoroforen som brukes i C. elegans-forskning. Til dags dato er levende fluorescensavbildning av C. elegans individuelle dyr på en langsgående måte primært avhengig av mikrofluidiske enheter17.
Her beskriver vi en ny metode for dyrking av individuelle C. elegans på faste medier som er kompatibel med både aversive inngrep og direkte fluorescerende avbildning. Denne tilnærmingen ligner i konsept til andre enkeltormbildeteknologier, bortsett fra at den spesialstøpte PDMS-brikken erstattes med kommersielt tilgjengelige polystyrenmikrobrett opprinnelig utviklet for mikrocytotoksisitetsanalyser (også ofte kalt Terasaki-brett)18. Disse mikrobrettene har brønner som kan fylles med faste medier og frøes med bakteriefôr, noe som etterligner miljøet som oppleves av dyr under standard solid NGM-kulturmetodikk. Hver brønn er omgitt av en aversiv barriere av palmitinsyre i stedet for kobbersulfat. Palmitinsyre brukes ofte til å forhindre ormer fra å flykte fra faste medier, ved hjelp av standard gruppekultur på petrisklater i eksperimenter der ormer utfordres med et aversivt miljø som diettbegrensning eller eksponering for en kjemisk stressor. Mikrobrettene produserer også minimal og konsistent fluorescerende bakgrunn, noe som tillater fluorescerende avbildning av dyr direkte i deres kulturmiljø. Dette nye solide agarbaserte kultursystemet med ett dyr gjør det ikke bare mulig å spore individuelle dyr gjennom livet og overvåke vekst, utvikling, aktivitet og levetid, men er også kompatibelt med direkte fluorescerende mikroskopi. Fordi ormene kan avbildes uten lammelse eller fiksering, kan in vivo fluorescensbiomarkører kvantifiseres i lengderetningen hos individuelle dyr som forblir på deres kulturmedier, slik at man kan observere dynamiske endringer i løpet av hvert dyrs levetid. Dette kultursystemet er også kompatibelt med nåværende generasjons automatiserte systemer for sporing av levetid og andre helsemålinger14,19. Vi gir en detaljert protokoll for dyrking av individuelle C. elegans i dette mikroskuffbaserte systemet, diskuterer potensielle fallgruver og feilsøking, og diskuterer fordeler og begrensninger i forhold til andre systemer, og spesielt en oppdatert og optimalisert WorMotel-protokoll15.
Hvert kulturmiljø med én orm består av et mikrobrett montert inne i et standard enkeltbrønnsbrett ved hjelp av en tilpasset 3D-printet adapter (figur 1A). Brønnene er fylt med lavsmelte agarose nematode vekstmedier (lmNGM), sådd med konsentrerte bakterier som matkilde, og omgitt av et palmitinsyrebelegg for å hindre ormer i å flykte (figur 1B). Rommet mellom mikrobrettet og veggene på enkeltbrønnsplaten er fylt med mettede vannkrystaller for å opprettholde fuktighet (figur 1B). Et vaskemiddelbelegg påføres brettlokket for å forhindre kondens. En enkelt orm legges til hver brønn, og enkeltbrønnsbrettet er forseglet med Parafilm for å opprettholde fuktighet og tillate oksygenutveksling. Opptil seks mikrobrett kan med rimelighet tilberedes parallelt av en enkelt praktisert forsker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

Caenorhabditis elegans er mye brukt til å studere aldringsbiologi. Standard praksis i C. elegans aldringsstudier er å dyrke grupper av ormer på faste nematodevekstmedier (NGM), noe som muliggjør effektiv innsamling av populasjonsnivådata for overlevelse og andre fysiologiske fenotyper, og periodisk prøvetaking av subpopulasjoner for fluorescerende biomarkørkvantifisering. Begrensninger for denne tilnærmingen er manglende evne til å (1) følge individuelle ormer over tid for å utvikle aldersbaner for fenotyper av interesse og (2) overvåke fluorescerende biomarkører direkte i sammenheng med kulturmiljøet. Alternative kulturtilnærminger bruker flytende kultur eller mikrofluidikk for å overvåke individuelle dyr over tid, i noen tilfeller inkludert fluorescenskvantifisering, med avveiningen at kulturmiljøet er kontekstuelt forskjellig fra fast NGM. WorMotel er en tidligere beskrevet mikrofabrikert flerbrønnsenhet for dyrking av isolerte ormer på fast NGM. Hver orm opprettholdes i en brønn som inneholder fast NGM omgitt av en vollgrav fylt med kobbersulfat, et kontaktmiddel for C. elegans, som tillater langsgående overvåking av individuelle dyr. Vi finner kobbersulfat utilstrekkelig til å forhindre ormer i å flykte når de blir utsatt for aversive inngrep som er vanlige i aldringsforskning, inkludert diettbegrensning, patogene bakterier og kjemiske midler som induserer cellulær stress. Multibrønnsenhetene er også støpt fra polydimetylsiloksan, som produserer høye bakgrunnsartefakter i fluorescensavbildning. Denne protokollen beskriver en ny tilnærming for dyrking av isolerte rundorm på fast NGM ved bruk av kommersielt tilgjengelige polystyrenmikrobrett, opprinnelig designet for human leukocyttantigen (HLA) typing, som tillater måling av overlevelse, fysiologiske fenotyper og fluorescens over hele levetiden. En palmitinsyrebarriere forhindrer ormer i å flykte, selv i nærvær av aversive forhold. Hver tallerken kan dyrke opptil 96 dyr og tilpasser seg enkelt til en rekke forhold, inkludert diettbegrensning, RNAi og kjemiske tilsetningsstoffer, og er kompatibel med automatiserte systemer for innsamling av levetid og aktivitetsdata.

