Name: single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing at JoVE.com

De auteurs willen de steun erkennen van de Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) en het Research Fund Program van Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).

Alle dierprotocollen tijdens deze studie zijn goedgekeurd door de Hainan University Institutional Animal Care and Use Committee (protocolnummer: HNUAUCC-2022-00063; Goedkeuringsdatum: 2022-03-03). Een lijst van de apparatuur en benodigdheden die in dit experiment zijn gebruikt, is te vinden in de Materiaaltabel. Een samenvatting van het huidige protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Visbereiding
<ol><li>Verkrijg 6 maanden oude ...

Dit protocol beschrijft de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van de nile tilapia darm. Vóór dissociatie is de verwijdering van vet en mesenterium uit de darm noodzakelijk, vooral voor vleesetende visdarmen met veel vet. Het gebruik van een spuit in plaats van hard schrapen om de darminhoud af te wassen, vermindert de mechanische schade aan de cellen. Om de levensvatbaarheid van de cellen te garanderen, is het ook essentieel om de temperatuur op 20 °C of lager te houden voor de weefseldissectie- en sp...

Cellen zijn de fundamentele eenheden van organismen. In vergelijking met bulkweefselstudies kunnen studies op eencellig niveau de heterogeniteit van cellen weerspiegelen en informatie met een hogere resolutie opleveren1. In de afgelopen jaren hebben onderzoekers single-cell sequencing-technologieën toegepast voor genoom-, transcriptoom-, epigenoom- of multi-omic-studies op eencellig niveau bij zoogdieren, zebravissen en andere modelorganismen en rapporteerden grote doorbraken 2,3,4,5,6,7 . Hoewel de meeste studies zich hebben gericht op modelorganismen, zijn er weinig referentieprotocollen of commerciële dissociatiekits voor single-cell sequencing in economische vissoorten, wat de toepassing van single-cell sequencing in aquacultuuronderzoek beperkt. Daarom is het ontwikkelen van weefseldissociatieprotocollen die hoogwaardige eencellige suspensies produceren met een hoge levensvatbaarheid van cellen en nucleïnezuurintegriteit cruciaal.
Het optimaliseren van het weefseldissociatieprotocol met de juiste enzym- of enzymcombinatie om voldoende levensvatbare cellen met minimale schade te verkrijgen, is essentieel. Het meest effectieve enzym voor weefseldissociatie varieert afhankelijk van het weefseltype. Bij zoogdieren zijn verschillende enzymen gebruikt om eencellige suspensies te bereiden voor vaste weefsels van zoogdieren, waaronder collagenase, dispase, trypsine, papaïne, elastase, hyaluronidase, liberase, accutase en trypLE 8,9. Trypsinevertering in combinatie met mechanische verstoring is vaak gebruikt om weefsels te dissociëren voor celkweek in vissen 10,11,12,13,14. Trypsine is ook gebruikt of toegevoegd aan de verteringscocktail voor weefseldissociatie in de rattendarm15 en zebraviskieuwweefsel16. Om verschillende redenen is trypsine echter niet de beste optie voor single-cell sequencing. Trypsine alleen is meestal niet effectief voor weefseldissociatie. Bovendien induceert trypsine DNA-strengbreuken 17,18 en RNA-afbraak19.
Papaïne breekt de eiwitten af die de tight junctions tussen cellen vormen. In zenuw- en gladde spiercellen van zoogdieren is papaïne efficiënter en minder destructief dan andere proteasen20,21. Net als trypsine resulteert papaïne echter in de vrije DNA-geïnduceerde aggregatie van cellen als gevolg van de cellysis die optreedt tijdens enzymatische spijsvertering9. Elastase breekt elastine af, dat meestal wordt aangetroffen in de huid, longen, ligamenten, pezen en vasculaire weefsels22. Het wordt vaak gebruikt in combinatie met collagenase, dispase of trypsine voor het dissociëren van longweefsel8. Hyaluronidase splitst de glycosidische bindingen van hyaluronaat en draagt bij aan de vertering van de extracellulaire matrix in verschillende bindweefsels en huid 9,23.
