Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Эта работа была поддержана NIH R35GM133588 для G.L.S., грантом на обучение NIHT32GM008659 для Лос-Анджелеса, премией Национальной академии медицины США за катализатор для G.L.S. и Фондом технологической и исследовательской инициативы штата Аризона, управляемым Советом регентов штата Аризона.

1. Рецепты
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте исходные растворы перед началом подготовки пластин для микролотков.
<ol><li>Исходные растворы для низкоплавких сред для роста агарозных нематод (lmNGM)<ol><li>Приготовьте 1 М К 2 ГПО4, растворив 174,18 г К2ХПО4 в1 л стерильн?...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research.">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021)</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

Здесь мы описываем новую культуральную систему, которая адаптирует микролотки, первоначально разработанные для анализов типирования тканей на лейкоцитарный антиген человека, чтобы обеспечить изоляцию и характеристику отдельных C. elegans с течением времени в среде твердой среды, котора?...

C. elegans являются мощным модельным организмом для исследований в области генетики, клеточной биологии и молекулярной биологии, поскольку они легко культивируются в лаборатории, имеют короткое время генерации и продолжительность жизни, имеют высокую степень гомологии белка с млекопитающими и имеют прозрачную структуру тела, которая позволяет in vivo визуализировать флуоресцентные белки и красители1. В результате многолетнего использования C. elegans в качестве основной модельной системы в ряде областей, включая биологию развития и старение, их рост и развитие хорошо изучены, их геном был полностью секвенирован, и было создано множество мощных генетических инструментов, включая полногеномные библиотеки питания РНК-интерференции и тысячи мутантных и трансгенных штаммов. Исторически сложилось так, что C. elegans культивируются как популяции на твердых агаровых нематодных питательных средах (NGM), а фенотипы оцениваются вручную либо путем прямого наблюдения, либо путем визуализации и последующего анализа. Флуоресцентная микроскопия используется для захвата различных молекулярных фенотипов с использованием красителей или трансгенно экспрессируемых флуоресцентных меток у отдельных C. elegans. Флуоресцентная визуализация обычно включает в себя фиксацию или парализацию животного на предметных стеклах, содержащих тонкие агарозные подушечки, что является инвазивным и часто смертельным. Он также включает использование химических веществ, таких как левамизол или азид натрия, которые потенциально могут вмешиваться в молекулярный процесс, представляющий интерес 2,3. Вместе эти подходы позволяют собирать перекрестные данные на уровне популяции по широкому спектру фенотипов, но не позволяют отслеживать отдельных животных с течением времени.
В последние годы появилось несколько подходов к культивированию изолированных C. elegans, что позволяет исследователям фиксировать динамические изменения физиологических и молекулярных фенотипов животных с течением времени с использованием новых технологий визуализации. Одной из категорий подхода к культуре C. elegans являются микрофлюидные устройства, в том числе WormFarm4, чип Nemalife5 и чип «поведения» Chronis et al.6, а также различные другие 7,8,9. С ними связаны методы культивирования на основе жидкости, в которых используются многолуночные планшеты для характеристики отдельных червей или небольших популяций с течением времени10,11. Микрофлюидика и микропланшетные системы обеспечивают отличные количественные измерения фенотипических реакций у C. elegans вплоть до одного животного, но культуральная среда представляет собой ключевое ограничение. Подавляющее большинство прошлых исследований C. elegans, особенно в области старения, было завершено на твердых средах на основе агара. Жидкая культура заставляет C. elegans непрерывно плавать и представляет собой особый экологический контекст, который может изменить лежащую в основе биологию. Например, у животных, культивируемых в жидких средах, резко изменилось содержание жира и экспрессия генов, особенно генов, участвующих в реакции на стресс, по сравнению с животными, культивируемыми на твердом веществе NGM12,13 на основе агара. Альтернативная категория методов визуализации на одном животном включает устройства из полидиметилсилоксана (PDMS), которые изолируют отдельных животных на твердых средах, чтобы более точно имитировать стандартную среду, в которой находятся черви, культивируемые на твердых NGM в групповой культуре на пластинах Петри. WorMotel - это 240-луночное устройство PDMS, предназначенное для культивирования отдельных животных на твердых средах. Каждая лунка заполняется модифицированным NGM с использованием низкоплавкой агарозы вместо агара и засевается бактериальной пищей, создавая твердую среднюю среду, аналогичную наиболее распространенной системе культивирования с использованием пластин Петри. Стенки колодца круглые, что позволяет визуализировать каждое животное независимо от его местоположения в колодце (избегая визуального затемнения, вызванного животным возле стены в многолуночной пластине). Медный купорос в узком рву, окружающем каждый колодец, используется в качестве отпугивающего фактора для содержания животных в их колодцах14,15. Ограничением этого подхода является то, что сульфат меди неэффективен для предотвращения бегства червей при наличии неблагоприятных условий окружающей среды, включая диетические ограничения, патогенные бактерии или химические вещества, вызывающие клеточный стресс (например, паракват).
