Name: single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00
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著者らは、中国海南省自然科学財団(NO.320QN211)および広東省水生動物疾病管理および健康文化研究基金プログラム(NO. PBEA2021ZD01)からの支援に感謝したい。

この研究中のすべての動物プロトコルは、海南大学施設動物管理および使用委員会によって承認されました(プロトコル番号:HNUAUCC-2022-00063;承認日:2022-03-03)。この実験で使用した機器と消耗品のリストは、 材料表にあります。現在のプロトコルの概要を 図1に示します。
1.魚の準備
<ol><li>信頼できる情報源から平均体重100 g?...

このプロトコルは、ナイルティラピア腸の高品質の単一細胞懸濁液の調製を記載しています。解離する前に、特に脂肪の多い肉食性の魚の腸では、腸からの脂肪と腸間膜の除去が必要です。腸の内容物を洗い流すために硬い掻き取りの代わりに注射器を使用すると、細胞への機械的損傷が減少します。細胞の生存率を確保するためには、組織解剖およびすすぎステップの温度を20°C以下に維?...

細胞は生物の基本単位です。バルク組織研究と比較して、単一細胞レベルの研究は細胞の不均一性を反映し、より高解像度の情報を提供することができます1。近年、研究者は、哺乳類、ゼブラフィッシュ、およびその他のモデル生物の単一細胞レベルでのゲノム、トランスクリプトーム、エピゲノム、またはマルチオミクス研究にシングルセルシーケンシング技術を適用し、大きなブレークスルーを報告しています2,3,4,5,6,7 .ほとんどの研究はモデル生物に焦点を当てていますが、経済的な魚種におけるシングルセルシーケンシングのための参照プロトコルまたは市販の解離キットはほとんどなく、水産養殖研究におけるシングルセルシーケンシングの適用が制限されています。したがって、高い細胞生存率と核酸完全性を備えた高品質の単一細胞懸濁液を生成する組織解離プロトコルの開発が重要です。
適切な酵素または酵素の組み合わせで組織解離プロトコルを最適化して、最小限の損傷で十分な生細胞を得ることが不可欠です。組織解離に最も効果的な酵素は、組織の種類によって異なります。哺乳類では、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシン、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、リベラーゼ、アキュターゼ、およびTrypLE8,9を含む、哺乳類の固形組織用の単一細胞懸濁液を調製するためにいくつかの酵素が使用されてきました。機械的破壊と組み合わせたトリプシン消化は、魚の細胞培養のために組織を解離するために一般的に使用されてきました10、11、12、13、14。トリプシンはまた、ラット腸15およびゼブラフィッシュ鰓組織16における組織解離のための消化カクテルに使用または添加されている。ただし、いくつかの理由から、トリプシンはシングルセルシーケンシングに最適なオプションではありません。トリプシン単独では通常、組織解離には効果がありません。さらに、トリプシンはDNA鎖切断17,18およびRNA分解19を誘導する。
パパインは、細胞間のタイトジャンクションを構成するタンパク質を分解します。哺乳類の神経および平滑筋細胞において、パパインは他のプロテアーゼよりも効率的で破壊が少ない20,21。しかしながら、トリプシンと同様に、パパインは酵素消化中に起こる細胞溶解のために細胞の遊離DNA誘導凝集をもたらす9。エラスターゼは、皮膚、肺、靭帯、腱、血管組織に通常見られるエラスチンを分解します22。肺組織8を解離させるために、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、またはトリプシンと組み合わせて使用 されることがよくあります。ヒアルロニダーゼはヒアルロン酸のグリコシド結合を切断し、さまざまな結合組織や皮膚の細胞外マトリックスの消化に寄与します9,23。
一般に、コラゲナーゼとディスパーゼは細胞外マトリックス分解のための良い選択肢です。それらは、ヒト、マウス、およびゼブラフィッシュの腸の解離に使用されています24、25、26、27。コラゲナーゼはコラーゲン中のペプチド結合を破壊し、細胞外マトリックスの消化を促進し、細胞を懸濁液に放出するため、コラゲナーゼは、肝臓28,29、脾臓30、膵臓31、および腸25を含むヒトおよびマウスの固体組織の解離によく使用されます.ディスパーゼは、非極性アミノ酸残基のN末端ペプチド結合を加水分解するプロテアーゼであり、コラゲナーゼよりもマイルドです。フィブロネクチン、IV型コラーゲン、および程度は低いがI型コラーゲンなどの細胞外マトリックス成分を、細胞間接合部に影響を与えることなく切断します。ディスパーゼは、腸25,32、脳33、肝臓34などの組織解離のために、別々にまたは他の酵素と共に使用される。さらに、リベラーゼ、アキュターゼ、trypLEなどの市販の消化カクテルも、特に皮膚、肝臓、腎臓の固形組織解離の優れた代替品です8,9。
ナイルティラピア(オレオクロミスニロティカス)は、スズキ目シクリッド科に属します。熱帯および亜熱帯地域で最も養殖されている淡水魚種の1つであり、2022年の年間生産量は450万トンです35。これは、十分に注釈が付けられたゲノムを持つ、最もよく研究されている養殖魚種の1つです。ナイルティラピアは、その短い世代時間、飼育の容易さ、および幅広い飼育環境への適応性により、養殖魚種にとって理想的な研究モデルです。腸は栄養の消化吸収、代謝、粘膜免疫の器官であるため、研究上の大きな関心を集めています。腸は微生物集団の生息地であり、必須の免疫組織である36。マクロファージ、B細胞、顆粒球、T細胞など、さまざまな種類の免疫細胞が存在するため、免疫学的に活性です。
現在の研究では、養殖魚種の単一細胞レベルの研究を容易にするために、ナイルティラピア腸から高品質の単一細胞懸濁液を調製するためのプロトコルを開発しました。これらの組織特異的酵素の特性と予備作業によると、コラゲナーゼ/ディスパーゼはティラピア腸組織の解離に適しています。単一細胞懸濁液を調製する際に考慮すべき最後の酵素タイプはDNase-Iであり、これはアポトーシス経路9を開始せずに酵素消化中に死細胞溶解によって放出される遊離DNAを分解することによって細胞凝集を防ぎ、生 細胞収量を増加させる36。さらに、ウシ血清アルブミン(BSA)を洗浄バッファーに添加して、細胞の凝集を減らし、細胞の生存率を向上させます。いくつかの試薬会社は、BSAを酵素安定剤として説明しています。PBS(リン酸緩衝生理食塩水)への0.04%-1%BSAの添加は、副作用のないシングルセルシーケンシング懸濁液を調製するための洗浄液の開発に使用されています38。低比率のBSAを添加することで、細胞の生存率を維持し、細胞溶解による遊離DNAによる細胞の凝集を回避できる可能性があります。このプロトコルは、他の養殖魚種の腸からの細胞解離プロトコルを開発するための貴重なリファレンスも提供できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-&#956;m Sterile Filter</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>It is used to filter and sterilize the enzyme solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>F8200</td>
			<td>Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0098</td>
			<td>Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1&#215; DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A004202</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638-001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4818</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td>DNase I helps reduce cell clumping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>E607009-0500</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600438</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted&#160;Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>qTOWER3G</td>
			<td>It is used to examine cell viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile tilpia (Oreochromis niloticus)</td>
			<td>ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>It is used to spin down the tissue and cell petet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td>Inhibit RNase activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B644201-0050</td>
			<td>It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>For fish euthanasia.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C0040</td>
			<td>It is used for staining dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing

ナイルティラピアは、世界で最も一般的に養殖されている淡水魚種の1つであり、養殖魚の研究に広く使用されている研究モデルです。高品質のシングルセル懸濁液の調製は、シングルセルRNAやゲノムシーケンシングなどのシングルセルレベルの研究に不可欠です。ただし、養殖魚種、特にティラピアの腸については、すぐに使用できるプロトコルはありません。有効な解離酵素は、組織の種類によって異なります。したがって、適切な酵素または酵素の組み合わせを選択して組織解離プロトコルを最適化し、最小限の損傷で十分な生細胞を得ることが不可欠である。この研究は、ナイルティラピア腸から高品質の単一細胞懸濁液を調製するための最適化されたプロトコルを示しています コラゲナーゼ/ディスパーゼの酵素の組み合わせ。この組み合わせは、ウシ血清アルブミンとDNaseを利用して解離に非常に効果的であり、消化後の細胞凝集を低減します。細胞出力は、90%の細胞生存率と高い細胞濃度で、シングルセルシーケンシングの要件を満たしています。このプロトコルは、他の魚種の腸から単細胞懸濁液を調製するように変更することもできる。この研究は、効率的な参照プロトコルを提供し、養殖魚種の単一細胞懸濁液の調製における追加の試験の必要性を減らします。

このプロトコルでは、シングルセルシーケンシング用のナイルティラピア腸の高品質のシングルセル懸濁液の調製について説明します(図1)。この研究は、コラゲナーゼ/ディスパーゼミックスが良好な解離効果を有し、腸組織に対して穏やかであることを示しています。最適な消化酵素の選択は、高品質の単一細胞懸濁液を調製するために不可欠です。予備作業では、一...

