Name: single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing at JoVE.com

Os autores desejam agradecer o apoio da Fundação Provincial de Ciências Naturais de Hainan da China (NO. 320QN211) e do Programa de Fundo de Pesquisa do Laboratório Chave da Província de Guangdong de Controle de Doenças de Animais Aquáticos e Cultura Saudável da China (NO. PBEA2021ZD01).

Todos os protocolos em animais durante este estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Hainan (número do protocolo: HNUAUCC-2022-00063; Data de aprovação: 03/03/2022). Uma lista dos equipamentos e insumos utilizados neste experimento pode ser encontrada na Tabela de Materiais. Um resumo do protocolo atual é ilustrado na Figura 1.
1. Preparo do peixe
<ol><li>Obter tilápi...

Este protocolo descreve a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia do Nilo. Antes da dissociação, a remoção de gordura e mesentério do intestino é necessária, particularmente para intestinos de peixes carnívoros com muita gordura. Usar uma seringa em vez de raspagem dura para lavar o conteúdo intestinal reduz os danos mecânicos às células. Para garantir a viabilidade celular, também é essencial manter a temperatura em 20 °C ou abaixo para as etapas de dissecção...

As células são as unidades fundamentais dos organismos. Comparados a estudos de tecidos volumosos, estudos em nível de célula única podem refletir a heterogeneidade celular e fornecer informações de maior resolução1. Nos últimos anos, pesquisadores têm aplicado tecnologias de sequenciamento unicelular para estudos genômicos, transcriptomas, epigenomas ou multi-ômicos em nível unicelular em mamíferos, peixes-zebra e outros organismos modelo e relatado grandes avanços 2,3,4,5,6,7 . Embora a maioria dos estudos tenha se concentrado em organismos-modelo, há poucos protocolos de referência ou kits comerciais de dissociação para sequenciamento unicelular em espécies econômicas de peixes, o que limita a aplicação do sequenciamento unicelular em pesquisas aquícolas. Portanto, o desenvolvimento de protocolos de dissociação tecidual que produzam suspensões unicelulares de alta qualidade com alta viabilidade celular e integridade de ácidos nucleicos é crucial.
A otimização do protocolo de dissociação tecidual com a combinação enzimática ou enzimática apropriada para obter células viáveis suficientes com o mínimo de dano é essencial. A enzima mais eficaz para a dissociação tecidual varia de acordo com o tipo de tecido. Em mamíferos, várias enzimas têm sido utilizadas para preparar suspensões unicelulares para tecidos sólidos de mamíferos, incluindo colagenase, dispase, tripsina, papaína, elastase, hialuronidase, liberase, accutase e tripLE 8,9. A digestão de tripsina combinada com ruptura mecânica tem sido comumente utilizada para dissociar tecidos para cultura celular em peixes 10,11,12,13,14. A tripsina também tem sido usada ou adicionada ao coquetel de digestão para dissociação tecidual no intestino de ratos15 e tecido branquial de peixe-zebra16. No entanto, por várias razões, a tripsina não é a melhor opção para o sequenciamento unicelular. A tripsina isolada é geralmente ineficaz para a dissociação tecidual. Adicionalmente, a tripsina induz quebras de fitas de DNA 17,18 e degradação de RNA19.
A papaína degrada as proteínas que compõem as tight junctions entre as células. Em células nervosas e musculares lisas de mamíferos, a papaína é mais eficiente e menos destrutiva que outras proteases20,21. Entretanto, assim como a tripsina, a papaína resulta na agregação celular induzida pelo DNA livre devido à lise celular que ocorre durante a digestão enzimática9. A elastase decompõe a elastina, que é tipicamente encontrada na pele, pulmões, ligamentos, tendões e tecidos vasculares22. É frequentemente usado em combinação com colagenase, dispase ou tripsina para dissociar o tecido pulmonar8. A hialuronidase cliva as ligações glicosídicas do hialuronano, contribuindo para a digestão da matriz extracelular em vários tecidos conjuntivos e pele 9,23.
