Name: single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00
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Gli autori desiderano riconoscere il sostegno della Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) e del Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).

Tutti i protocolli sugli animali durante questo studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Hainan (numero di protocollo: HNUAUCC-2022-00063; Data di approvazione: 2022-03-03). Un elenco delle attrezzature e delle forniture utilizzate in questo esperimento può essere trovato nella tabella dei materiali. Un riepilogo del protocollo corrente è illustrato nella Figura 1.
1. Prep...

Questo protocollo descrive la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell'intestino di tilapia del Nilo. Prima della dissociazione, è necessaria la rimozione del grasso e del mesentere dall'intestino, in particolare per gli intestini di pesci carnivori con molto grasso. L'uso di una siringa invece di raschiare duramente per lavare via il contenuto intestinale riduce il danno meccanico alle cellule. Per garantire la vitalità cellulare, è anche essenziale mantenere la temperatura a 20 °C o inferi...

Le cellule sono le unità fondamentali degli organismi. Rispetto agli studi sui tessuti di massa, gli studi a livello di singola cellula possono riflettere l'eterogeneità cellulare e fornire informazioni a risoluzione più elevata1. Negli ultimi anni, i ricercatori hanno applicato tecnologie di sequenziamento a singola cellula per studi su genoma, trascrittoma, epigenoma o multi-omici a livello di singola cellula in mammiferi, zebrafish e altri organismi modello e hanno riportato grandi scoperte 2,3,4,5,6,7 . Mentre la maggior parte degli studi si è concentrata su organismi modello, ci sono pochi protocolli di riferimento o kit di dissociazione commerciale per il sequenziamento a singola cellula nelle specie ittiche economiche, il che limita l'applicazione del sequenziamento a singola cellula nella ricerca sull'acquacoltura. Pertanto, lo sviluppo di protocolli di dissociazione tissutale che producano sospensioni monocellulari di alta qualità con elevata vitalità cellulare e integrità dell'acido nucleico è fondamentale.
È essenziale ottimizzare il protocollo di dissociazione tissutale con l'enzima o la combinazione enzimatica appropriata per ottenere un numero sufficiente di cellule vitali con il minimo danno. L'enzima più efficace per la dissociazione tissutale varia a seconda del tipo di tessuto. Nei mammiferi, diversi enzimi sono stati utilizzati per preparare sospensioni unicellulari per i tessuti solidi dei mammiferi, tra cui collagenasi, dispasi, tripsina, papaina, elastasi, ialuronidasi, liberase, accutasi e trypLE 8,9. La digestione della tripsina combinata con la rottura meccanica è stata comunemente usata per dissociare i tessuti per la coltura cellulare nei pesci 10,11,12,13,14. La tripsina è stata anche utilizzata o aggiunta nel cocktail di digestione per la dissociazione dei tessuti nell'intestino di ratto15 e nel tessuto branchiale zebrafish16. Tuttavia, per diversi motivi, la tripsina non è l'opzione migliore per il sequenziamento a singola cellula. La tripsina da sola è di solito inefficace per la dissociazione tissutale. Inoltre, la tripsina induce rotture del filamento di DNA 17,18 e degradazione dell'RNA19.
La papaina degrada le proteine che compongono le giunzioni strette tra le cellule. Nelle cellule nervose e muscolari lisce dei mammiferi, la papaina è più efficiente e meno distruttiva di altre proteasi20,21. Tuttavia, come la tripsina, la papaina provoca l'aggregazione libera indotta dal DNA delle cellule a causa della lisi cellulare che si verifica durante la digestione enzimatica9. L'elastasi rompe l'elastina, che si trova tipicamente nella pelle, nei polmoni, nei legamenti, nei tendini e nei tessuti vascolari22. È spesso usato in combinazione con collagenasi, dispasi o tripsina per dissociare il tessuto polmonare8. La ialuronidasi fende i legami glicosidici dello ialuronano, contribuendo alla digestione della matrice extracellulare in vari tessuti connettivi e della pelle 9,23.
In generale, la collagenasi e la dispasi sono buone opzioni per la rottura della matrice extracellulare. Sono stati utilizzati nella dissociazione degli intestini umani, di topo e zebrafish24,25,26,27. La collagenasi distrugge il legame peptidico nel collagene, promuove la digestione della matrice extracellulare e rilascia le cellule in sospensione e, quindi, la collagenasi viene spesso utilizzata per la dissociazione dei tessuti solidi umani e di topo, incluso il fegato 28,29, la milza30, il pancreas31 e l'intestino 25. La dispasi è una proteasi che idrolizza i legami peptidici N-terminali dei residui di amminoacidi non polari ed è più mite della collagenasi. Fende i componenti della matrice extracellulare, come la fibronectina, il collagene di tipo IV e, in misura minore, il collagene di tipo I, senza influenzare le giunzioni cellula-cellula. Dispase è usato separatamente o con altri enzimi per la dissociazione dei tessuti, come per intestino25,32, cervello33, fegato34, ecc. Inoltre, i cocktail di digestione disponibili in commercio, tra cui liberase, accutase e trypLE, sono anche buone alternative per la dissociazione dei tessuti solidi, in particolare per la pelle, il fegato e i reni 8,9.
La tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) appartiene alla famiglia Cichlidae dell'ordine Perciformes. È una delle specie ittiche d'acqua dolce più coltivate nelle aree tropicali e subtropicali, con una produzione annua di 4,5 milioni di tonnellate nel 202235. È una delle specie di pesci di acquacoltura meglio studiate con un genoma ben annotato. La tilapia del Nilo è un modello di ricerca ideale per le specie ittiche di acquacoltura grazie al suo breve tempo di generazione, alla facilità di allevamento e all'adattabilità a una vasta gamma di ambienti di allevamento. L'intestino è di grande interesse di ricerca in quanto è l'organo della digestione e dell'assorbimento della nutrizione, del metabolismo e dell'immunità delle mucose. L'intestino è l'habitat delle popolazioni microbiche ed è un tessuto immunitario essenziale36. È immunologicamente attivo a causa della presenza di numerosi tipi di cellule immunitarie, tra cui macrofagi, cellule B, granulociti e cellule T.
Nel presente studio, abbiamo sviluppato un protocollo per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità dall'intestino della tilapia del Nilo per facilitare gli studi a livello di singola cellula nelle specie ittiche di acquacoltura. Secondo le caratteristiche di questi enzimi tessuto-specifici e il lavoro preliminare, la collagenasi/dispasi è appropriata per dissociare il tessuto intestinale della tilapia. L'ultimo tipo di enzima da considerare nella preparazione di sospensioni monocellulari è la DNasi-I, che impedisce l'aggregazione cellulare degradando il DNA libero rilasciato attraverso la lisi delle cellule morte durante la digestione enzimatica senza iniziare le vie apoptotiche9 e aumenta la resa delle cellule vive36. Inoltre, l'albumina sierica bovina (BSA) viene aggiunta al tampone di lavaggio per ridurre l'aggregazione cellulare e migliorare la vitalità cellulare. Diverse aziende produttrici di reagenti descrivono BSA come uno stabilizzatore enzimatico. L'aggiunta di BSA allo 0,04%-1% di BSA al PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) è stata utilizzata per sviluppare una soluzione di lavaggio per la preparazione di sospensioni di sequenziamento monocellulare senza effetti avversi38. L'aggiunta di un basso rapporto di BSA potrebbe aiutare a mantenere la vitalità cellulare ed evitare l'aggregazione libera indotta dal DNA delle cellule a causa della lisi cellulare. Questo protocollo può anche fornire un valido riferimento per lo sviluppo di protocolli di dissociazione cellulare dall'intestino di altre specie di pesci di acquacoltura.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-&#956;m Sterile Filter</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>It is used to filter and sterilize the enzyme solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>F8200</td>
			<td>Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0098</td>
			<td>Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1&#215; DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A004202</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638-001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4818</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td>DNase I helps reduce cell clumping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>E607009-0500</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600438</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted&#160;Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>qTOWER3G</td>
			<td>It is used to examine cell viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile tilpia (Oreochromis niloticus)</td>
			<td>ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>It is used to spin down the tissue and cell petet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td>Inhibit RNase activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B644201-0050</td>
			<td>It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>For fish euthanasia.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C0040</td>
			<td>It is used for staining dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing

La tilapia del Nilo è una delle specie di pesci d'acqua dolce più comunemente coltivate in tutto il mondo ed è un modello di ricerca ampiamente utilizzato per gli studi sui pesci di acquacoltura. La preparazione di sospensioni monocellulari di alta qualità è essenziale per gli studi a livello di singola cellula come l'RNA a singola cellula o il sequenziamento del genoma. Tuttavia, non esiste un protocollo pronto all'uso per le specie ittiche di acquacoltura, in particolare per l'intestino della tilapia. Gli enzimi di dissociazione efficaci variano a seconda del tipo di tessuto. Pertanto, è essenziale ottimizzare il protocollo di dissociazione tissutale selezionando l'enzima o la combinazione enzimatica appropriata per ottenere un numero sufficiente di cellule vitali con il minimo danno. Questo studio illustra un protocollo ottimizzato per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità dall'intestino di tilapia del Nilo con una combinazione enzimatica di collagenasi/dispasi. Questa combinazione è altamente efficace per la dissociazione con l'utilizzo di albumina sierica bovina e DNasi per ridurre l'aggregazione cellulare dopo la digestione. La produzione cellulare soddisfa i requisiti per il sequenziamento di singole cellule, con una vitalità cellulare del 90% e un'alta concentrazione cellulare. Questo protocollo può anche essere modificato per preparare una sospensione unicellulare dall'intestino di altre specie di pesci. Questa ricerca fornisce un protocollo di riferimento efficiente e riduce la necessità di ulteriori prove nella preparazione di sospensioni monocellulari per specie ittiche di acquacoltura.

