Name: long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions
Uploaded: 2022-12-02T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH R35GM133588 till G.L.S., ett NIHT32GM008659 utbildningsbidrag till L.E., ett United States National Academy of Medicine Catalyst Award till G.L.S. och State of Arizona Technology and Research Initiative Fund som administreras av Arizona Board of Regents.

1. Recept
OBS: Förbered stamlösningar innan du börjar förbereda mikrobrickplattan.
<ol><li>Stamlösningar för tillväxtmedier för agarosnematod med låg smälthalt (lmNGM)<ol><li>Bered 1 MK2 HPO4 genom att lösa 174,18 g K2HPO4 i 1 liter sterilt avjoniserat vatten i en 1 L flaska. Autoklavera lösningen vid 121 °C, 15 psi, i 30 minuter och förvara den i rumstemperatur (RT).</li>
		<li>Bered 1 M KP i (pH 6,0) genom att lösa 136,09 g K...

<ol>
	<li>Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+Cell+Biology.">Methods in Cell Biology.</a> WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).</li><li>Boulin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eight+genes+are+required+for+functional+reconstitution+of+the+Caenorhabditis+elegans+levamisole-sensitive+acetylcholine+receptor.">Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).</li><li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress &amp; Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).</li><li>Xian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormFarm:+a+quantitative+control+and+measurement+device+toward+automated+Caenorhabditis+elegans+aging+analysis.">WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis.</a> Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).</li><li>Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NemaLife+chip:+a+micropillar-based+microfluidic+culture+device+optimized+for+aging+studies+in+crawling+C.+elegans.">NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).</li><li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li><li>Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Devices+for+Imaging+and+Manipulation+of+C.+elegans.">Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans.</a> Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).</li><li>Levine, E., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+approaches+for+Caenorhabditis+elegans+research.">Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research.</a> Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+platform+for+long-term+culture+and+high-content+phenotyping+of+single+C.+elegans+worms.">Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).</li><li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains.">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).</li><li>Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+swim+sessions+in+C.+elegans+induce+key+features+of+mammalian+exercise.">Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise.</a> BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).</li><li>&#199;elen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+liquid+cultivation+on+gene+expression+and+phenotype+of+C.+elegans.">Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans.</a> BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).</li><li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging.">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652 (2017).</li><li>Turner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+and+monitoring+of+isolated+nematodes+on+solid+media+in+WorMotels.">Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2022).</li><li>Pittman, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+apparatus+for+individual+C.+elegans+culture.">A simple apparatus for individual C. elegans culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).</li><li>Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-microscopy+methods+in+C.+elegans+research.">Light-microscopy methods in C. elegans research.</a> Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).</li><li>Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotyping+for+homotransplantation.+18.+Refinement+of+microdroplet+lymphocyte+cytotoxicity+test.">Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test.</a> Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).</li><li>. Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: <a target="_blank" href="https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628">https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628</a> (2021)</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WormSizer:+high-throughput+analysis+of+nematode+size+and+shape.">WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape.</a> PloS One. 8 (2), 57142 (2013).</li><li>Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+track+of+worm+trackers.">Keeping track of worm trackers.</a> WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).</li><li>Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+tracking+and+quantification+of+C.+elegans+body+shape+and+locomotion+through+coiling,+entanglement,+and+omega+bends.">Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends.</a> Worm. 3 (4), 982437 (2014).</li><li>Raizen, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lethargus+is+a+Caenorhabditis+elegans+sleep-like+state.">Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state.</a> Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).</li><li>Peters, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+landscape+of+age+in+human+peripheral+blood.">The transcriptional landscape of age in human peripheral blood.</a> Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).</li><li>Sutphin, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+orthologs+of+human+genes+differentially+expressed+with+age+are+enriched+for+determinants+of+longevity.">Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity.</a> Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).</li><li>Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+C.+elegans+lifespan+measurement.">Automation of C. elegans lifespan measurement.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).</li></ol>

Här beskriver vi ett nytt odlingssystem som anpassar mikrobrickor, ursprungligen utvecklade för humana leukocytantigenvävnadstypningsanalyser, för att möjliggöra isolering och karakterisering av enstaka C. elegans över tid i en fast mediemiljö som kontextuellt liknar den agarbaserade NGM som är standarden i C. elegans forskning. Detta system är kompatibelt med en mängd olika ingrepp, inklusive kostbegränsning, exogen läkemedelsbehandling, en utmaning med kemiska eller miljömässiga stress...

