Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por NIH R35GM133588 a G.L.S., una subvención de capacitación NIHT32GM008659 a L.E., un Premio Catalizador de la Academia Nacional de Medicina de los Estados Unidos a GLS y el Fondo de Iniciativa de Tecnología e Investigación del Estado de Arizona administrado por la Junta de Regentes de Arizona.

1. Recetas
NOTA: Prepare soluciones madre antes de comenzar la preparación de la placa de microbandeja.
<ol><li>Soluciones madre para medios de crecimiento de nematodos de agarosa de bajo punto de fusión (lmNGM)<ol><li>Preparar 1 M K 2 HPO4 disolviendo 174,18 g de K2HPO4 en 1 Lde agua desionizada estéril en una botella de 1 L. Autoclave la solución a 121 °C, 15 psi, durante 30 min y almacénela a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Pre...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. 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M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research.">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. 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Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021)</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

Aquí, describimos un nuevo sistema de cultivo que adapta microbandejas, originalmente desarrollado para ensayos de tipificación de tejido de antígeno leucocitario humano, para permitir el aislamiento y caracterización de C. elegans individuales a lo largo del tiempo en un entorno de medios sólidos que es contextualmente similar al NGM basado en agar que es el estándar en la investigación de C. elegans. Este sistema es compatible con una variedad de intervenciones, incluida la restricción dieté...

