Name: single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing at JoVE.com

저자는 중국 하이난성 자연과학재단(NO. 320QN211)과 중국 광둥성 수생동물 질병 통제 및 건강한 문화 핵심 연구소의 연구 기금 프로그램(NO. PBEA2021ZD01)의 지원에 감사를 표합니다.

이 연구 동안 모든 동물 프로토콜은 하이난 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호: HNUAUCC-2022-00063; 승인일: 2022-03-03). 이 실험에 사용된 장비 및 소모품 목록은 재료 표에서 찾을 수 있습니다. 현재 프로토콜에 대한 요약은 그림 1에 나와 있습니다.
1. 생선 준비
<ol><li>신뢰할 수 있는 출처에서 평균 체중 100g의 6개?...

이 프로토콜은 나일 틸라피아 장의 고품질 단일 세포 현탁액의 제조를 설명합니다. 해리하기 전에 장에서 지방과 장간막을 제거하는 것이 필요하며, 특히 지방이 많은 육식성 생선 내장의 경우 더욱 그렇습니다. 장 내용물을 씻어 내기 위해 딱딱하게 긁는 대신 주사기를 사용하면 세포의 기계적 손상을 줄일 수 있습니다. 세포 생존율을 보장하기 위해서는 조직 해부 및 헹굼 단계를 위해 온도를 20...

