我们要感谢华盛顿大学医学院的Anna Hindes，感谢她使用热射法获得高质量精子基因组DNA的初步努力。这项工作由美国国立卫生研究院国家关节炎，肌肉骨骼和皮肤病研究所资助（R01AR072009至RSG）。

这项研究是根据美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南中的指南进行的。该协议已获得德克萨斯大学奥斯汀分校动物护理和使用委员会 （AUP-2021-00254） 的批准。
1. 设计用于CRISPR诱变的sgRNA
<ol><li>获取包含目标位点的外显子序列。</li>
	<li>设计具有原间隔邻基序 （PAM） 位点的合成向导 RNA（sgRNA），该位点特定于 Cas 核酸内切酶。<ol><li>如果共注射供体构建?...

<ol>
	<li>Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+CRISPR/Cas9-mediated+knock-in+in+zebrafish+by+homology-independent+DNA+repair.">Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair.</a> Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+a+CRISPR-Cas+system.">Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li><li>Troutwine, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Reissner+fiber+is+highly+dynamic+in+vivo+and+controls+morphogenesis+of+the+spine.">The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine.</a> Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).</li><li>Xu, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems:+Overview,+innovations+and+applications+in+human+disease+research+and+gene+therapy.">CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).</li><li>Creaser, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+technic+of+handling+the+zebrafish+(Brachydanio+rerio)+for+the+production+of+eggs+which+are+favorable+for+embryological+research+and+are+available+at+any+specified+time+throughout+the+year.">The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year.</a> Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).</li><li>Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservatin+and+in+vitro+fertilization+at+the+zebrafish+international+resource+center.">Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).</li><li>Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axonemal+dynein+heavy+chain+10+gene+is+essential+for+monocilia+motility+and+spine+alignment+in+zebrafish.">The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish.</a> Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).</li><li>Gray, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+screen+for+mutations+affecting+spine+development+in+zebrafish.">Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).</li><li>Brocal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+identification+of+CRISPR/Cas9-induced+insertions/deletions+by+direct+germline+screening+in+zebrafish.">Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish.</a> BMC Genomics. 17, 259 (2016).</li><li>Davis, M. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApE,+A+Plasmid+Editor:+A+freely+available+DNA+manipulation+and+visualization+program.">ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program.</a> Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619 (2022).</li><li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v3:+Expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing.">CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li><li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly+Peak+Parser:+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products.">Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li><li>Varshney, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+gene+targeting+and+phenotyping+in+zebrafish+using+CRISPR/Cas9.">High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9.</a> Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-TOM:+A+platform+for+high-throughput+tracking+of+mutations+induced+by+CRISPR/Cas+systems.">Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems.</a> Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+identification+of+CRISPR/Cas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio.">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).</li><li>Draper, B. W., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+zebrafish+sperm+cryopreservation+and+in+vitro+fertilization.">A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), e1395 (2009).</li><li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants.">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li></ol>

该协议描述了一种通过聚焦分析F0男性精子基因组，使用CRISPR-Cas技术快速表征假定基因组编辑或靶向突变的方法。该协议应适用于其他动物模型，其中精子很容易采样而无需安乐死。这种方法将提高筛选所需编辑的吞吐量，对于识别罕见的 HDR 介导的敲入事件特别有用。这种方法还有助于减少用于寻找稳定种系编辑的实验动物的数量，通过促进从推定的F0载体中快速筛选一个精子样本中潜在的数千...