Los C. elegans son un poderoso organismo modelo para la investigación en genética, biología celular y biología molecular, porque se cultivan fácilmente en el laboratorio, tienen un tiempo de generación y vida útil cortos, comparten un alto grado de homología de proteínas con los mamíferos y tienen una estructura corporal transparente que permite la visualización in vivo de proteínas fluorescentes y colorantes1. Como resultado del uso de larga data de C. elegans como un sistema modelo importante en una variedad de campos, incluida la biología del desarrollo y el envejecimiento, su crecimiento y desarrollo son bien conocidos, su genoma ha sido completamente secuenciado y se han creado una gran cantidad de poderosas herramientas genéticas, incluidas bibliotecas de alimentación de ARNi de todo el genoma y miles de cepas mutantes y transgénicas. Históricamente, C. elegans se cultiva como poblaciones en medios de crecimiento de nematodos de agar sólido (NGM), y los fenotipos se evalúan manualmente mediante observación directa o mediante imágenes y análisis aguas abajo. La microscopía fluorescente se utiliza para capturar una variedad de fenotipos moleculares utilizando colorantes o etiquetas fluorescentes expresadas transgénicamente en C. elegans individuales. Las imágenes fluorescentes generalmente implican arreglar o paralizar a un animal en portaobjetos que contienen almohadillas delgadas de agarosa, lo cual es invasivo y a menudo letal. También implica el uso de productos químicos, como levamisol o azida de sodio, que potencialmente pueden interferir con el proceso molecular de interés 2,3. Juntos, estos enfoques permiten recopilar datos transversales a nivel de población en una amplia gama de fenotipos, pero no permiten el seguimiento de animales individuales a lo largo del tiempo.
En los últimos años, han surgido varios enfoques para cultivar C. elegans aislados, lo que permite a los investigadores capturar cambios dinámicos en fenotipos fisiológicos y moleculares de animales a lo largo del tiempo utilizando nuevas tecnologías de imagen. Una categoría del enfoque de cultivo de C. elegans son los dispositivos microfluídicos, incluyendo WormFarm4, el chip Nemalife5 y el chip de "comportamiento" de Chronis et al.6, entre varios otros 7,8,9. Relacionados con estos están los métodos de cultivo a base de líquidos, que utilizan placas de múltiples pocillos para caracterizar gusanos individuales o pequeñas poblaciones a lo largo del tiempo10,11. Los sistemas de microfluídica y microplacas proporcionan excelentes mediciones cuantitativas de las respuestas fenotípicas en C. elegans hasta un solo animal, pero el entorno de cultivo presenta una limitación clave. La gran mayoría de las investigaciones anteriores en C. elegans, particularmente en el campo del envejecimiento, se han completado en medios sólidos basados en agar. El cultivo líquido hace que C. elegans nade continuamente y representa un contexto ambiental distinto que puede alterar la biología subyacente. Por ejemplo, los animales cultivados en medios líquidos han alterado drásticamente el contenido de grasa y la expresión génica, particularmente para los genes involucrados en la respuesta al estrés, en relación con los animales cultivados en NGM sólido a base de agar12,13. Una categoría alternativa de métodos de imagen de un solo animal involucra dispositivos de polidimetilsiloxano (PDMS) que aíslan animales individuales en medios sólidos, en un esfuerzo por imitar más de cerca el entorno estándar experimentado por los gusanos cultivados en NGM sólido en cultivo grupal en placas de Petri. El WorMotel es un dispositivo PDMS de 240 pocillos diseñado para cultivar animales individuales en medios sólidos. Cada pocillo se llena con un NGM modificado utilizando agarosa de bajo punto de fusión en lugar de agar y se siembra con alimentos bacterianos, creando un entorno de medios sólidos similar al sistema de cultivo más común que utiliza placas de Petri. Las paredes del pozo son redondas, lo que permite obtener imágenes de cada animal independientemente de la ubicación en el pozo (evitando el oscurecimiento visual causado por un animal cerca de una pared en una placa de varios pocillos). El sulfato de cobre en un foso estrecho que rodea cada pozo se utiliza como elemento disuasorio para mantener a los animales en sus pozos14,15. Una limitación de este enfoque es que el sulfato de cobre es ineficaz para evitar que los gusanos huyan cuando existen condiciones ambientales aversivas, incluida la restricción dietética, las bacterias patógenas o los productos químicos que inducen estrés celular (por ejemplo, paraquat).