Второй системой, в которой используются твердые среды, является загон для червей, в котором используется гидрогель для создания небольшой герметичной среды для каждого червя на предметном стекле, что позволяет осуществлять долгосрочный мониторинг индивидуально изолированных животных16. Ключевым ограничением является то, что животные должны быть запечатаны в окружающую среду в виде яиц, что требует использования стерильных животных для предотвращения размножения и ограничивает лекарственное лечение одним применением. Испытания многодозовых лекарств могут быть выполнены в WorMotel либо путем проведения нескольких раундов воздействия перед переносом червей в устройство, либо путем местного добавления дополнительных лекарств в лунки во время эксперимента; Однако в последнем случае фактическая доза воздействия после добавления дополнительного лекарственного средства в существующую лунку трудно поддается точному количественному определению и зависит от того, насколько быстро лекарство разлагается. И WorMotel, и Worm Corral отлично подходят для визуализации светлого или темного поля для сбора информации, связанной с активностью и физиологией животных (например, ростом и развитием). Хотя эти системы могут быть использованы для мониторинга флуоресценции, по нашему опыту, PDMS, используемая для создания других технологий визуализации с одним червем, склонна к образованию микропузырьков, улавливанию твердых частиц и другим небольшим аномалиям, которые генерируют нерегулярные флуоресцентные артефакты, которые мешают последовательной визуализации флуоресценции и количественной оценке, особенно в диапазоне излучения для GFP, наиболее распространенного флуорофора, используемого в исследованиях C. elegans. На сегодняшний день живая флуоресцентная визуализация отдельных животных C. elegans в продольном направлении в основном опирается на микрофлюидные устройства17.
Здесь мы описываем новый метод культивирования отдельных C. elegans на твердых средах, который совместим как с аверсивными вмешательствами, так и с прямой флуоресцентной визуализацией. Этот подход аналогичен по концепции другим технологиям визуализации с одним червем, за исключением того, что изготовленный по индивидуальному заказу чип PDMS заменяется коммерчески доступными полистирольными микролотками, первоначально разработанными для анализов микроцитотоксичности (также обычно называемыми лотками Терасаки)18. Эти микролотки имеют лунки, которые могут быть заполнены твердой средой и засеяны бактериальной пищей, точно имитирующей среду, в которой находятся животные в соответствии со стандартной методологией культивирования твердых NGM. Каждая скважина окружена аверсивным барьером из пальмитиновой кислоты, а не медного купороса. Пальмитиновая кислота обычно используется для предотвращения выхода червей из твердых сред, используя стандартную групповую культуру на пластинах Петри в экспериментах, где черви подвергаются воздействию неприятной среды, такой как диетические ограничения или воздействие химического стрессора. Микролотки также создают минимальный и стабильный флуоресцентный фон, что позволяет получать флуоресцентные изображения животных непосредственно в их культурной среде. Эта новая система культивирования на основе твердого агара для одного животного не только позволяет отслеживать отдельных животных на протяжении всей жизни и контролировать рост, развитие, активность и продолжительность жизни, но также совместима с прямой флуоресцентной микроскопией. Поскольку черви могут быть визуализированы без паралича или фиксации, биомаркеры флуоресценции in vivo могут быть количественно количественно определены в продольном направлении у отдельных животных, оставшихся на их питательных средах, что позволяет наблюдать динамические изменения в течение жизни каждого животного. Эта система культивирования также совместима с автоматизированными системами текущего поколения для отслеживания продолжительности жизни и других показателей здоровья14,19. Мы предоставляем подробный протокол культивирования отдельных C. elegans в этой системе на основе микролотков, обсуждаем потенциальные подводные камни и устранение неполадок, а также обсуждаем преимущества и ограничения по сравнению с другими системами и, в частности, обновленный и оптимизированный протокол WorMotel15.
Каждая среда для культивирования одного червя состоит из микролотка, установленного внутри стандартного однолуночного лотка с помощью специального адаптера, напечатанного на 3D-принтере (рис. 1A). Лунки заполнены питательной средой из низкоплавкой агарозной нематоды (lmNGM), засеяны концентрированными бактериями в качестве источника пищи и окружены оболочкой из пальмитиновой кислоты для предотвращения бегства червей (рис. 1B). Пространство между микролотком и стенками однолунковой пластины заполняется насыщенными кристаллами воды для поддержания влажности (рис. 1Б). На крышку лотка наносится моющее покрытие для предотвращения образования конденсата. В каждую лунку добавляется по одному червяку, а однолуночный лоток герметизируется Parafilm для поддержания влажности и обеспечения кислородного обмена. До шести микролотков могут быть подготовлены параллельно одним практикующим исследователем.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