Det mikrobrettbaserte enkeltormkulturmiljøet som er beskrevet her, kan brukes til å overvåke en rekke fenotyper, inkludert levetid og helsespenn, aktivitet og bevegelse, kroppsform og krypende geometri, og uttrykket av transgent uttrykte fluorescerende biomarkører hos individuelle dyr over tid. Mikrobrettkultursystemet er kompatibelt med levetidsanalyse gjennom enten manuell scoring eller bildeinnsamling og nedstrøms bildeanalyse. Som med standardkultur på petrisklate21, kan ormer manuelt sk...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Her presenterer vi en protokoll til dyrkningsisolerte individuelle nematoder på faste medier for livslang fysiologisk parametersporing og fluorescenskvantifisering. Dette kultursystemet inkluderer en palmitinsyrebarriere rundt enkeltormbrønner for å forhindre at dyr flykter, noe som tillater bruk av aversive inngrep, inkludert patogene bakterier og kjemiske stressorer.

Langsiktig kultur av individuelle Caenorhabditis elegans på faste medier for langsgående fluorescensovervåking og aversive intervensjoner

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Mens andre faste kulturmetoder eksisterer, er dette det første solide kultursystemet som tillater automatisert langsgående sporing av individuelle dyrs liv og helsespenn og langsgående avbildning av fluorescerende biomarkører i ett system. Denne protokollen gir sammenlignbare resultater til standard C.elegans eksperimenter på solid NGM er kompatibel med både aversive inngrep og direkte levende fluorescensavbildning. Dette systemet vil være uvurderlig for aldringsforskning, spesielt når det gjelder langsiktig eksponering for miljøstressorer og observasjon av gen- og proteindynamikk over lengre perioder.Å unngå forurensning og få jevn tørking på tvers av brønnene er begge utfordrende. Vi fremhevet viktige punkter i den skriftlige protokollen for å minimere disse problemene. For å begynne, slip 500 milligram fast palmitinsyre i en mørtel og pestle.Kombiner den med 15 ml TWEEN 20 i et 50 milliliter konisk hetteglass, og bland ved vortexing for å oppløse krystallene. Tilsett 17,5 ml 100% etanol, og virvel løsningen for å oppløse så mye palmitinsyre som mulig. Deretter tilsettes 17,5 ml ultrarent vann, og hvirvel kraftig.Oppvarm forsiktig løsningen i et perlebad ved 80 grader Celsius til palmitinsyren oppløses helt. Varm opp perlebadet til 80 grader Celsius. Umiddelbart før bruk, aliquot en milliliter av palmitinsyre arbeidsløsningen per mikrobrett i en separat steril beholder, og tilsett fire mikroliter nystatin per en milliliter palmitinsyreoppløsning før oppvarming.Spray nå innsiden og utsiden av mikrobrettet med etanol til metning, og rist av overflødig etanol. For å sterilisere mikrobrettet, plasser platen og lokket separat i UV-tverrbinderen. Etter 20 minutter, snu platen og lokket.Deretter plasserer du det 15 milliliter koniske hetteglasset med palmitinsyrearbeidsløsningen i perlebadet, og la eventuelle synlige krystaller oppløses helt før bruk. Varm opp mikrobrettet ved å plassere det på kanten rundt perlebadet med lokkene på i to minutter. Fjern mikroskufflokket, og tilsett sakte 200 mikroliter palmitinsyrearbeidsløsning over bakveggen på mikrobrettet.Sett på lokkene igjen, og la mikrobrettet sitte på perlebadet i to til tre minutter for å la palmitinsyreoppløsningen legge seg over bunnen av mikrobrettet. Drei mikrobrettet 180 grader, og tilsett palmitinsyrearbeidsløsningen som vist tidligere. Forbered lmNGM ved å legge til komponentene beskrevet i manuskriptet.Deretter pipetter 20 mikroliter lmNGM inn i hvert mikrobrett plassert på benken. Sørg for å dekke til mikrobrettet når du fyller på pipetten for å minimere forurensning. For å frø mikrobrettbrønnene med bakteriell mat, sentrifuge en kultur dyrket over natten ved 3.500 g i 20 minutter.Fjern supernatanten, og resuspender bakteriekulturen i en ti ganger konsentrasjon med 85 millimolar natriumkloridoppløsning. Deretter