Un segundo sistema que utiliza medios sólidos es el Worm Corral, que emplea un hidrogel para crear un pequeño ambiente sellado para cada gusano en un portaobjetos, lo que permite el monitoreo a largo plazo de animales aislados individualmente16. Una limitación clave es que los animales deben ser sellados en el medio ambiente como huevos, lo que requiere el uso de animales estériles para evitar la reproducción y limitar los tratamientos farmacológicos a una sola aplicación. Los ensayos de medicamentos de dosis múltiples se pueden lograr en el WorMotel ya sea realizando múltiples rondas de exposición antes de transferir gusanos al dispositivo o agregando tópicamente medicamentos adicionales a los pozos durante el experimento; Sin embargo, en este último caso, la dosis de exposición real después de agregar un medicamento adicional a un pozo existente es difícil de cuantificar con precisión y depende de la rapidez con que se degrada el medicamento. Tanto el WorMotel como el Worm Corral son excelentes para obtener imágenes de campo claro u oscuro para capturar información relacionada con la actividad y la fisiología animal (por ejemplo, crecimiento y desarrollo). Si bien estos sistemas se pueden usar para monitorear la fluorescencia, en nuestra experiencia, el PDMS utilizado para crear las otras tecnologías de imágenes de un solo gusano es propenso a formar microburbujas, capturar partículas y otras pequeñas anomalías que generan artefactos fluorescentes irregulares que interfieren con la visualización y cuantificación de fluorescencia consistente, especialmente en el rango de emisión de GFP, el fluoróforo más común utilizado en la investigación de C. elegans. Hasta la fecha, las imágenes de fluorescencia en vivo de animales individuales de C. elegans de manera longitudinal se basan principalmente en dispositivos microfluídicos17.
Aquí, describimos un método novedoso para cultivar C. elegans individuales en medios sólidos que es compatible tanto con intervenciones aversivas como con imágenes fluorescentes directas. Este enfoque es similar en concepto a otras tecnologías de imágenes de un solo gusano, excepto que el chip PDMS moldeado a medida se reemplaza con microbandejas de poliestireno disponibles comercialmente desarrolladas originalmente para ensayos de microcitotoxicidad (también comúnmente llamadas bandejas Terasaki)18. Estas microbandejas cuentan con pozos que pueden llenarse con medios sólidos y sembrarse con alimentos bacterianos, imitando de cerca el entorno experimentado por los animales bajo la metodología estándar de cultivo NGM sólido. Cada pocillo está rodeado por una barrera aversiva de ácido palmítico en lugar de sulfato de cobre. El ácido palmítico se usa comúnmente para evitar que los gusanos huyan de los medios sólidos, utilizando el cultivo grupal estándar en placas de Petri en experimentos donde los gusanos son desafiados con un ambiente aversivo como la restricción dietética o la exposición a un factor estresante químico. Las microbandejas también producen un fondo fluorescente mínimo y consistente, lo que permite obtener imágenes fluorescentes de animales directamente en su entorno de cultivo. Este nuevo sistema de cultivo basado en agar sólido de un solo animal no solo permite rastrear animales individuales a lo largo de la vida y monitorear el crecimiento, el desarrollo, la actividad y la vida útil, sino que también es compatible con la microscopía fluorescente directa. Debido a que los gusanos se pueden visualizar sin parálisis ni fijación, los biomarcadores de fluorescencia in vivo se pueden cuantificar longitudinalmente en animales individuales que permanecen en sus medios de cultivo, lo que permite la observación de cambios dinámicos a lo largo de la vida de cada animal. Este sistema de cultivo también es compatible con los sistemas automatizados de la generación actual para el seguimiento de la vida útil y otras métricas de salud14,19. Proporcionamos un protocolo detallado para cultivar C. elegans individuales en este sistema basado en microbandejas, discutimos posibles dificultades y solución de problemas, y discutimos las ventajas y limitaciones en relación con otros sistemas, y en particular, un protocolo WorMotel actualizado y optimizado15.
Cada entorno de cultivo de un solo gusano consiste en una microbandeja montada dentro de una bandeja estándar de un solo pozo utilizando un adaptador personalizado impreso en 3D (Figura 1A). Los pozos están llenos de medios de crecimiento de nematodos de agarosa de bajo punto de fusión (lmNGM), sembrados con bacterias concentradas como fuente de alimento, y rodeados por una capa de ácido palmítico para evitar que los gusanos huyan (Figura 1B). El espacio entre la microbandeja y las paredes de la placa de un solo pozo se llena con cristales de agua saturada para mantener la humedad (Figura 1B). Se aplica un recubrimiento detergente a la tapa de la bandeja para evitar la condensación. Se agrega un solo gusano a cada pocillo, y la bandeja de un solo pozo se sella con Parafilm para mantener la humedad y permitir el intercambio de oxígeno. Hasta seis microbandejas pueden ser razonablemente preparadas en paralelo por un solo investigador experimentado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