Em geral, colagenase e dispase são boas opções para a quebra da matriz extracelular. Eles têm sido utilizados na dissociação dos intestinos de humanos, camundongos e peixes-zebra24,25,26,27. A colagenase destrói a ligação peptídica no colágeno, promove a digestão da matriz extracelular e libera as células em suspensão, e, assim, a colagenase é frequentemente utilizada para dissociação de tecidos sólidos humanos e de camundongos, inclusive para o fígado 28,29, baço30, pâncreas31 e intestino 25. Dispase é uma protease que hidrolisa as ligações peptídicas N-terminais de resíduos de aminoácidos apolares e é mais suave que a colagenase. Cliva os componentes da matriz extracelular, como fibronectina, colágeno tipo IV e, em menor grau, colágeno tipo I, sem afetar as junções célula-célula. Dispase é usado separadamente ou com outras enzimas para dissociação tecidual, como intestino25,32, cérebro33, fígado34, etc. Além disso, coquetéis de digestão comercialmente disponíveis, incluindo liberase, accutase e triple, também são boas alternativas para a dissociação de tecidos sólidos, especialmente para pele, fígado e rins 8,9.
A tilápia-do-nilo (Oreochromis niloticus) pertence à família Cichlidae da ordem Perciformes. É uma das espécies de peixes de água doce mais cultivadas em áreas tropicais e subtropicais, com uma produção anual de 4,5 milhões de toneladas em 202235. É uma das espécies de peixes de aquicultura mais bem estudadas com um genoma bem anotado. A tilápia-do-nilo é um modelo de pesquisa ideal para espécies de peixes aquícolas devido ao seu curto tempo de geração, facilidade de criação e adaptabilidade a uma ampla gama de ambientes de criação. O intestino é de grande interesse de pesquisa, pois é o órgão da digestão e absorção da nutrição, metabolismo e imunidade das mucosas. O intestino é o habitat das populações microbianas e é um tecido imune essencial36. É imunologicamente ativo devido à presença de numerosos tipos de células imunes, incluindo macrófagos, células B, granulócitos e células T.
No presente estudo, desenvolvemos um protocolo para preparar uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino da tilápia do Nilo para facilitar estudos em nível unicelular em espécies de peixes de aquicultura. De acordo com as características dessas enzimas tecido-específicas e trabalhos preliminares, a colagenase/dispase é apropriada para dissociar o tecido intestinal da tilápia. O último tipo enzimático a ser considerado no preparo de suspensões unicelulares é a DNase-I, que impede a agregação celular degradando o DNA livre liberado pela lise de células mortas durante a digestão enzimática sem iniciar vias apoptóticas9 e aumenta o rendimento de células vivas36. Além disso, a albumina de soro bovino (BSA) é adicionada ao tampão de lavagem para reduzir a aglomeração celular e melhorar a viabilidade celular. Várias empresas de reagentes descrevem a BSA como um estabilizador enzimático. A adição de BSA 0,04%-1% ao PBS (phosphate-buffered saline) tem sido utilizada para desenvolver uma solução de lavagem para o preparo de suspensões de sequenciamento unicelular sem efeitos adversos38. A adição de uma baixa proporção de BSA poderia ajudar a manter a viabilidade celular e evitar a agregação livre induzida por DNA de células devido à lise celular. Este protocolo também pode fornecer uma referência valiosa para o desenvolvimento de protocolos de dissociação celular do intestino de outras espécies de peixes de aquicultura.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-&#956;m Sterile Filter</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>It is used to filter and sterilize the enzyme solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>F8200</td>
			<td>Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0098</td>
			<td>Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1&#215; DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A004202</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638-001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4818</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td>DNase I helps reduce cell clumping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>E607009-0500</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600438</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted&#160;Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>qTOWER3G</td>
			<td>It is used to examine cell viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile tilpia (Oreochromis niloticus)</td>
			<td>ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>It is used to spin down the tissue and cell petet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td>Inhibit RNase activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B644201-0050</td>
			<td>It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>For fish euthanasia.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C0040</td>
			<td>It is used for staining dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing

A tilápia-do-nilo é uma das espécies de peixes de água doce mais cultivadas em todo o mundo e é um modelo de pesquisa amplamente utilizado para estudos de peixes de aquicultura. A preparação de suspensões unicelulares de alta qualidade é essencial para estudos em nível de célula única, como RNA de célula única ou sequenciamento genômico. No entanto, não existe um protocolo pronto para uso para espécies de peixes de aquicultura, particularmente para o intestino da tilápia. As enzimas de dissociação efetivas variam dependendo do tipo de tecido. Portanto, otimizar o protocolo de dissociação tecidual selecionando a enzima ou combinação enzimática apropriada para obter células viáveis suficientes com o mínimo de dano é essencial. Este estudo ilustra um protocolo otimizado para preparar uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia do Nilo com uma combinação enzimática de colagenase/dispase. Esta combinação é altamente eficaz para dissociação com a utilização de albumina de soro bovino e DNase para reduzir a agregação celular após a digestão. A produção celular satisfaz os requisitos para sequenciamento unicelular, com 90% de viabilidade celular e alta concentração celular. Este protocolo também pode ser modificado para preparar uma suspensão unicelular do intestino de outras espécies de peixes. Esta pesquisa fornece um protocolo de referência eficiente e reduz a necessidade de ensaios adicionais na preparação de suspensões unicelulares para espécies de peixes de aquicultura.

Este protocolo descreve a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia-do-nilo para sequenciamento unicelular (Figura 1). Esta pesquisa mostra que a mistura colagenase/dispase tem um bom efeito de dissociação e é leve para o tecido intestinal. A seleção da enzima de digestão ideal é essencial para preparar uma suspensão de célula única de alta qualidade. No trabalho preliminar, as eficiências de dissociação de várias enzimas comumente usa...

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Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Aqui, demonstramos a preparação de uma suspensão unicelular de alta qualidade do intestino de tilápia para sequenciamento unicelular.

Preparação de Suspensão de Célula Única do Intestino de Tilápia do Nilo para Sequenciamento de Célula Única