Over het algemeen zijn collagenase en dispase goede opties voor extracellulaire matrixafbraak. Ze zijn gebruikt bij de dissociatie van menselijke, muis- en zebravisdarmen24,25,26,27. Collagenase vernietigt de peptidebinding in collageen, bevordert de vertering van de extracellulaire matrix en geeft de cellen vrij in suspensie, en dus wordt collagenase vaak gebruikt voor dissociatie van vast weefsel van mens en muis, inclusief voor de lever 28,29, milt30, pancreas31 en darm 25. Dispase is een protease dat de N-terminale peptidebindingen van niet-polaire aminozuurresiduen hydrolyseert en milder is dan collagenase. Het splitst de extracellulaire matrixcomponenten, zoals fibronectine, type IV-collageen en in mindere mate type I-collageen, zonder cel-celverbindingen te beïnvloeden. Dispase wordt afzonderlijk of met andere enzymen gebruikt voor weefseldissociatie, zoals voor darm25,32, hersenen33, lever 34, enz. Bovendien zijn in de handel verkrijgbare digestiecocktails, waaronder liberase, accutase en trypLE, ook goede alternatieven voor dissociatie van vast weefsel, vooral voor de huid, lever en nieren 8,9.
Nijltilapia (Oreochromis niloticus) behoort tot de familie Cichlidae van de orde Perciformes. Het is een van de meest gekweekte zoetwatervissoorten in tropische en subtropische gebieden, met een jaarlijkse productie van 4,5 miljoen ton in 202235. Het is een van de best bestudeerde aquacultuurvissoorten met een goed geannoteerd genoom. Nijltilapia is een ideaal onderzoeksmodel voor aquacultuurvissoorten vanwege de korte generatietijd, het gemak van kweken en het aanpassingsvermogen aan een breed scala aan kweekomgevingen. De darm is van groot onderzoeksbelang omdat het het orgaan is van voedingsvertering en -absorptie, metabolisme en mucosale immuniteit. De darm is de habitat van microbiële populaties en is een essentieel immuunweefsel36. Het is immunologisch actief vanwege de aanwezigheid van talrijke immuunceltypen, waaronder macrofagen, B-cellen, granulocyten en T-cellen.
In de huidige studie hebben we een protocol ontwikkeld voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nijltilapia-darm om studies op eencellig niveau in aquacultuurvissoorten te vergemakkelijken. Volgens de kenmerken van deze weefselspecifieke enzymen en voorwerk is collagenase/dispase geschikt voor het dissociëren van tilapia-darmweefsel. Het laatste enzymtype waarmee rekening moet worden gehouden bij het bereiden van eencellige suspensies is DNase-I, dat celaggregatie voorkomt door vrij DNA af te breken dat vrijkomt door dode cellyse tijdens enzymatische spijsvertering zonder apoptotische routes te initiëren9 en verhoogt de levende celopbrengst36. Bovendien wordt runderserumalbumine (BSA) aan de wasbuffer toegevoegd om celklontering te verminderen en de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren. Verschillende reagensbedrijven beschrijven BSA als een enzymstabilisator. De toevoeging van 0,04%-1% BSA aan PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) is gebruikt om een wasoplossing te ontwikkelen voor het bereiden van eencellige sequencing-suspensies zonder nadelige effecten38. De toevoeging van een lage verhouding BSA kan helpen de levensvatbaarheid van cellen te behouden en de vrije DNA-geïnduceerde aggregatie van cellen als gevolg van cellyse te voorkomen. Dit protocol kan ook een waardevolle referentie zijn voor het ontwikkelen van celdissociatieprotocollen uit de darmen van andere aquacultuurvissoorten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-&#956;m Sterile Filter</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>It is used to filter and sterilize the enzyme solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>F8200</td>
			<td>Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0098</td>
			<td>Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1&#215; DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A004202</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638-001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4818</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td>DNase I helps reduce cell clumping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>E607009-0500</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600438</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted&#160;Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>qTOWER3G</td>
			<td>It is used to examine cell viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile tilpia (Oreochromis niloticus)</td>
			<td>ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>It is used to spin down the tissue and cell petet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td>Inhibit RNase activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B644201-0050</td>
			<td>It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>For fish euthanasia.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C0040</td>
			<td>It is used for staining dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing

Nijltilapia is een van de meest gekweekte zoetwatervissoorten wereldwijd en is een veelgebruikt onderzoeksmodel voor aquacultuurvisstudies. De bereiding van hoogwaardige eencellige suspensies is essentieel voor studies op single-cell niveau, zoals single-cell RNA of genome sequencing. Er is echter geen kant-en-klaar protocol voor aquacultuurvissoorten, met name voor de darm van tilapia. De effectieve dissociatie-enzymen variëren afhankelijk van het weefseltype. Daarom is het optimaliseren van het weefseldissociatieprotocol door de juiste enzym- of enzymcombinatie te selecteren om voldoende levensvatbare cellen met minimale schade te verkrijgen, essentieel. Deze studie illustreert een geoptimaliseerd protocol om een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nile tilapia-darm te bereiden met een enzymcombinatie van collagenase / dispase. Deze combinatie is zeer effectief voor dissociatie met het gebruik van runderserumalbumine en DNase om celaggregatie na de spijsvertering te verminderen. De celoutput voldoet aan de vereisten voor single-cell sequencing, met 90% cel levensvatbaarheid en een hoge celconcentratie. Dit protocol kan ook worden aangepast om een eencellige suspensie uit de darmen van andere vissoorten te bereiden. Dit onderzoek biedt een efficiënt referentieprotocol en vermindert de behoefte aan aanvullende proeven bij de bereiding van eencellige suspensies voor aquacultuurvissoorten.

Dit protocol beschrijft de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van de Nijltilapia-darm voor eencellige sequencing (figuur 1). Uit dit onderzoek blijkt dat de collagenase/dispase mix een goed dissociatie effect heeft en mild is voor darmweefsel. De selectie van het optimale verteringsenzym is essentieel voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie. In het voorbereidende werk werden de dissociatie-efficiënties van verschillende veelgebruikte enzymen vergeleken e...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing at JoVE.com

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Hier demonstreren we de voorbereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van tilapia-darm voor single-cell sequencing.