Caenorhabditis elegans son ampliamente utilizados para estudiar la biología del envejecimiento. La práctica estándar en los estudios de envejecimiento de C. elegans es cultivar grupos de gusanos en medios sólidos de crecimiento de nematodos (NGM), lo que permite la recopilación eficiente de datos a nivel poblacional para la supervivencia y otros fenotipos fisiológicos, y el muestreo periódico de subpoblaciones para la cuantificación de biomarcadores fluorescentes. Las limitaciones de este enfoque son la incapacidad de (1) seguir gusanos individuales a lo largo del tiempo para desarrollar trayectorias de edad para fenotipos de interés y (2) monitorear biomarcadores fluorescentes directamente en el contexto del entorno de cultivo. Los enfoques de cultivo alternativos utilizan cultivo líquido o microfluídica para monitorear animales individuales a lo largo del tiempo, en algunos casos incluida la cuantificación de fluorescencia, con la desventaja de que el entorno de cultivo es contextualmente distinto del NGM sólido. El WorMotel es un dispositivo microfabricado de múltiples pozos previamente descrito para cultivar gusanos aislados en NGM sólido. Cada gusano se mantiene en un pozo que contiene NGM sólido rodeado por un foso lleno de sulfato de cobre, un repelente de contacto para C. elegans, lo que permite el monitoreo longitudinal de animales individuales. Encontramos que el sulfato de cobre es insuficiente para evitar que los gusanos huyan cuando se someten a intervenciones aversivas comunes en la investigación del envejecimiento, incluida la restricción dietética, las bacterias patógenas y los agentes químicos que inducen estrés celular. Los dispositivos de múltiples pocillos también se moldean a partir de polidimetilsiloxano, que produce artefactos de alto fondo en imágenes de fluorescencia. Este protocolo describe un nuevo enfoque para cultivar gusanos redondos aislados en NGM sólido utilizando microbandejas de poliestireno disponibles comercialmente, originalmente diseñadas para la tipificación de antígenos leucocitarios humanos (HLA), que permiten la medición de la supervivencia, los fenotipos fisiológicos y la fluorescencia a lo largo de la vida. Una barrera de ácido palmítico evita que los gusanos huyan, incluso en presencia de condiciones aversivas. Cada placa puede cultivar hasta 96 animales y se adapta fácilmente a una variedad de condiciones, incluyendo restricciones dietéticas, ARNi y aditivos químicos, y es compatible con sistemas automatizados para recopilar datos de vida útil y actividad.