Caenorhabditis elegans широко используются для изучения биологии старения. Стандартной практикой в исследованиях старения C. elegans является культивирование групп червей на твердых средах для роста нематод (NGM), что позволяет эффективно собирать данные на уровне популяции для выживания и других физиологических фенотипов, а также периодический отбор проб субпопуляций для количественной оценки флуоресцентных биомаркеров. Ограничениями этого подхода являются неспособность (1) следить за отдельными червями с течением времени для развития возрастных траекторий для интересующих фенотипов и (2) контролировать флуоресцентные биомаркеры непосредственно в контексте культуральной среды. Альтернативные подходы к культивированию используют жидкую культуру или микрофлюидики для мониторинга отдельных животных с течением времени, в некоторых случаях включая количественную оценку флуоресценции, с компромиссом, заключающимся в том, что культурная среда контекстуально отличается от твердого NGM. WorMotel представляет собой ранее описанное микрофабрикованное многолуночное устройство для культивирования изолированных червей на твердых NGM. Каждый червь содержится в колодце, содержащем твердый NGM, окруженный рвом, заполненным сульфатом меди, контактным репеллентом для C. elegans, позволяющим проводить продольный мониторинг отдельных животных. Мы считаем, что сульфата меди недостаточно, чтобы предотвратить бегство червей при воздействии аверсивных вмешательств, распространенных в исследованиях старения, включая ограничения в питании, патогенные бактерии и химические агенты, вызывающие клеточный стресс. Многолуночные устройства также отлиты из полидиметилсилоксана, который создает артефакты с высоким фоном при флуоресцентной визуализации. Этот протокол описывает новый подход к культивированию изолированных круглых червей на твердых NGM с использованием коммерчески доступных полистирольных микролотков, первоначально разработанных для типирования лейкоцитарного антигена человека (HLA), что позволяет измерять выживаемость, физиологические фенотипы и флуоресценцию на протяжении всей жизни. Барьер пальмитиновой кислоты предотвращает бегство червей даже при наличии аверсивных состояний. Каждая пластина может культивировать до 96 животных и легко адаптируется к различным условиям, включая диетические ограничения, РНКи и химические добавки, и совместима с автоматизированными системами сбора данных о продолжительности жизни и активности.