Questo protocollo descrive la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell'intestino di tilapia del Nilo per il sequenziamento a singola cellula (Figura 1). Questa ricerca mostra che il mix collagenasi/dispasi ha un buon effetto di dissociazione ed è delicato per il tessuto intestinale. La selezione dell'enzima di digestione ottimale è essenziale per preparare una sospensione unicellulare di alta qualità. Nel lavoro preliminare, sono state confrontate le efficienze d...

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Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Qui, dimostriamo la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dell'intestino di tilapia per il sequenziamento unicellulare.

Preparazione della sospensione unicellulare dall'intestino della tilapia del Nilo per il sequenziamento a singola cellula

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Questo protocollo fornisce un riferimento affidabile per la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dall'intestino di tilapia del Nilo per facilitare gli studi a livello di singola cellula nelle specie ittiche di acquacoltura. La tecnologia è altamente efficiente e può essere implementata nella maggior parte delle condizioni di laboratorio. Riduce la necessità di ulteriori prove per preparare sospensioni monocellulari per le specie ittiche di acquacoltura.Inizia sciacquando il pesce tilapia del Nilo di sei mesi in acqua sterile ben aerata per 15 minuti per lavare via i batteri legati liberamente dalla superficie. Per preparare il reagente di dissociazione cellulare enzimatica, diluire la collagenasi dispasi in PBS ad una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro. Mescolare il 95% del volume della soluzione enzimatica preparata e il 5% del volume di FBS.Quindi pre-raffreddare la centrifuga a quattro gradi Celsius prima dell'uso. Per la dissezione dei tessuti, posizionare il pesce eutanasia sul ghiaccio e raccogliere da tre a quattro centimetri della sezione centrale dell'intestino. Eliminare il grasso e il mesentere usando una pinza.Rimuovere il grasso attaccato alla superficie intestinale e la mucosa chiara elastica e malleabile. Risciacquare delicatamente il frammento di intestino con PBS ghiacciato sterile usando una siringa per lavare via il contenuto intestinale e il muco. Dopo diversi lavaggi, sezionare il frammento in piccoli pezzi e trasferirli in un tubo da 1,5 millilitri contenente un millilitro di PBS ghiacciato.Centrifugare la miscela a 300 x g in quattro gradi Celsius per cinque minuti. E sostituire il surnatante con un millilitro di ghiaccio freddo 0,08% BSA-DPBS. Utilizzando una pipetta di vetro aspirare delicatamente per risospendere i frammenti di tessuto.Dopo aver lavato i pezzi ancora una volta, rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro del reagente di dissociazione enzimatica preparato. Mescolare anche cinque microlitri di inibitore dell'RNA con il reagente di dissociazione per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Posizionare il tubo a 37 gradi Celsius a bagnomaria temperato e capovolgere manualmente il tubo ogni cinque minuti durante il tempo di incubazione da 30 a 60 minuti.Una volta che i tubi sono stati ruotati, rimuovere il reagente di dissociazione cellulare enzimatica utilizzando punte a foro largo. Aggiungere un millilitro di ghiaccio freddo 0,08% BSA-DPBS e pipettare delicatamente le cellule su e giù per prevenire la rottura cellulare. Dopo la centratura e la risospensione delle celle ancora una volta, posizionare il filtro cellulare da 40 micrometri pre-bagnato con 0,08% BSA-DPBS su un tubo conico da 50 millilitri.Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro. Picchiettare il colino, quindi sciacquarlo con 200 microlitri DPBS e raccogliere la sospensione sul fondo del tubo. Dopo aver trasferito la sospensione in un tubo da 1,5 millilitri, aggiungere cinque microlitri di DNA e incubare la sospensione per 15 minuti a 15-20 gradi Celsius.Una volta centrifugato, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 400 microlitri di DPBS ghiacciato senza ioni di calcio e magnesio. Quindi pipettare delicatamente su e giù con punte larghe per mescolare le cellule e ripetere questo processo ancora una volta. Per la colorazione, mescolare la sospensione cellulare in una soluzione di blu tripano allo 0,4% in un rapporto uguale e incubare per tre minuti a temperatura ambiente.Quindi aggiungere 10 microlitri della miscela sul vetrino. Contare le cellule vitali e morte al microscopio in tre campi e calcolare la percentuale di vitalità cellulare. Sono state confrontate le efficienze di dissociazione di diversi enzimi comunemente usati.È stato verificato che la miscela di collagenasi dispasi ha un migliore effetto di dissociazione rispetto alla collagenasi dispasi o alla tripsina da sola e a diverse altre miscele enzimatiche. L'esame microscopico ha mostrato che le cellule intestinali avevano un'elevata vitalità e si disperdevano come singole cellule. La maggior parte delle cellule erano vitali, mentre alcune erano morte a causa della membrana cellulare permeablizzata.Prestare attenzione al tipo di PBS utilizzato. La soluzione di digestione enzimatica non può essere utilizzata con PBS privo di calcio/magnesio poiché l'enzima richiede ioni calcio/magnesio per funzionare efficacemente. La procedura facilita gli studi a livello di singola cellula nelle specie ittiche di acquacoltura fornendo un valido riferimento per lo sviluppo di protocolli di dissociazione cellulare delle specie ittiche di acquacoltura.

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