CRISPR（簇状规则间隔短回文重复序列）/Cas系统是在Danio rerio（斑马鱼）模型系统1，2，3，4中进行位点特异性诱变和精确基因组编辑的强大工具。Cas-核糖核蛋白 （RNP） 由两种主要成分组成：Cas核酸内切酶（通常为 Cas9 或 Cas12a）和位点特异性合成向导 RNA （sgRNA）5。Cas-RNP一起在所需的位点中产生双链断裂（DSB），可以通过两种内在修复机制之一进行修复。非同源端接 （NHEJ） 修复机制容易出错，并且通常会导致 DSB 周围的各种插入或缺失 （插入缺失）。如果这些插入缺失在所得蛋白质序列中引入移码突变或过早停止，则可能是有害的。或者，同源定向修复 （HDR） 机制使用供体模板，在 DSB 位点周围具有同源区域来修复损伤。研究人员可以利用HDR系统生成精确的基因组编辑。具体来说，他们可以共同注入双链DNA供体构建体，其中包含所需的编辑以及基因组中DSB位点两侧的同源区域。这些商业生产的CRISPR组件的规模经济的提高大大减少了筛选多个位点和为精确基因组编辑建立更大规模努力的障碍。然而，在有性繁殖动物模型中，一个主要瓶颈是种系稳定的突变动物的鉴定和分离。
斑马鱼模型系统表现出几个关键品质，可以增强其在反向遗传研究中的使用。它们很容易通过基本的水生住房设备大量饲养，雌性全年表现出很高的繁殖力6。此外，它们的外部产卵和受精使它们适合显微注射CRISPR / Cas成分。Cas-RNP通常被注射到单细胞阶段斑马鱼胚胎中以产生DSB/修复，理论上，DSBs由所有子细胞遗传。然而，二倍体基因组需要两个DSB/修复事件来诱变两个同源染色体。此外，尽管Cas-RNP是在单细胞阶段注射的，但DSB/修复可能要到发育的后期才会发生。这些因素共同促成了注入F0的鱼的马赛克性质。一种常见的做法是杂交F0注入的鱼，并筛选F1后代的插入/特定编辑。然而，由于并非所有注射F0的鱼都具有种系突变，这种做法会导致许多非生产性杂交，无法产生所需的编辑。筛选F0种系而不是F1体细胞组织增加了分离所需种系编辑的可能性，并减少了该过程所需的动物数量。
精子可以很容易地从注射F0的斑马鱼中收集，而无需安乐死。此功能允许冷冻保存和再衍生冷冻精子原种7 ，但也可用于快速筛选，鉴定和分离所需基因组突变的种系携带者8，9。Brocal等人（2016）之前描述了一种基于测序的方法，用于筛选注射F0的雄性斑马鱼10的种系编辑。虽然这种方法可用于鉴定种系中存在的突变等位基因，但在高通量下可能会变得昂贵，并且可能不适用于所有实验室。相比之下，目前的协议提供了一种平易近人且具有成本效益的基于电泳的策略来鉴定种系编辑。具体来说，该协议概述了使用高分辨率琼脂糖凝胶电泳筛选和分离特定位点种系突变的稳健方法。此外，该协议描述了一种类似的策略，用于识别包含特定编辑的供体构建体的成功整合。与往常一样，如果需要特定的编辑，可以与下面描述的协议一起执行基于测序的策略。尽管该协议特定于斑马鱼模型系统，但这些原则应适用于任何将精子收集作为常规程序的模型。总之，这些策略将允许鉴定具有种系插入缺失/编辑的F0注射雄性，这些插入缺失/编辑可以在标准聚合酶链反应（PCR）和/或限制性酶切后在凝胶上解决。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose powder&#160;</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1356-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breeding tanks</td>
			<td>Carolina Biological&#160;</td>
			<td>161937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BstNI Restriction Enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0168S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Endonuclease</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Ladder, 100 bp&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>FERSM0241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 donor construct&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry. 
			Phosphorothioate bond on the donor at the first three phosphate bonds on both the 5&#8217; and 3&#8217; ends (5&#39;-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC 
			TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT 
			GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC 
			AGTGATTACGTCACGC-3&#39;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 forward primer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5&#39;-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT 
			TTGGC-3&#39;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 reverse primer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (&#39;5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA 
			ATACAGC-3&#39;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dnah10 synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego&#160;</td>
			<td>Synthetic sgRNA, target sequence: 5&#39;-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>105ECA-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter forceps</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish (system) water</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis system (including casting frame, comb, and electrophoresis chamber)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>B2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging light box&#160;</td>
			<td>Azure Biosystems</td>
			<td>AZI200-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel stain, 10000X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bowl, 250 mL&#160;</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation tanks, 0.8 L&#160;</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZT080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcap capillary tube with bulb, 20 &#181;L&#160;</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-0020/CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minicentrifuge</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12011919EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes, various with appropriate tips</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave&#160;</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P119-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes, 0.2 mL</td>
			<td>Bioexpress</td>
			<td>T-3196-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon, with drilled holes/slots&#160;</td>
			<td>Generic</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl solution, 0.2 M RNAse Free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p2ry12 forward primer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5&#39;-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT 
			-3&#39;)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p2ry12 reverse primer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DNA Oligo in Tube; 0.025 nM, standard desalt purification, dry (5&#39;-CCAGGAACACATTAACCTGGAT 
			-3&#39;)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p2ry12 synthetic sgRNA&#160;</td>
			<td>Synthego&#160;</td>
			<td>Synthetic sgRNA, target sequence: 5&#39;-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzyme 10X Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6003SVIAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH solution, 50 mM&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>S318; 424330010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge, 1-inch x 1-inch cut with small oval divot</td>
			<td>Generic&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq polymerase master mix, 2X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBE Buffer Concentrate, 10X</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue paper</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine-methanesulfonate solution (Syncaine, MS-222), 0.016% in fish water (pH 7.0&#177;0.2)&#160;</td>
			<td>Syndel</td>
			<td>200-266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base, 1M (Buffered with HCl to ph 8.0)&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5131</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening sperm for the rapid isolation of germline edits in zebrafish

靶向CRISPR-Cas核酸酶技术的出现彻底改变了在已建立和新兴模型系统中进行精确基因组编辑的能力。CRISPR-Cas基因组编辑系统使用合成向导RNA（sgRNA）将CRISPR相关（Cas）核酸内切酶靶向特定的基因组DNA位点，其中Cas核酸内切酶产生双链断裂。通过固有的容易出错机制修复双链断裂会导致插入和/或删除，从而破坏位点。或者，在此过程中包含双链DNA供体或单链DNA寡核苷酸可以引发精确的基因组编辑，范围从单核苷酸多态性到小免疫标签甚至大荧光蛋白构建体。然而，这个过程的一个主要瓶颈可能是在种系中发现和分离所需的编辑。该协议概述了一种在 Danio rerio （斑马鱼）的特定位点筛选和分离种系突变的可靠方法;然而，这些原则可能适用于任何可以 体内精子收集 的模型。

该协议中描述的实验方法允许通过专注于分析来自F0注射的男性精子收集的数千个基因组来更快速地识别基因组编辑或假定的有害等位基因。 图 2 重点介绍了如何解释使用此协议获得的结果。
为了在p2ry12位点中产生突变，向单细胞阶段斑马鱼胚胎注射Cas9核酸内切酶和p2ry12特异性sgRNA（图2B，灰色突出显示）。将注射F0?...