Описанная здесь среда культивирования одного червя на основе микролотка может быть использована для мониторинга различных фенотипов, включая продолжительность жизни и продолжительность здоровья, активность и движение, форму тела и геометрию ползания, а также экспрессию трансгенно э...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Здесь мы представляем протокол культивирования изолированных отдельных нематод на твердых средах для отслеживания физиологических параметров на протяжении всей жизни и количественной оценки флуоресценции. Эта система культивирования включает в себя барьер пальмитиновой кислоты вокруг лунок с одним червяком, чтобы предотвратить бегство животных, что позволяет использовать аверсивные вмешательства, включая патогенные бактерии и химические стрессоры.

Долгосрочное культивирование отдельных Caenorhabditis elegans на твердых средах для продольного флуоресцентного мониторинга и аверсивных вмешательств

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

В то время как существуют другие методы твердого культивирования, это первая система твердого культивирования, которая позволяет автоматизировать продольное отслеживание жизни и здоровья отдельных животных и продольную визуализацию флуоресцентных биомаркеров в одной системе. Этот протокол обеспечивает результаты, сопоставимые со стандартными экспериментами C.elegans на твердом NGM, совместим как с аверсивными вмешательствами, так и с прямой флуоресцентной визуализацией в реальном времени. Эта система будет иметь неоценимое значение для исследований старения, особенно в отношении долгосрочного воздействия стрессоров окружающей среды и наблюдения за динамикой генов и белков в течение длительных периодов времени.Избежать загрязнения и обеспечить постоянное высыхание скважин - сложная задача. Мы выделили ключевые моменты в письменном протоколе, чтобы свести к минимуму эти проблемы. Для начала измельчите 500 миллиграмм твердой пальмитиновой кислоты в ступке и пестиком.Смешайте его с 15 миллилитрами TWEEN 20 в коническом флаконе объемом 50 миллилитров и смешайте вихревым способом, чтобы растворить кристаллы. Добавьте 17,5 миллилитров 100% этанола и встряхните раствор, чтобы растворить как можно больше пальмитиновой кислоты. Затем добавьте 17,5 миллилитров сверхчистой воды и энергично встряхните.Осторожно нагрейте раствор в ванне для шариков при температуре 80 градусов Цельсия до полного растворения пальмитиновой кислоты. Разогрейте ванну с шариками до 80 градусов Цельсия. Непосредственно перед использованием аликвотируйте один миллилитр рабочего раствора пальмитиновой кислоты на микролоток в отдельный стерильный контейнер и добавьте четыре микролитра нистатина на один миллилитр раствора пальмитиновой кислоты перед нагреванием.Теперь распылите внутри и снаружи микролотка этанол до насыщения и стряхните излишки этанола. Чтобы стерилизовать микролоток, поместите пластину и крышку отдельно в УФ-сшивающий агент. Через 20 минут переверните тарелку и крышку.Затем поместите 15-миллилитровый конический флакон с рабочим раствором пальмитиновой кислоты в ванну для шариков и дайте всем видимым кристаллам полностью раствориться перед использованием. Разогрейте микролоток, поместив его на выступ, окружающий ванну с шариками, с закрытыми крышками на две минуты. Снимите крышку микролотка и медленно добавьте 200 микролитров рабочего раствора пальмитиновой кислоты через заднюю стенку микролотка.Закройте крышки и оставьте микролоток на ванну с шариками на две-три минуты, чтобы раствор пальмитиновой кислоты осяд на дно микролотка. Поверните микролоток на 180 градусов и добавьте рабочий раствор пальмитиновой кислоты, как показано ранее. Подготовьте lmNGM, добавив компоненты, описанные в рукописи.Затем пипеткой налейте 20 микролитров lmNGM в каждый микролоток, размещенный на столе. Обязательно накрывайте микролоток при заправке пипетки, чтобы свести к минимуму загрязнение. Чтобы засеять лунки Микролотка бактериальным кормом, центрифугируйте культуру, выращенную в течение ночи при температуре 3 500 г в течение 20 минут.Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте культуру бактерий в десятикратной концентрации 85-миллимолярным раствором хлорида натрия. Затем осторожно нанесите пять микролитров десятикратно концентрированной бактериальной культуры на поверхность lmNGM в каждой лунке. Не допускайте, чтобы культура бактерий стекала через стенку колодца и попадала в пальмитиновую кислоту, так как это привлечет червей, покидающих колодец.