C. elegans är en kraftfull modellorganism för forskning inom genetik, cellbiologi och molekylärbiologi, eftersom de lätt odlas i laboratoriet, har en kort generationstid och livslängd, delar en hög grad av proteinhomologi med däggdjur och har en transparent kroppsstruktur som möjliggör in vivo-visualisering av fluorescerande proteiner och färgämnen1. Som ett resultat av den långvariga användningen av C. elegans som ett viktigt modellsystem inom en rad områden, inklusive utvecklingsbiologi och åldrande, är deras tillväxt och utveckling väl förstådd, deras genom har sekvenserats fullständigt och en mängd kraftfulla genetiska verktyg har skapats, inklusive genomomfattande RNAi-matningsbibliotek och tusentals mutanta och transgena stammar. Historiskt odlas C. elegans som populationer på tillväxtmedier för fast agarnematod (NGM), och fenotyper utvärderas manuellt antingen genom direkt observation eller genom avbildning och nedströmsanalys. Fluorescerande mikroskopi används för att fånga en mängd olika molekylära fenotyper med färgämnen eller transgent uttryckta fluorescerande taggar i enskilda C. elegans. Fluorescerande avbildning innebär vanligtvis att fixera eller förlama ett djur på objektglas som innehåller tunna agaroskuddar, vilket är invasivt och ofta dödligt. Det innebär också användning av kemikalier, såsom levamisol eller natriumazid, som potentiellt kan störa den molekylära processen av intresse 2,3. Tillsammans tillåter dessa tillvägagångssätt tvärsnittsdata på populationsnivå som ska samlas in över ett brett spektrum av fenotyper, men tillåter inte spårning av enskilda djur över tid.
Under de senaste åren har flera metoder uppstått för att odla isolerade C. elegans, vilket gör det möjligt för forskare att fånga dynamiska förändringar i fysiologiska och molekylära fenotyper av djur över tid med hjälp av ny bildteknik. En kategori av C. elegans kulturmetod är mikrofluidikanordningar, inklusive WormFarm4, Nemalife-chipet5 och "beteende" -chipet av Chronis et al.6, bland olika andra 7,8,9. Relaterade till dessa är vätskebaserade odlingsmetoder, som använder flerbrunnsplattor för att karakterisera enskilda maskar eller små populationer över tiden10,11. Mikrofluidik och mikroplattsystem ger utmärkta kvantitativa mätningar av fenotypiska svar i C. elegans ner till ett enda djur, men odlingsmiljön utgör en viktig begränsning. Den stora majoriteten av tidigare forskning inom C. elegans, särskilt inom åldrande, har slutförts på fasta agarbaserade medier. Flytande kultur får C. elegans att simma kontinuerligt och representerar ett distinkt miljösammanhang som kan förändra den underliggande biologin. Till exempel har djur som odlats i flytande media drastiskt förändrat fettinnehåll och genuttryck - särskilt för gener som är involverade i stressresponsen - i förhållande till djur som odlas på agarbaserad fast NGM12,13. En alternativ kategori av avbildningsmetoder för enstaka djur innefattar polydimetylsiloxan (PDMS) -anordningar som isolerar enskilda djur på fasta medier, i ett försök att närmare efterlikna standardmiljön som upplevs av maskar odlade på fast NGM i gruppkultur på Petri-plattor. WorMotel är en 240-brunns PDMS-enhet utformad för att odla enskilda djur på fasta medier. Varje brunn fylls med en modifierad NGM med lågsmält agaros i stället för agar och sås med bakteriell mat, vilket skapar en fast mediemiljö som liknar det vanligaste odlingssystemet med Petri-plattor. Brunnsväggarna är runda, vilket gör att varje djur kan avbildas oavsett plats i brunnen (undvik den visuella skymningen orsakad av ett djur nära en vägg i en flerbrunnsplatta). Kopparsulfat i en smal vallgrav som omger varje brunn används som avskräckande medel för att hålla djur i sina brunnar14,15. En begränsning av detta tillvägagångssätt är att kopparsulfatet är ineffektivt för att förhindra maskar från att fly när aversiva miljöförhållanden är närvarande, inklusive kostbegränsning, patogena bakterier eller kemikalier som inducerar cellulär stress (t.ex. parakvat).
Ett andra system som använder fasta medier är Worm Corral, som använder en hydrogel för att skapa en liten förseglad miljö för varje mask på ett objektglas, vilket möjliggör långsiktig övervakning av individuellt isolerade djur16. En viktig begränsning är att djur måste förseglas i miljön som ägg, vilket kräver användning av sterila djur för att förhindra reproduktion och begränsar läkemedelsbehandlingar till en enda applikation. Läkemedelsprövningar med flera doser kan utföras i WorMotel antingen genom att utföra flera exponeringsomgångar innan maskar överförs till enheten eller genom att lokalt tillsätta ytterligare läkemedel till brunnarna under experimentet. I det senare fallet är emellertid den faktiska exponeringsdosen efter tillsats av ytterligare ett läkemedel till en befintlig brunn svår att exakt kvantifiera och beror på hur snabbt läkemedlet bryts ned. Både WorMotel och Worm Corral är utmärkta för ljusfälts- eller mörkfältsavbildning för att fånga information relaterad till aktivitet och djurfysiologi (t.ex. tillväxt och utveckling). Även om dessa system kan användas för att övervaka fluorescens, är PDMS som används för att skapa andra enkelmaskavbildningstekniker enligt vår erfarenhet benägna att bilda mikrobubblor, fånga partiklar och andra små avvikelser som genererar oregelbundna fluorescerande artefakter som stör konsekvent fluorescensvisualisering och kvantifiering, särskilt i emissionsområdet för GFP, den vanligaste fluoroforen som används i C. elegans forskning. Hittills är levande fluorescensavbildning av C. elegans enskilda djur på ett longitudinellt sätt främst beroende av mikrofluidikanordningar17.