Single-Cell Suspension Voorbereiding van Nile Tilapia Intestine voor Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Dit protocol biedt een betrouwbare referentie voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nijltilapia-darm om studies op eencellig niveau in aquacultuurvissoorten te vergemakkelijken. De technologie is zeer efficiënt en kan in de meeste laboratoriumomstandigheden worden geïmplementeerd. Het vermindert de noodzaak van aanvullende proeven om eencellige suspensies voor aquacultuurvissoorten te bereiden.Begin met het spoelen van zes maanden oude Nijltilapiavis in goed belucht steriel water gedurende 15 minuten om losjes gebonden bacteriën van het oppervlak af te spoelen. Voor de bereiding van het enzymatische celdissociatiereagens verdunt u de collagenasedispase in PBS tot een eindconcentratie van één milligram per milliliter. Meng 95% volume van de bereide enzymatische oplossing en 5% volume FBS.Vervolgens de centrifuge voor gebruik voorgekoeld tot vier graden Celsius. Voor weefseldissectie plaatst u de geëuthanaseerde vis op ijs en verzamelt u drie tot vier centimeter van de darmen middensectie. Snijd het vet en mesenterium weg met een tang.Verwijder het vet dat aan het darmoppervlak is bevestigd en het elastische en kneedbare heldere slijmvlies. Spoel het darmfragment voorzichtig af met steriele ijskoude PBS met een spuit om de darminhoud en het slijm af te spoelen. Na verschillende wasbeurten ontleed je het fragment in kleine stukjes en breng je ze over in een buis van 1,5 milliliter met één milliliter ijskoude PBS.Centrifugeer het mengsel op 300 x g in vier graden Celsius gedurende vijf minuten. En vervang het supernatant door één milliliter ijskoude 0,08%BSA-DPBS. Gebruik een glazen pipet om de weefselfragmenten voorzichtig te resuspenderen.Nadat u de stukjes nog een keer hebt gewassen, verwijdert u het supernatant en voegt u één milliliter van het bereide enzymatische dissociatiereagens toe. Meng ook vijf microliter RNA-remmer met het dissociatiereagens voor eencellige RNA-sequencing. Plaats de buis op een gehard waterbad van 37 graden Celsius en keer de buis elke vijf minuten handmatig om gedurende de incubatietijd van 30 tot 60 minuten.Zodra de buizen zijn gesponnen, verwijdert u het enzymatische celdissociatiereagens met behulp van uiteinden met een brede boring. Voeg een milliliter ijskoude 0,08% BSA-DPBS toe en pipetteer de cellen voorzichtig op en neer om celverstoring te voorkomen. Na centrifusie en het opnieuw suspuskeren van de cellen nog een keer, plaatst u de 40 micrometer celzeef voorbevochtigd met 0,08% BSA-DPBS op een conische buis van 50 milliliter.Haal de celsuspensie door de zeef. Tik op de zeef, spoel deze vervolgens af met 200 microliter DPBS en verzamel de suspensie aan de onderkant van de buis. Voeg na het overbrengen van de suspensie in een buis van 1,5 milliliter vijf microliter DNA's toe en incuber de suspensie gedurende 15 minuten bij 15 tot 20 graden Celsius.Eenmaal gecentrifugeerd, verwijdert u het supernatant en resuspenseert u de celpellet in 400 microliter ijskoude DPBS zonder calcium- en magnesiumionen. Pipetteer vervolgens voorzichtig op en neer met brede uiteinden om de cellen te mengen en herhaal dit proces nog een keer. Voor kleuring, meng de celsuspensie in 0,4% trypan blauwe oplossing in een gelijke verhouding en incubeer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 10 microliter van het mengsel toe op de glasplaat. Tel de levensvatbare en dode cellen onder de microscoop in drie velden en bereken het levensvatbaarheidspercentage van de cel. De dissociatie-efficiëntie van verschillende veelgebruikte enzymen werd vergeleken.Van de collagenase dispase-mix werd geverifieerd dat deze een beter dissociatie-effect had dan de collagenase dispase of trypsine alleen en verschillende andere enzymmengsels. Het microscopisch onderzoek toonde aan dat de darmcellen een hoge levensvatbaarheid hadden en zich als afzonderlijke cellen verspreidden. De meeste cellen waren levensvatbaar, terwijl een paar dood waren gekleurd vanwege het gepermeabliseerde celmembraan.Let op het type PBS dat wordt gebruikt. Enzymatische verteringsoplossing kan niet worden gebruikt met calcium / magnesiumvrije PBS omdat het enzym calcium / magnesiumionen nodig heeft om effectief te functioneren. De procedure vergemakkelijkt studies op eencellig niveau in aquacultuurvissoorten en biedt een waardevolle referentie voor het ontwikkelen van celdissociatieprotocollen van aquacultuurvissoorten.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse Spleen met de gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Gestandaardiseerde Voorbereiding van de Single-celsuspensies van Mouse longweefsel met behulp van de gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generatie van de Single-celsuspensies van Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Single-cell Suction Recordings van Mouse Cone fotoreceptoren

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell Transcriptionele Profilering van de volwassen muis cardiomyocyten

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Eencellige micro-injectie voor mobiele Communicatie Analyse

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

Isolatie van kernen uit flash-bevroren leverweefsel voor eencellige multiomics

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Fluorescence-Activated Single-Cell Sorting of Human Mesenchymal Stem Cells

Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth

Importance of Single Cell Sorting in Isolating Purified Populations of Mesenchymal Stem Cells (Video) | JoVE

Eencellige sortering van immunofenogetypeerde mesenchymale stamcellen van menselijke geëxfolieerde bladverliezende tanden

The mesenchymal stem cells (MSCs) of an organism possess an extraordinary capacity to differentiate into multiple lineages of adult cells in the body and ...

Two-Step Cell Digestion of Mouse Carotid Artery

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy (Video) | JoVE

Bereiding van een eencellige suspensie uit halsslagaders van muizen voor eencellige sequencing

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...