세포는 유기체의 기본 단위입니다. 벌크 조직 연구와 비교했을 때, 단일 세포 수준 연구는 세포 이질성을 반영하고 더 높은 분해능 정보를 제공할 수 있습니다1. 최근 몇 년 동안 연구자들은 포유류, 제브라피쉬 및 기타 모델 유기체의 단일 세포 수준에서 게놈, 전사체, 후성유전체 또는 다중 오믹 연구를 위한 단일 세포 시퀀싱 기술을 적용했으며 큰 돌파구를 보고했습니다 2,3,4,5,6,7 . 대부분의 연구가 모델 유기체에 초점을 맞추었지만, 경제적인 어종에서 단일 세포 시퀀싱을 위한 참조 프로토콜이나 상업적 해리 키트가 거의 없기 때문에 양식 연구에서 단일 세포 시퀀싱의 적용이 제한됩니다. 따라서 높은 세포 생존율과 핵산 무결성을 가진 고품질 단일 세포 현탁액을 생산하는 조직 해리 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다.
손상을 최소화하면서 충분한 생존 가능한 세포를 얻기 위해 적절한 효소 또는 효소 조합으로 조직 해리 프로토콜을 최적화하는 것이 필수적입니다. 조직 해리에 가장 효과적인 효소는 조직 유형에 따라 다릅니다. 포유류에서 콜라게나제, 디스파스, 트립신, 파파인, 엘라스타제, 히알루로니다제, 리베라제, 아쿠타제 및 트립LE 8,9를 포함한 여러 효소가 포유류 고형 조직을 위한 단일 세포 현탁액을 제조하는 데 사용되었습니다. 기계적 파괴와 결합된 트립신 소화는 일반적으로 어류의 세포 배양을 위해 조직을 해리하는 데 사용되어 왔다10,11,12,13,14. 트립신은 또한 쥐의 장(15)과 제브라피쉬 아가미 조직(16)에서 조직 해리를 위해 소화 칵테일에 사용되거나 첨가되었다. 그러나 여러 가지 이유로 트립신은 단일 세포 시퀀싱에 가장 적합한 옵션이 아닙니다. 트립신 단독은 일반적으로 조직 해리에 효과적이지 않습니다. 또한, 트립신은 DNA 가닥 파괴 17,18 및 RNA 분해19를 유도한다.
파파인은 세포 사이의 긴밀한 접합부를 구성하는 단백질을 분해합니다. 포유류의 신경 및 평활근 세포에서 파파인은 다른 프로테아제보다 더 효율적이고 덜 파괴적이다20,21. 그러나 트립신과 마찬가지로 파파인은 효소 소화 과정에서 발생하는 세포 용해로 인해 유리 DNA에 의한 세포 응집을 일으킨다9. 엘라스타제는 엘라스틴을 분해하는데, 엘라스틴은 피부, 폐, 인대, 힘줄, 혈관 조직에서 전형적으로 발견된다22. 폐 조직을 해리하기 위해 콜라게나제(collagenase), 디스파스(dispase) 또는 트립신(trypsin)과 함께 자주 사용된다8. 히알루로니다아제는 히알루로난의 글리코시드 결합을 절단하여 다양한 결합 조직과 피부에서 세포외 기질의 소화에 기여합니다 9,23.
일반적으로 콜라게나제와 디스파제는 세포외 기질 분해에 좋은 옵션입니다. 그들은 인간, 마우스 및 제브라 피쉬 내장24,25,26,27의 해리에 사용되었습니다. 콜라게나제는 콜라겐에서 펩타이드 결합을 파괴하고, 세포외 기질의 소화를 촉진하며, 세포를 현탁액으로 방출하므로, 콜라게나제는 간 28,29, 비장30, 췌장31 및 장25를 포함하여 인간 및 마우스 고형 조직 해리에 자주 사용된다 . Dispaase는 비극성 아미노산 잔기의 N-말단 펩타이드 결합을 가수분해하는 프로테아제이며 콜라게나제보다 온화합니다. 그것은 세포-세포 접합에 영향을 미치지 않고 피브로넥틴, 유형 IV 콜라겐 및 더 적은 정도로 유형 I 콜라겐과 같은 세포외 기질 성분을 절단합니다. Dispase는 장25,32, 뇌33, 간 34 등과 같은 조직 해리를 위해 별도로 또는 다른 효소와 함께 사용됩니다. 또한, 리베라제(liberase), 아쿠타제(accutase), 트립레(trypLE)를 포함한 시판되는 소화 칵테일은 특히 피부, 간, 신장에 대한 고형 조직 해리를 위한 좋은 대안이다 8,9.
나일 틸라피아 (Oreochromis niloticus)는 Perciformes 주문의 Cichlidae 계통에 속한다. 열대 및 아열대 지역에서 가장 많이 양식된 민물고기 종 중 하나로 2022년 연간 생산량이 450만 톤입니다35. 주석이 잘 달린 게놈을 가진 가장 잘 연구된 양식 어종 중 하나입니다. 나일 틸라피아는 짧은 생성 시간, 사육 용이성 및 광범위한 사육 환경에 대한 적응성으로 인해 양식 어종에 대한 이상적인 연구 모델입니다. 장은 영양 소화 및 흡수, 신진 대사 및 점막 면역의 기관이기 때문에 큰 연구 관심을 받고 있습니다. 장은 미생물 개체군의 서식지이며 필수 면역 조직입니다36. 대식세포, B 세포, 과립구 및 T 세포를 포함한 수많은 면역 세포 유형의 존재로 인해 면역학적으로 활성입니다.
현재 연구에서 우리는 양식 어종에 대한 단일 세포 수준 연구를 용이하게 하기 위해 나일 틸라피아 장에서 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 조직 특이적 효소의 특성과 예비 연구에 따르면 콜라게나제/디스파아제는 틸라피아 장 조직을 해리하는 데 적합합니다. 단세포 현탁액을 제조할 때 고려해야 할 마지막 효소 유형은 DNase-I이며, 이는 세포사멸 경로를 시작하지 않고 효소 소화 동안 죽은 세포 용해를 통해 방출된 유리 DNA를 분해하여 세포 응집을 방지하고9 살아있는 세포 수율을 증가시킨다36. 또한 소 혈청 알부민(BSA)을 세척 완충액에 첨가하여 세포 응집을 줄이고 세포 생존율을 향상시킵니다. 몇몇 시약 회사는 BSA를 효소 안정제로 설명합니다. PBS(phosphate-buffered saline)에 0.04%-1% BSA를 첨가하여 부작용 없이 단일 세포 시퀀싱 현탁액을 제조하기 위한 세척 용액을 개발하는 데 사용되었습니다38. 낮은 비율의 BSA를 첨가하면 세포 생존율을 유지하고 세포 용해로 인한 세포의 유리 DNA 유도 응집을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다른 양식 어종의 장에서 세포 해리 프로토콜을 개발하는 데 유용한 참고 자료를 제공할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-&#956;m Sterile Filter</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>It is used to filter and sterilize the enzyme solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>F8200</td>
			<td>Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0098</td>
			<td>Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1&#215; DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A004202</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638-001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4818</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td>DNase I helps reduce cell clumping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>E607009-0500</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600438</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted&#160;Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>qTOWER3G</td>
			<td>It is used to examine cell viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile tilpia (Oreochromis niloticus)</td>
			<td>ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>It is used to spin down the tissue and cell petet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td>Inhibit RNase activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B644201-0050</td>
			<td>It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>For fish euthanasia.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C0040</td>
			<td>It is used for staining dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing

나일 틸라피아는 전 세계적으로 가장 일반적으로 양식되는 민물고기 종 중 하나이며 양식 어류 연구에 널리 사용되는 연구 모델입니다. 고품질 단일 세포 현탁액의 준비는 단일 세포 RNA 또는 게놈 시퀀싱과 같은 단일 세포 수준 연구에 필수적입니다. 그러나 양식 어종, 특히 틸라피아의 장에 대해 즉시 사용할 수 있는 프로토콜은 없습니다. 효과적인 해리 효소는 조직 유형에 따라 다릅니다. 그러므로, 최소한의 손상으로 충분한 생존 세포를 얻기 위해 적절한 효소 또는 효소 조합을 선택함으로써 조직 해리 프로토콜을 최적화하는 것이 필수적이다. 이 연구는 콜라게나제/디스파스의 효소 조합을 사용하여 나일 틸라피아 장에서 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 최적화된 프로토콜을 보여줍니다. 이 조합은 소화 후 세포 응집을 감소시키기 위해 소 혈청 알부민 및 DNase를 활용하여 해리에 매우 효과적입니다. 세포 출력은 90%의 세포 생존율과 높은 세포 농도로 단일 세포 시퀀싱에 대한 요구 사항을 충족합니다. 이 프로토콜은 또한 다른 어종의 내장으로부터 단세포 현탁액을 제조하기 위해 수정될 수 있다. 이 연구는 효율적인 참조 프로토콜을 제공하고 양식 어종에 대한 단일 세포 현탁액 준비에 대한 추가 시험의 필요성을 줄입니다.

이 프로토콜은 단일 세포 시퀀싱을 위한 나일 틸라피아 장의 고품질 단일 세포 현탁액의 준비를 설명합니다(그림 1). 이 연구는 콜라게나제/디스파아제 혼합물이 좋은 해리 효과를 가지며 장 조직에 경미하다는 것을 보여줍니다. 최적의 소화 효소의 선택은 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하는 데 필수적입니다. 예비 연구에서는 일반적으로 사용되는 여러 효소의 해리 효율?...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing at JoVE.com

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

여기에서 우리는 단일 세포 시퀀싱을 위한 틸라피아 장의 고품질 단일 세포 현탁액의 준비를 보여줍니다.