Här beskriver vi en ny metod för odling av enskilda C. elegans på fasta medier som är kompatibel med både aversiva interventioner och direkt fluorescerande avbildning. Detta tillvägagångssätt liknar konceptet för andra avbildningstekniker med en mask, förutom att det specialgjutna PDMS-chipet ersätts med kommersiellt tillgängliga mikrobrickor av polystyren som ursprungligen utvecklades för mikrocytotoxicitetsanalyser (även vanligen kallade Terasaki-brickor)18. Dessa mikrobrickor har brunnar som kan fyllas med fasta medier och sås med bakteriell mat, vilket nära efterliknar miljön som upplevs av djur under standard fast NGM-odlingsmetodik. Varje brunn är omgiven av en aversiv barriär av palmitinsyra snarare än kopparsulfat. Palmitinsyra används ofta för att förhindra maskar från att fly från fasta medier, med hjälp av standardgruppkultur på Petri-plattor i experiment där maskar utmanas med en aversiv miljö som kostbegränsning eller exponering för en kemisk stressor. Mikrobrickorna producerar också minimal och konsekvent fluorescerande bakgrund, vilket möjliggör fluorescerande avbildning av djur direkt i deras odlingsmiljö. Detta nya solida agarbaserade odlingssystem för ett djur gör det inte bara möjligt att spåra enskilda djur under hela livet och övervaka tillväxt, utveckling, aktivitet och livslängd, utan är också kompatibelt med direkt fluorescerande mikroskopi. Eftersom maskarna kan avbildas utan förlamning eller fixering kan fluorescensbiomarkörer in vivo kvantifieras longitudinellt hos enskilda djur som finns kvar på deras odlingssubstrat, vilket möjliggör observation av dynamiska förändringar under varje djurs livstid. Detta odlingssystem är också kompatibelt med nuvarande generationens automatiserade system för spårning av livslängd och andra hälsomått14,19. Vi tillhandahåller ett detaljerat protokoll för odling av enskilda C. elegans i detta mikrobrickbaserade system, diskuterar potentiella fallgropar och felsökning och diskuterar fördelar och begränsningar i förhållande till andra system, och i synnerhet ett uppdaterat och optimerat WorMotel-protokoll15.
Varje enkelmaskodlingsmiljö består av en mikrobricka monterad inuti ett standardfack med en brunn med en anpassad 3D-tryckt adapter (figur 1A). Brunnarna är fyllda med lågsmält agarosnematodtillväxtmedia (lmNGM), sådd med koncentrerade bakterier som näringskälla och omgiven av en palmitinsyrabeläggning för att förhindra att maskar flyr (figur 1B). Utrymmet mellan mikrobrickan och väggarna på enkelbrunnsplattan är fylld med mättade vattenkristaller för att bibehålla fuktigheten (figur 1B). En tvättmedelsbeläggning appliceras på bricklocket för att förhindra kondens. En enda mask läggs till varje brunn, och enkelbrunnsbrickan är förseglad med Parafilm för att bibehålla fukt och tillåta syreutbyte. Upp till sex mikrobrickor kan rimligen förberedas parallellt av en enda praktiserad forskare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D-printed terasaki inserts</td>
			<td>Custom printing company</td>
			<td>Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 
			-2021.STL</td>
			<td>FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>36-100-4376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>349615000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans N2</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>N2</td>
			<td>Wildtype strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbenicillin</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>C-103-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>ICN Biomedicals Inc</td>
			<td>101380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli OP50&#160;</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Standard labratory food for C. elegans</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ex0276-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Vortex Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G-560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FUdR&#160;</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>F10705-1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrating water crystals&#160;</td>
			<td>M2 Polymer Technologies</td>
			<td>Type S</td>
			<td>Type S super absorbent polymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>I2481C100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P288-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KimTech</td>
			<td>34155</td>
			<td>Task wipes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth, Lennox</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>240230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica K5 sCMOS monochrome camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>11547112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>10450826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20070-250.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#160;</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>M-8900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc OmniTray Single-Well Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>264728</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nystatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N1538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>129700010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Coastwide Professional</td>
			<td>365374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>16-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stratagene UV Stratalinker 2400</td>
			<td>Stratagene</td>
			<td>400075</td>
			<td>UV crosslinker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terasaki trays (Lambda)</td>
			<td>One Lambda</td>
			<td>151431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolyne Dri-bath</td>
			<td>Thermolyne</td>
			<td>DB28125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J20605-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term culture of individual caenorhabditis elegans on solid media for longitudinal fluorescence monitoring and aversive interventions