Поместите стерильный вкладыш, напечатанный на 3D-принтере, в стерильную однолуночную пластину. Поместите микролоток в адаптер, напечатанный на 3D-принтере, на однолуночной пластине. Обильно распределите кристаллы воды поверх 3D-печатной вставки между внешним отверстием микролотка и внутренней стенкой однолуночной пластины.Если черви не добавляются сразу, запечатайте микролоток, чтобы использовать его на следующий день. Закройте крышку лотка и используйте один кусок парапленки, чтобы обернуть все четыре стороны, чтобы запечатать микролоток. Повторите этап запечатывания с помощью Parafilm еще два раза для трех слоев.Добавьте по одному червю в лунку, как только они достигнут желаемой стадии жизни. Добавьте 40 микролитров раствора моющего средства в крышку однолунной пластины и используйте рабочую салфетку, чтобы равномерно покрыть крышку. Используйте дополнительные салфетки, чтобы распределить раствор моющего средства до тех пор, пока зрение через крышку не исказится.Слегка растяните первый кусок парапленки, чтобы покрыть две стороны лотка. Протрите верхнюю часть лотка рабочей салфеткой и смочите ее 70% этанолом, чтобы удалить отпечатки пальцев. Измерьте продолжительность жизни, осторожно постукивая по боковой или верхней части тарелки или светя ярко-синим светом на тарелку и наблюдая за каждым животным.Забейте животное мертвым, если оно не двигается в течение нескольких секунд. Повторяйте эту задачу каждые один-три дня, пока все черви не погибнут. Выполняйте флуоресцентную визуализацию на отдельных лунках.Воздействие сульфата меди и дитиотреитола значительно сокращало продолжительность жизни и здоровье червей. Напротив, сульфат меди уменьшал долю жизни, проведенной в добром здравии, в то время как дитиотреитол этого не делал. Сульфат меди снижал среднюю активность у людей в популяции в большей степени, чем дитиотреитол во всех возрастах.Средняя популяция отдельного животного под кривой пожизненной активности существенно ухудшается сульфатом меди или дитиотреитолом. Кумулятивная активность для отдельных животных до 10-го дня коррелирует с их продолжительностью жизни для животных, подвергавшихся дитиотреитолу, но не для необработанных контрольных животных или животных, подвергшихся воздействию сульфата меди. Резкое увеличение экспрессии KYNU-1 наблюдается между третьим и восьмым днями взрослой жизни, и после этого наблюдается прогрессирующее снижение с возрастом.Кумулятивная экспрессия KYNU-1 mScarlet на 14-й день взрослой жизни коррелирует с продолжительностью жизни животных. Поскольку экспрессия KYNU-1 динамична на протяжении всей жизни, мы сравнили экспрессию KYNU-1 в разном возрасте с общей выживаемостью отдельных животных. Ни в один момент времени экспрессия KYNU-1 не коррелировала с выживаемостью.При попытке этой процедуры наиболее важными шагами являются добавление пальмитиновой кислоты, пипетка агара и введение червей. Этот метод позволяет продольно отслеживать продолжительность жизни и продолжительность здоровья, а также флуоресцентные биомаркеры у отдельных червей таким образом, который напрямую сопоставим с анализами NGM.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Измерительный Caenorhabditis Элеганс Продолжительность жизни на твердых средах

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Твердые пластины основе Диетические ограничения в Caenorhabditis Элеганс</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Долгосрочные культуры рака молочной железы человека образцов и их анализ с помощью оптической томографии Проекция

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Долгосрочные Смертельное испытания токсичности с ракообразных Артемия franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Многослойные Монтаж для долгосрочного Light Sheet микроскопии данио рерио

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Культивирование<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em &gt; В аксенными жидких сред и создания трансгенных червей бомбардировки микрочастицами

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Изоляция, трансфекция и долгосрочная культура взрослых мышей и крысиных кардиомиоцитов

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Безметчная визуализация динамики накопления липидов у caenorhabditis elegans с использованием стимулированной рамановской рассеянной микроскопии

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Автоматизация количественной оценки агрегатов в Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...