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Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

ここでは、シングルセルシーケンシングのためのティラピア腸の高品質のシングルセル懸濁液の調製を実証します。

シングルセルシーケンシングのためのナイルティラピア腸からのシングルセル懸濁液調製(英語)

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

このプロトコルは、ナイルティラピア腸から高品質のシングルセル懸濁液を調製し、養殖魚種のシングルセルレベルの研究を促進するための信頼できるリファレンスを提供します。この技術は非常に効率的で、ほとんどの実験室条件で実装できます。これにより、水産養殖魚種の単一細胞懸濁液を調製するための追加の試験の必要性が減少します。生後6か月のナイルティラピアの魚をよく通気した滅菌水で15分間すすぎ、表面から緩く結合したバクテリアを洗い流すことから始めます。酵素細胞解離試薬を調製するには、コラゲナーゼディスパーゼをPBSで1ミリリットルあたり1ミリグラムの最終濃度に希釈します。調製した酵素溶液の95%容量とFBSの5%容量を混合します。次に、使用前に遠心分離機を摂氏4度に予冷しました。組織解剖のために、安楽死させた魚を氷の上に置き、腸の中央部の3〜4センチメートルを収集します。鉗子を使用して脂肪と腸間膜を切除します。腸の表面に付着した脂肪と弾力性と順応性のある透明な粘膜を取り除きます。注射器を使用して滅菌氷冷PBSで腸の断片をそっとすすぎ、腸の内容物と粘液を洗い流します。数回洗浄した後、断片を小片に解剖し、1ミリリットルの氷冷PBSを含む1.5ミリリットルのチューブに移します。混合物を300 x gで摂氏4度で5分間遠心分離します。そして、上清を1ミリリットルの氷冷0.08%BSA-DPBSと交換します。ガラスピペットを使用して、組織片を再懸濁するために穏やかに吸引する。小片をもう一度洗浄した後、上清を取り除き、調製した酵素解離試薬1ミリリットルを加える。また、5マイクロリットルのRNA阻害剤をシングルセルRNAシーケンシング用の解離試薬と混合します。チューブを摂氏37度の強化水浴に置き、30〜60分のインキュベーション時間の間、5分ごとにチューブを手動で反転させます。チューブを回転させたら、ワイドボアチップを使用して酵素細胞解離試薬を除去します。氷冷した0.08%BSA-DPBSを1ミリリットル加え、細胞破壊を防ぐために細胞を静かに上下にピペットで移します。遠心分離し、細胞をもう一度再懸濁した後、0.08%BSA-DPBSで事前に湿潤させた40マイクロメートルのセルストレーナーを50ミリリットルの円錐管に置きます。細胞懸濁液をストレーナーに通します。ストレーナーをタップしてから、200マイクロリットルのDPBSですすぎ、チューブの底に懸濁液を集めます。懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移した後、5マイクロリットルのDNAを加え、懸濁液を摂氏15〜20度で15分間インキュベートします。遠心分離したら、上清を除去し、カルシウムイオンとマグネシウムイオンを含まない400マイクロリットルの氷冷DPBSに細胞ペレットを再懸濁します。次に、ワイドボアチップでゆっくりと上下にピペットで細胞を混合し、このプロセスをもう一度繰り返します。染色のために、細胞懸濁液を0.4%トリパンブルー溶液に等比率で混合し、室温で3分間インキュベートします。次に、スライドガラス上に10マイクロリットルの混合物を加える。顕微鏡下で生細胞と死細胞を3つのフィールドでカウントし、細胞生存率を計算します。一般的に使用されるいくつかの酵素の解離効率を比較した。コラゲナーゼディスパーゼミックスは、コラゲナーゼディスパーゼまたはトリプシン単独および他のいくつかの酵素混合物よりも優れた解離効果を有することが確認された。顕微鏡検査では、腸細胞は生存率が高く、単一細胞として分散していることが示されました。ほとんどの細胞は生存可能でしたが、細胞膜が透過したために死に染色された細胞もいくつかありました。使用するPBSの種類に注意してください。酵素は効果的に機能するためにカルシウム/マグネシウムイオンを必要とするため、酵素はカルシウム/マグネシウムを含まないPBSで酵素消化溶液を使用することはできません。この手順は、養殖魚種の単一細胞レベルの研究を容易にし、養殖魚種の細胞解離プロトコルを開発するための貴重な参考資料を提供します。

Research

JoVE Journal

Biology

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