Caenorhabditis elegans används ofta för att studera åldrande biologi. Standardpraxis i C. elegans åldringsstudier är att odla grupper av maskar på fasta nematodtillväxtmedier (NGM), vilket möjliggör effektiv insamling av data på populationsnivå för överlevnad och andra fysiologiska fenotyper, och periodisk provtagning av subpopulationer för fluorescerande biomarkörkvantifiering. Begränsningar för detta tillvägagångssätt är oförmågan att (1) följa enskilda maskar över tid för att utveckla åldersbanor för fenotyper av intresse och (2) övervaka fluorescerande biomarkörer direkt i samband med odlingsmiljön. Alternativa odlingsmetoder använder flytande kultur eller mikrofluidik för att övervaka enskilda djur över tid, i vissa fall inklusive fluorescenskvantifiering, med avvägningen att odlingsmiljön är kontextuellt skild från fast NGM. WorMotel är en tidigare beskriven mikrofabricerad flerbrunnsanordning för odling av isolerade maskar på fast NGM. Varje mask hålls i en brunn innehållande fast NGM omgiven av en vallgrav fylld med kopparsulfat, ett kontaktavvisande medel för C. elegans, vilket möjliggör longitudinell övervakning av enskilda djur. Vi finner kopparsulfat otillräckligt för att förhindra maskar från att fly när de utsätts för aversiva ingrepp som är vanliga i åldrande forskning, inklusive kostbegränsning, patogena bakterier och kemiska medel som inducerar cellulär stress. Multibrunnsanordningarna är också gjutna av polydimetylsiloxan, vilket ger höga bakgrundsartefakter vid fluorescensavbildning. Detta protokoll beskriver ett nytt tillvägagångssätt för odling av isolerade rundmaskar på fast NGM med kommersiellt tillgängliga polystyrenmikrobrickor, ursprungligen utformade för humant leukocytantigen (HLA) typning, vilket möjliggör mätning av överlevnad, fysiologiska fenotyper och fluorescens över livslängden. En palmitinsyrabarriär hindrar maskar från att fly, även i närvaro av aversiva förhållanden. Varje platta kan odla upp till 96 djur och anpassar sig enkelt till en mängd olika förhållanden, inklusive kostbegränsning, RNAi och kemiska tillsatser, och är kompatibel med automatiserade system för insamling av livslängds- och aktivitetsdata.