piper du forsiktig fem mikroliter tifold konsentrert bakteriekultur på overflaten av lmNGM i hver brønn. Unngå å la bakteriekulturen løpe over siden av brønnen og inn i palmitinsyren, da dette vil tiltrekke ormer til å forlate brønnen.Plasser den sterile 3D-printede innsatsen i en steril enkeltbrønnsplate. Plasser mikroskuffen i den 3D-printede adapteren i enkeltbrønnsplaten. Dispenser vannkrystaller liberalt på toppen av den 3D-printede innsatsen mellom mikrobrettets ytre brønn og den indre veggen på enkeltbrønnplaten.Hvis ormer ikke legges til umiddelbart, må du forsegle mikrobrettet for bruk neste dag. Lukk brettlokket, og bruk et enkelt stykke Parafilm til å vikle alle fire sidene for å forsegle mikrobrettet. Gjenta forseglingstrinnet med Parafilm to ganger til i tre lag.Legg til en orm per brønn når de har nådd ønsket livsstadium. Tilsett 40 mikroliter vaskemiddelløsning på lokket på en enkeltbrønnsplate, og bruk en arbeidsserviett for å belegge lokket jevnt. Bruk ekstra arbeidsservietter for å spre vaskemiddelløsningen til synet gjennom lokket ikke er forvrengt.Strekk den første delen av Parafilm litt for å dekke to sider av brettet. Tørk av toppen av skuffen med en arbeidsserviett, og fukt den med 70 % etanol for å fjerne eventuelle fingeravtrykk. Mål levetiden ved å forsiktig banke på siden eller toppen av platen, eller skinne et sterkt blått lys på platen, og observere hvert dyr.Score et dyr dødt hvis det ikke beveger seg i løpet av få sekunder. Gjenta denne oppgaven hver og en til tre dager til alle ormer er døde. Utfør fluorescerende avbildning på enkeltbrønner.Eksponering for kobbersulfat og dithiothreitol reduserte ormens levetid og helsespenn betydelig. I motsetning til dette reduserte kobbersulfat andelen av livet brukt i god helse, mens dithiothreitol ikke gjorde det. Kobbersulfat reduserte gjennomsnittlig aktivitet på tvers av individer i befolkningen i større grad enn dithiothreitol i alle aldre.Populasjonsgjennomsnittet for det enkelte dyreareal under livstidsaktivitetskurven er vesentlig svekket av kobbersulfat eller dithiothreitol. Kumulativ aktivitet for individuelle dyr opp til dag 10 korrelerer med deres levetid for dyr med dithiothreitolutfordring, men ikke for ubehandlede kontroller eller dyr som utfordrer kobbersulfat. En drastisk økning i KYNU-1-uttrykk observeres mellom dag tre og åtte i voksen alder, og det er en progressiv nedgang med alderen etter det.Kumulativt KYNU-1 mScarlet uttrykk gjennom dag 14 i voksen alder korrelerer med dyrets levetid. Siden KYNU-1-uttrykk er dynamisk gjennom hele levetiden, sammenlignet vi KYNU-1-uttrykk i ulike aldre med total overlevelse på tvers av individuelle dyr. Ikke på et enkelt tidspunkt var KYNU-1-uttrykk signifikant korrelert med overlevelse.Når du prøver denne prosedyren, er de viktigste trinnene tilsetning av palmitinsyre, pipettering av agar og innføring av ormer. Denne teknikken tillater langsgående sporing av levetid og helsespenn, samt fluorescerende biomarkører i individuelle ormer på en måte som er direkte sammenlignbar med NGM-analyser.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsiktig Dødelig toksisitet Test med krepsdyret Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Multilayer Montering for Long-term Lett Sheet Mikroskopi av Sebrafisk

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Dyrking<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; I Axenic Flytende Media og Opprettelse av Transgene Worms av mikropartikkel bombardementet

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolasjon, transfection, og langsiktig kultur av voksen mus og rotte kardiomyocytter

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Etikettfri bildebehandling av Lipidlagringsdynamikk i Caenorhabditis elegans ved hjelp av stimulert Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisere aggregert kvantifisering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...