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Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

CRISPR-Cas技术彻底改变了基因组编辑领域。然而，寻找和分离所需的种系编辑仍然是一个主要瓶颈。因此，该协议描述了一种使用标准PCR，限制性酶切和凝胶电泳技术快速筛选F0 CRISPR注射斑马鱼精子以进行种系编辑的稳健方法。

筛选精子以快速分离斑马鱼的种系编辑

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

该协议描述了一种使用F0 CRISPR注射的斑马鱼精子快速筛选数千个基因组的方法。这种技术在其可访问性方面是有利的。我们的方法不是昂贵的、专门的基于测序的方法，而是使用PCR限制性内切酶和凝胶电泳来筛选F0男性携带者以进行插入缺失或特异性基因组编辑。这个过程最困难的部分是快速获得精子，但如果我们与大量畸形鱼一起工作，它将成为体外受精的好技术，因此这是我们杂交给我们带来麻烦的鱼的简单方法。首先为野生型和F0鱼设置繁殖池，并在夜间孵化水箱。第二天麻醉雄鱼后，用漏勺将其转移到一堆干净的纸巾上。轻轻滚动鱼以去除多余的水分。用干净的折叠纸巾吸干水分，以去除任何水分。使用漏勺将鱼转移到准备好的海绵上。将鱼的腹侧朝上，用干净的折叠薄纸轻轻吸干臀鳍周围的区域。要收集精子，请使用毛细管轻轻地将盆鳍从中线移开，露出泄殖腔。将毛细管放在泄殖腔附近。用手指或一对过滤镊，从鳃向下轻轻挤压鱼的侧面。使用毛细管作用，将精子收集在管中并将其放入含有40微升50毫摩尔氢氧化钠溶液的PCR管中，然后将样品排出到管中。在小型离心机中旋转精子样品后，将PCR管放入热循环仪中。通过在95摄氏度下加热样品40分钟，然后在25摄氏度下冷却来运行循环仪。从循环仪中取出样品后，加入10微升pH为8的1摩尔三盐酸盐来中和pH值。通过吸出悬浮液进行混合，然后离心样品。将热循环仪设置为 95 摄氏度以进行预热。同时，为每个精子样品准备25微升PCR反应混合物。通过上下移液充分混合，然后旋转样品。将样品放入预热的热循环仪中并设置循环。为了获得凝胶溶液，通过微波加热通过混合琼脂糖粉，凝胶染色剂和TBE缓冲液制备的4%琼脂糖凝胶溶液。将凝胶溶液倒入凝胶浇铸框架中，并在一侧插入梳子。凝胶凝固后，小心地取下梳子。将凝胶放入电泳台中，使孔最靠近负极。将TBE运行缓冲液倒入钻机中，直到孔完全浸没。通过将五微升DNA分子量标准移液到第一个孔中开始加载凝胶。用5至10微升PCR产物加载剩余的孔。在 150 伏下运行凝胶 1 小时，以确保扩增子充分分离。使用凝胶成像仪查看DNA条带。P2ry12基因座分析显示，野生型扩增子显示250个碱基对长度的单条带，而含有插入缺失的F0注入雄性扩增子以多个条带的形式运行。DNAH10位点分析表明，野生型扩增子以单个400碱基对长带的形式运行。含有插入缺失的F0注射雄性扩增子以多条带或单个条带的形式运行，凝胶迁移率降低。F0注射的男性一号在消化产物中有一个额外的条带，该条带在PCR产物中不存在，使其成为突变敲入线建立的最佳创始人候选者。如果雄鱼在挤压时不产生精子，最好让鱼休息一周，然后再试一次，而不是用力挤压它们并冒着伤害它们的风险。一旦FC或男性创始人被杂交，就需要在F1后代中对等位基因进行序列验证。直接对F1扩增子进行测序并进行杂合等位基因分析是一种简单的方法。

screening-sperm-for-the-rapid-isolation-of-germline-edits-in-zebrafish

Research

JoVE Journal

Genetics

1.1K Views.  The University of Texas at Austin. This protocol describes a method for quickly screening thousands of genomes using F0 CRISPR-injected zebrafish sperm. This technique is advantageous in its accessibility. Rather than expensive, specialized sequencing-based approaches, our method uses PCR restriction enzymes and gel electrophoresis to screen F0 male carriers for indels or specific genome edits.The hardest part of this procedure is just getting the sperm quickly, but it becomes a good technique for in vitro fertilization...