Den mikrobrickbaserade enmaskodlingsmiljön som beskrivs här kan användas för att övervaka en mängd olika fenotyper, inklusive livslängd och hälsospan, aktivitet och rörelse, kroppsform och krypgeometri och uttrycket av transgent uttryckta fluorescerande biomarkörer hos enskilda djur över tid. Mikrobrickodlingssystemet är kompatibelt med livslängdsanalys genom antingen manuell poängsättning eller bildinsamling och nedströms bildanalys. Som med standardkultur på Petri-plattor21 kan ...

Watch this Scientific Journal Video about Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions at JoVE.com

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Här presenterar vi ett protokoll för att odla isolerade enskilda nematoder på fasta medier för livslång fysiologisk parameterspårning och fluorescenskvantifiering. Detta odlingssystem inkluderar en palmitinsyrabarriär runt enmaskbrunnar för att förhindra att djur flyr, vilket möjliggör användning av aversiva ingrepp, inklusive patogena bakterier och kemiska stressfaktorer.

Långtidsodling av enskilda Caenorhabditis elegans på fasta medier för longitudinell fluorescensövervakning och aversiva interventioner

Caenorhabditis elegans are widely used to study aging biology. The standard practice in C. elegans aging studies is to culture groups of worms on solid ...

Medan andra fasta odlingsmetoder finns, är detta det första fasta odlingssystemet som möjliggör automatiserad longitudinell spårning av individuellt djurliv och hälsospann och longitudinell avbildning av fluorescerande biomarkörer i ett system. Detta protokoll ger jämförbara resultat med standard C.elegans experiment på fast NGM är kompatibel med både aversiva interventioner och direkt levande fluorescensavbildning. Detta system kommer att vara ovärderligt för åldrande forskning, särskilt när det gäller långvarig exponering för miljöstressorer och observation av gen- och proteindynamik under längre perioder.Att undvika kontaminering och få konsekvent torkning över brunnarna är båda utmanande. Vi lyfte fram viktiga punkter i det skriftliga protokollet för att minimera dessa problem. För att börja, slipa 500 milligram fast palmitinsyra i en murbruk och stöt.Kombinera den med 15 ml TWEEN 20 i en 50 ml konisk injektionsflaska och blanda genom virvelning för att lösa upp kristallerna. Tillsätt 17,5 ml 100% etanol och virvla lösningen för att lösa upp så mycket palmitinsyra som möjligt. Tillsätt sedan 17,5 ml ultrarent vatten och virvel kraftigt.Värm försiktigt lösningen i ett pärlbad vid 80 grader Celsius tills palmitinsyran löser sig helt. Värm upp pärlbadet till 80 grader Celsius. Omedelbart före användning, alikvot en milliliter av palmitinsyraarbetslösningen per mikrobricka i en separat steril behållare och tillsätt fyra mikroliter nystatin per en milliliter palmitinsyralösning före uppvärmning.Spraya nu inuti och utanför mikrobrickan med etanol till mättnad och skaka av överflödig etanol. För att sterilisera mikrobrickan, placera plattan och locket separat i UV-tvärbindaren. Vänd plattan och locket efter 20 minuter.Placera sedan den 15 ml koniska injektionsflaskan med palmitinsyraarbetslösningen i pärlbadet och låt eventuella synliga kristaller lösas upp helt före användning. Värm upp mikrobrickan genom att placera den på avsatsen som omger pärlbadet med locken på i två minuter. Ta bort Microtray-locket och tillsätt långsamt 200 mikroliter palmitinsyraarbetslösning över Microtrays bakvägg.Sätt tillbaka locken och låt mikrobrickan sitta på pärlbadet i två till tre minuter så att palmitinsyralösningen kan sätta sig över botten av mikrobrickan. Rotera mikrobrickan 180 grader och tillsätt palmitinsyraarbetslösningen som visats tidigare. Förbered lmNGM genom att lägga till de komponenter som beskrivs i manuskriptet.Pipettera sedan 20 mikroliter lmNGM i varje mikrobricka placerad på bänken. Var noga med att täcka Microtray när du fyller på pipetten för att minimera förorening. För att fröa Microtray-brunnarna med bakteriell mat, centrifugera en kultur som odlas över natten vid 3 500 G i 20 minuter.Avlägsna supernatanten och suspendera bakteriekulturen på tio gånger med 85 millimolar natriumkloridlösning. Pipettera sedan försiktigt fem mikroliter tiofaldig koncentrerad bakteriekultur på ytan av lmNGM i varje brunn. Undvik