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

이 프로토콜은 양식 어종에서 단일 세포 수준 연구를 용이하게 하기 위해 나일 틸라피아 장에서 고품질 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 신뢰할 수 있는 참조를 제공합니다. 이 기술은 매우 효율적이며 대부분의 실험실 조건에서 구현할 수 있습니다. 양식 어종에 대한 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 추가 시험의 필요성을 줄입니다.6개월 된 나일 틸라피아 물고기를 잘 통기된 멸균수에서 15분 동안 헹구어 표면에서 느슨하게 결합된 박테리아를 씻어내는 것으로 시작합니다. 효소 세포 해리 시약을 제조하기 위해, PBS 중의 콜라게나제 디파아제를 밀리리터당 1밀리그램의 최종 농도로 희석한다. 준비된 효소 용액의 95% 부피와 FBS의 5% 부피를 혼합합니다.그런 다음 사용하기 전에 원심 분리기를 섭씨 4도까지 미리 냉각하십시오. 조직 해부를 위해 안락사 된 물고기를 얼음 위에 놓고 내장 중간 부분의 3-4 센티미터를 수집합니다. 집게를 사용하여 지방과 장간막을 절제하십시오.장 표면에 붙어있는 지방과 탄력 있고 가단성 있는 맑은 점막을 제거합니다. 주사기를 사용하여 멸균 된 얼음처럼 차가운 PBS로 장 조각을 부드럽게 헹구어 장 내용물과 점액을 씻어냅니다. 여러 번 세척한 후 조각을 작은 조각으로 해부하고 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다.혼합물을 섭씨 4도에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그리고 상청액을 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 0.08% BSA-DPBS로 교체합니다. 유리 피펫을 사용하여 부드럽게 흡인하여 조직 조각을 재현탁합니다.조각을 한 번 더 세척 한 후, 상청액을 제거하고 준비된 효소 해리 시약 1 밀리리터를 첨가한다. 또한 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위해 5마이크로리터의 RNA 억제제를 해리 시약과 혼합합니다. 튜브를 섭씨 37도의 강화 수조에 놓고 30-60분의 배양 시간 동안 5분마다 튜브를 수동으로 뒤집습니다.튜브가 회전되면 광경 팁을 사용하여 효소 세포 해리 시약을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 0.08% BSA-DPBS 1밀리리터를 넣고 세포 파괴를 방지하기 위해 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다. 세포를 한 번 더 원심 주입하고 재현탁한 후 0.08% BSA-DPBS로 미리 적신 40마이크로미터 셀 스트레이너를 50밀리리터 원뿔형 튜브에 놓습니다.스트레이너를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다. 스트레이너를 두드린 다음 200마이크로리터 DPBS로 헹구고 튜브 바닥에 서스펜션을 모으십시오. 현탁액을 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴 후, 5 마이크로 리터의 DNA를 첨가하고 섭씨 15도에서 20 분 동안 현탁액을 배양한다.원심분리가 완료되면 상층액을 제거하고 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 400마이크로리터의 얼음처럼 차가운 DPBS에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 넓은 구멍 팁으로 위아래로 부드럽게 피펫하여 세포를 혼합하고 이 과정을 한 번 더 반복합니다. 염색을 위해 세포 현탁액을 0.4% 트리판 블루 용액에 동일한 비율로 혼합하고 실온에서 3분 동안 배양합니다.그런 다음 유리 슬라이드에 혼합물 10 마이크로 리터를 첨가하십시오. 현미경으로 생존 세포와 죽은 세포를 세 가지 필드로 계산하고 세포 생존율을 계산합니다.tage. 일반적으로 사용되는 몇 가지 효소의 해리 효율을 비교했습니다.콜라게나제 디스파아제 혼합물은 콜라게나제 디스파제 또는 트립신 단독 및 기타 여러 효소 혼합물보다 더 나은 해리 효과를 갖는 것으로 확인되었습니다. 현미경 검사 결과 장 세포는 생존력이 높고 단일 세포로 분산되어 있는 것으로 나타났습니다. 대부분의 세포는 생존 가능했지만 일부는 투과된 세포막 때문에 염색되어 죽었습니다.사용되는 PBS의 유형에주의하십시오. 효소 분해 용액은 효소가 효과적으로 기능하기 위해 칼슘/마그네슘 이온이 필요하기 때문에 칼슘/마그네슘이 없는 PBS와 함께 사용할 수 없습니다. 이 절차는 양식 어종에 대한 단일 세포 수준 연구를 용이하게 하여 양식 어종의 세포 해리 프로토콜을 개발하는 데 유용한 참고 자료를 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

gentleMACS Dissociator과 마우스 비장에서 단일 셀 Suspensions의 준비

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

연구

생물학

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

gentleMACS Dissociator를 사용하여 마우스 폐 조직에서 단일 셀 Suspensions의 표준화 준비

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

마우스 콘 Photoreceptors에서 단일 셀 석션 레코딩

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

성인 마우스 Cardiomyocytes의 단세포 Transcriptional 프로파일

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

단일 세포 다중오믹스를 위한 급속 동결 간 조직으로부터 핵 분리

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

식물 세포 유형의 분리 및 전사체 분석

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Fluorescence-Activated Single-Cell Sorting of Human Mesenchymal Stem Cells

Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth

Importance of Single Cell Sorting in Isolating Purified Populations of Mesenchymal Stem Cells (Video) | JoVE

인간 박리 낙엽 치아에서 면역 표현형 중간엽 줄기 세포의 단일 세포 분류

The mesenchymal stem cells (MSCs) of an organism possess an extraordinary capacity to differentiate into multiple lineages of adult cells in the body and ...

Two-Step Cell Digestion of Mouse Carotid Artery

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy (Video) | JoVE

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...