El entorno de cultivo de gusanos individuales basado en microbandejas descrito aquí se puede usar para monitorear una variedad de fenotipos, incluida la vida útil y la duración de la salud, la actividad y el movimiento, la forma del cuerpo y la geometría de rastreo, y la expresión de biomarcadores fluorescentes expresados transgénicamente en animales individuales a lo largo del tiempo. El sistema de cultivo de microbandejas es compatible con el análisis de vida útil a través de la puntuación manual o la recopil...

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Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Aquí, presentamos un protocolo para cultivar nematodos individuales aislados en medios sólidos para el seguimiento de parámetros fisiológicos de por vida y la cuantificación de fluorescencia. Este sistema de cultivo incluye una barrera de ácido palmítico alrededor de pozos de un solo gusano para evitar que los animales huyan, lo que permite el uso de intervenciones aversivas, incluidas bacterias patógenas y estresores químicos.

Cultivo a largo plazo de Caenorhabditis elegans individuales en medios sólidos para la monitorización longitudinal de fluorescencia e intervenciones aversivas

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Si bien existen otros métodos de cultivo sólido, este es el primer sistema de cultivo sólido que permite el seguimiento longitudinal automatizado de la vida y la salud de los animales individuales y la obtención de imágenes longitudinales de biomarcadores fluorescentes en un solo sistema. Este protocolo proporciona resultados comparables a los experimentos estándar de C.elegans en NGM sólido es compatible tanto con intervenciones aversivas como con imágenes directas de fluorescencia en vivo. Este sistema será invaluable para la investigación del envejecimiento, especialmente con respecto a la exposición a largo plazo a factores estresantes ambientales y la observación de la dinámica de genes y proteínas durante períodos prolongados.Evitar la contaminación y obtener un secado constante en los pozos es un desafío. Destacamos los puntos clave en el protocolo escrito para minimizar estos problemas. Para comenzar, muele 500 miligramos de ácido palmítico sólido en un mortero.Combínalo con 15 mililitros de TWEEN 20 en un vial cónico de 50 mililitros, y mezcla por vórtice para disolver los cristales. Agregue 17.5 mililitros de etanol al 100% y vortex la solución para disolver la mayor cantidad de ácido palmítico posible. Luego agregue 17.5 mililitros de agua ultrapura y vórtice vigorosamente.Caliente suavemente la solución en un baño de perlas a 80 grados centígrados hasta que el ácido palmítico se disuelva por completo. Vuelva a calentar el baño de cuentas a 80 grados centígrados. Inmediatamente antes de usar, alícuota un mililitro de la solución de trabajo de ácido palmítico por Microbandeja en un recipiente estéril separado, y agregue cuatro microlitros de nistatina por un mililitro de solución de ácido palmítico antes de calentar.Ahora rocíe dentro y fuera de la microbandeja con etanol hasta la saturación, y sacuda el exceso de etanol. Para esterilizar la microbandeja, coloque la placa y la tapa por separado en el reticulante UV. Después de 20 minutos, voltee el plato y la tapa.A continuación, coloque el vial cónico de 15 mililitros con la solución de trabajo de ácido palmítico en el baño de perlas y permita que los cristales visibles se disuelvan completamente antes de su uso. Calienta la microbandeja colocándola en la repisa que rodea el baño de cuentas con las tapas puestas durante dos minutos. Retire la tapa de la microbandeja y agregue lentamente 200 microlitros de solución de trabajo de ácido palmítico a través de la pared posterior de la microbandeja.Reemplace las tapas y deje que la microbandeja repose en el baño de perlas durante dos o tres minutos para permitir que la solución de ácido palmítico se asiente en la parte inferior de la microbandeja. Gire la microbandeja 180 grados y agregue la solución de trabajo de ácido palmítico como se demostró anteriormente. Prepare lmNGM agregando los componentes descritos en el manuscrito.A continuación, pipetear 20 microlitros de lmNGM en cada microbandeja colocada en el banco. Asegúrese de cubrir la microbandeja cuando rellene la pipeta para minimizar la contaminación. Para sembrar los pocillos de Microbandeja con alimentos bacterianos, centrifugar un cultivo cultivado durante la noche a 3, 500 G durante 20 minutos.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el cultivo de bacterias a una concentración diez veces mayor con una solución de cloruro de sodio de 85 milimolares. Luego, pipetea cuidadosamente cinco microlitros de cultivo bacteriano concentrado diez veces mayor en la superficie del lmNGM en cada pocillo. Evite permitir que el cultivo de bacterias corra sobre el costado del pozo y hacia el ácido palmítico, ya que esto atraerá a los gusanos a abandonar el pozo.Coloque el inserto estéril impreso en 3D en una placa estéril de un solo pozo. Coloque la microbandeja en el adaptador impreso en 3D en la placa de un solo pozo. Dispense generosamente cristales de agua en la parte superior del inserto impreso en 3D entre el pozo exterior de la microbandeja y la pared interior de la placa de un solo pozo.Si los gusanos no se agregan inmediatamente, selle la microbandeja para usarla al día siguiente. Cierre la tapa de la bandeja y use una sola pieza de Parafilm para envolver los cuatro lados para sellar la microbandeja. Repita el paso de sellado con Parafilm dos veces más para tres capas.Agregue un gusano por pozo una vez que hayan alcanzado la etapa de vida deseada. Agregue 40 microlitros de solución detergente a la tapa de un plato de un solo pocillo y use una toallita de tareas para cubrir la tapa de manera uniforme. Use toallitas de trabajo adicionales para extender la solución detergente hasta que la visión a través de la tapa no se distorsione.Estire ligeramente la primera pieza de Parafilm para cubrir dos lados de la bandeja. Limpie la parte superior de la bandeja con una toallita de tareas y humedezca con etanol al 70% para eliminar las huellas dactilares. Mida la vida útil golpeando suavemente el costado o la parte superior del plato, o haciendo brillar una luz azul brillante en el plato y observando a cada animal.Marca un animal muerto si no se mueve en unos pocos segundos. Repita esta tarea cada uno a tres días hasta que todos los gusanos hayan muerto. Realizar imágenes fluorescentes en pocillos individuales.La exposición al sulfato de cobre y al ditiothreitol redujo significativamente la vida útil y la salud de los gusanos. En contraste, el sulfato de cobre disminuyó la proporción de vida pasada en buena salud, mientras que el ditiothreitol no lo hizo. El sulfato de cobre redujo la actividad promedio entre los individuos dentro de la población en mayor medida que el ditiothreitol en todas las edades.El promedio poblacional del área animal individual bajo la curva de actividad de por vida se ve sustancialmente afectada por el sulfato de cobre o el ditiothreitol. La actividad acumulada para animales individuales hasta el día 10 se correlaciona con su vida útil para los animales desafiados con ditiothreitol, pero no para los controles no tratados o los animales desafiados con sulfato de cobre. Se observa un aumento drástico en la expresión de KYNU-1 entre los días tres y ocho de la edad adulta, y hay una disminución progresiva con la edad después de eso.La expresión acumulativa de KYNU-1 mScarlet hasta el día 14 de la edad adulta se correlaciona con la vida útil de los animales. Dado que la expresión de KYNU-1 es dinámica a lo largo de la vida, comparamos la expresión de KYNU-1 a diferentes edades con la supervivencia general en animales individuales. En ningún momento la expresión de KYNU-1 se correlacionó significativamente con la supervivencia.Al intentar este procedimiento, los pasos más importantes son la adición del ácido palmítico, el pipeteo del agar y la introducción de los gusanos. Esta técnica permite el seguimiento longitudinal de la vida útil y la duración de la salud, así como biomarcadores fluorescentes en gusanos individuales de una manera que es directamente comparable a los ensayos NGM.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Medición Caenorhabditis elegans Duración de la vida en el medio sólido

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Investigación

Biología

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

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Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

A largo plazo la cultura de muestras humanas del cáncer de pecho y su análisis mediante tomografía óptica de proyección

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos de sincronización y de observación

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

El cultivo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; En axénico Liquid Media y Creación de transgénicos Worms por bombardeo de micropartículas

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

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Aislamiento, Transfección y Cultura a Largo Plazo de Cardiomiocitos adultos de ratón y rata

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Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

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Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

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Automatización de la cuantificación agregada en Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...