att låta bakteriekulturen rinna över sidan av brunnen och in i palmitinsyran, eftersom detta kommer att locka maskar att lämna brunnen.Placera den sterila 3D-tryckta insatsen i en steril platta med en brunn. Placera mikrobrickan i den 3D-tryckta adaptern i plattan med en brunn. Fördela rikligt vattenkristaller ovanpå den 3D-tryckta insatsen mellan Microtrays yttre brunn och innerväggen på enkelbrunnsplattan.Om maskar inte tillsätts omedelbart, försegla Microtray för att använda nästa dag. Stäng bricklocket och använd en enda bit Parafilm för att linda alla fyra sidorna för att försegla mikrobrickan. Upprepa tätningssteget med Parafilm ytterligare två gånger i tre lager.Lägg till en mask per brunn när de har nått önskat livsstadium. Tillsätt 40 mikroliter tvättmedelslösning på locket på en platta med en brunn och använd en specialduk för att täcka locket jämnt. Använd ytterligare arbetsservetter för att sprida tvättmedelslösningen tills synen genom locket inte förvrängs.Sträck den första biten Parafilm något för att täcka två sidor av brickan. Torka av toppen av facket med en specialtorkning och fukta den med 70% etanol för att ta bort eventuella fingeravtryck. Mät livslängden genom att försiktigt knacka på sidan eller toppen av plattan, eller skina ett starkt blått ljus på plattan och observera varje djur.Gör ett djur dött om det inte rör sig inom några sekunder. Upprepa denna uppgift var tredje dag tills alla maskar har dött. Utför fluorescerande avbildning på enskilda brunnar.Exponering för kopparsulfat och ditiotreitol minskade maskens livslängd och hälsospann avsevärt. Däremot minskade kopparsulfat andelen liv som spenderades i god hälsa, medan ditiotreitol inte gjorde det. Kopparsulfat minskade den genomsnittliga aktiviteten hos individer inom befolkningen i större utsträckning än ditiotreitol i alla åldrar.Populationsgenomsnittet för det enskilda djurområdet under livstidsaktivitetskurvan försämras avsevärt av kopparsulfat eller ditiotreitol. Kumulativ aktivitet för enskilda djur fram till dag 10 korrelerar med deras livslängd för ditiotreitolprövade djur, men inte för obehandlade kontroller eller kopparsulfatutmanade djur. En drastisk ökning av KYNU-1-uttryck observeras mellan dag tre och åtta i vuxen ålder, och det finns en progressiv nedgång med åldern efter det.Kumulativ KYNU-1 mScarlet uttryck till och med dag 14 i vuxen ålder korrelerar med djurens livslängd. Eftersom KYNU-1-uttryck är dynamiskt under en livstid jämförde vi KYNU-1-uttryck i olika åldrar med total överlevnad hos enskilda djur. Vid ingen enskild tidpunkt var KYNU-1-uttryck signifikant korrelerat med överlevnad.När du försöker med denna procedur är de viktigaste stegen tillsats av palmitinsyran, pipettering av agar och införande av maskarna. Denna teknik möjliggör longitudinell spårning av livslängd och hälsospann, samt fluorescerande biomarkörer i enskilda maskar på ett sätt som är direkt jämförbart med NGM-analyser.

Research

JoVE Journal

Biology

Long-Term Culture of Individual Caenorhabditis elegans on Solid Media for Longitudinal Fluorescence Monitoring and Aversive Interventions

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Mätning Caenorhabditis elegans Livslängd på fasta medier

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Solid Plate-baserade dietrestriktioner i Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Långsiktig kultur för mänskliga Prover bröstcancer och deras analys Använda optisk Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Långsiktig Dödligt toxicitetstest med Crustacean Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Multilayer Montering för Långsiktigt Ljus ark Mikroskopi av Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

Odling<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; I axenisk Liquid Media och Skapande av transgena maskarna från mikropartikelbombardemang

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Isolering, Transfection, och långsiktig kultur av vuxna Mus och Råtta Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Etikettfri bildbehandling av Lipid Storage Dynamics i Caenorhabditis elegans med stimulerad Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisera aggregatkvantifiering i Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...