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Este protocolo fornece uma referência confiável para a preparação de uma suspensão de célula única de alta qualidade do intestino da tilápia do Nilo para facilitar estudos em nível de célula única em espécies de peixes de aquicultura. A tecnologia é altamente eficiente e pode ser implementada na maioria das condições de laboratório. Reduz a necessidade de ensaios adicionais para preparar suspensões unicelulares para espécies de peixes de aquicultura.Comece enxaguando peixes de tilápia do Nilo de seis meses de idade em água estéril bem aerada por 15 minutos para lavar as bactérias soltas da superfície. Para preparar o reagente de dissociação enzimática celular, diluir a colagenase dispase em PBS até uma concentração final de um miligrama por mililitro. Misturar 95% do volume da solução enzimática preparada e 5% do volume de FBS.Em seguida, pré-resfriou a centrífuga a quatro graus Celsius antes de usar. Para a dissecção do tecido, colocar os peixes eutanasiados no gelo e coletar de três a quatro centímetros da seção média dos intestinos. Excique a gordura e o mesentério usando fórceps.Remova a gordura aderida à superfície intestinal e a mucosa clara elástica e maleável. Lave suavemente o fragmento do intestino com PBS gelado estéril usando uma seringa para lavar o conteúdo intestinal e o muco. Após várias lavagens, disseque o fragmento em pequenos pedaços e transfira-os para um tubo de 1,5 mililitro contendo um mililitro de PBS gelado.Centrifugar a mistura a 300 x g em quatro graus Celsius durante cinco minutos. E substitua o sobrenadante por um mililitro de 0,08% BSA-DPBS gelado. Usando uma pipeta de vidro aspirar suavemente para ressuspender os fragmentos de tecido.Depois de lavar as peças mais uma vez, retire o sobrenadante e adicione um mililitro do reagente de dissociação enzimática preparado. Misturar também cinco microlitros de inibidor de RNAs com o reagente de dissociação para sequenciamento de RNA de célula única. Coloque o tubo em banho-maria temperado a 37 graus Celsius e inverta manualmente o tubo a cada cinco minutos durante o tempo de incubação de 30 a 60 minutos.Uma vez que os tubos são girados, remova o reagente de dissociação enzimática da célula usando pontas largas. Adicione um mililitro de 0,08% BSA-DPBS gelado e pipete suavemente as células para cima e para baixo para evitar a ruptura celular. Após a centrifusão e ressuspensão das células mais uma vez, coloque o filtro de células de 40 micrômetros pré-molhado com 0,08% de BSA-DPBS em um tubo cônico de 50 mililitros.Passe a suspensão da célula através do filtro. Bata no coador, depois enxágue-o com 200 microlitros DPBS e recolha a suspensão no fundo do tubo. Depois de transferir a suspensão para um tubo de 1,5 mililitro, adicione cinco microlitros de DNA e incube a suspensão por 15 minutos a 15 a 20 graus Celsius.Uma vez centrifugado, remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 400 microlitros de DPBS gelada sem íons cálcio e magnésio. Em seguida, pipetar suavemente para cima e para baixo com pontas largas para misturar as células e repetir esse processo mais uma vez. Para a coloração, misturar a suspensão celular em solução de azul de tripano a 0,4% em igual proporção e incubar por três minutos à temperatura ambiente.Em seguida, adicione 10 microlitros da mistura na lâmina de vidro. Contar as células viáveis e mortas ao microscópio em três campos e calcular a porcentagem de viabilidade celular. As eficiências de dissociação de várias enzimas comumente utilizadas foram comparadas.Verificou-se que a mistura de colagenase dispase tem um melhor efeito de dissociação do que a colagenase dispase ou tripsina isoladamente e várias outras misturas enzimáticas. O exame microscópico mostrou que as células intestinais tinham alta viabilidade e dispersas como células únicas. A maioria das células era viável, enquanto algumas foram coradas mortas devido à permeablização da membrana celular.Preste atenção ao tipo de PBS usado. A solução de digestão enzimática não pode ser usada com PBS livre de cálcio/magnésio, pois a enzima requer íons cálcio/magnésio para funcionar de forma eficaz. O procedimento facilita estudos em nível de célula única em espécies de peixes de aquicultura, fornecendo uma referência valiosa para o desenvolvimento de protocolos de dissociação celular de espécies de peixes de aquicultura.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Preparação de uma única célula Suspensões de Spleen rato com o Dissociator gentleMACS

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Biologia

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Geração de Single-Cell Tissue Suspensões de rato Neural

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Gravações de uma única célula de sucção de cones fotorreceptores rato

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Microinjeção de uma única célula para análise da comunicação celular

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

Isolamento de núcleos de tecido hepático congelado por flash para multiômica unicelular

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolamento e Análise do Transcriptoma de Tipos Celulares Vegetais

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Fluorescence-Activated Single-Cell Sorting of Human Mesenchymal Stem Cells

Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth

Importance of Single Cell Sorting in Isolating Purified Populations of Mesenchymal Stem Cells (Video) | JoVE

Triagem unicelular de células-tronco mesenquimais imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos

The mesenchymal stem cells (MSCs) of an organism possess an extraordinary capacity to differentiate into multiple lineages of adult cells in the body and ...

Two-Step Cell Digestion of Mouse Carotid Artery

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy (Video) | JoVE

Preparação de uma Suspensão Unicelular de Artérias Carótidas de Camundongos para Sequenciamento Unicelular

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...