Name: single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing at JoVE.com

Författarna vill erkänna stöd från Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) och Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).

Alla djurprotokoll under denna studie godkändes av Hainan University Institutional Animal Care and Use Committee (protokollnummer: HNUAUCC-2022-00063; Datum för godkännande: 2022-03-03). En lista över utrustning och förnödenheter som används i detta experiment finns i materialtabellen. En sammanfattning av det aktuella protokollet illustreras i figur 1.
1. Beredning av fisk
<ol><li>Skaffa 6 månader gammal Nile tilapia me...

Detta protokoll beskriver beredningen av en högkvalitativ encellssuspension av Niltilapia tarmen. Före dissociation är avlägsnande av fett och mesenteri från tarmen nödvändigt, särskilt för köttätande fisktarmar med mycket fett. Att använda en spruta istället för hård skrapning för att tvätta bort tarminnehållet minskar den mekaniska skadan på cellerna. För att säkerställa cellens livskraft är det också viktigt att hålla temperaturen vid 20 °C eller lägre för vävnadsdissektion och sköljsteg....

Celler är de grundläggande enheterna av organismer. Jämfört med bulkvävnadsstudier kan studier på encellsnivå återspegla cellheterogenitet och ge information med högre upplösning1. Under de senaste åren har forskare tillämpat encellssekvenseringsteknik för genom-, transkriptom-, epigenom- eller multi-omic-studier på encellsnivå hos däggdjur, zebrafiskar och andra modellorganismer och rapporterade stora genombrott 2,3,4,5,6,7 . Medan de flesta studier har fokuserat på modellorganismer finns det få referensprotokoll eller kommersiella dissociationssatser för encellssekvensering i ekonomiska fiskarter, vilket begränsar tillämpningen av encellssekvensering i vattenbruksforskning. Därför är det avgörande att utveckla vävnadsdissociationsprotokoll som producerar högkvalitativa encellssuspensioner med hög cellviabilitet och nukleinsyraintegritet.
Det är viktigt att optimera vävnadsdissociationsprotokollet med lämplig enzym- eller enzymkombination för att erhålla tillräckligt med livskraftiga celler med minimal skada. Det mest effektiva enzymet för vävnadsdissociation varierar beroende på vävnadstyp. Hos däggdjur har flera enzymer använts för att framställa encellssuspensioner för fast vävnad från däggdjur, inklusive kollagenas, dispas, trypsin, papain, elastas, hyaluronidas, liberas, accutas och trypLE 8,9. Trypsin matsmältning i kombination med mekanisk störning har vanligen använts för att dissociera vävnader för cellodling i fisk 10,11,12,13,14. Trypsin har också använts eller tillsatts i matsmältningen cocktail för vävnadsdissociation i råtttarmen15 och zebrafisk gillvävnad16. Men av flera skäl är trypsin inte det bästa alternativet för encellssekvensering. Trypsin ensam är vanligtvis ineffektivt för vävnadsdissociation. Dessutom inducerar trypsin DNA-strängbrott 17,18 och RNA-nedbrytning19.
Papain bryter ner proteinerna som utgör de snäva korsningarna mellan celler. I däggdjursnerver och glattmuskelceller är papain effektivare och mindre destruktiv än andra proteaser20,21. Men som trypsin resulterar papain i den fria DNA-inducerade aggregeringen av celler på grund av celllysen som uppstår under enzymatisk matsmältning9. Elastas bryter ner elastin, som vanligtvis finns i hud, lungor, ligament, senor och kärlvävnader22. Det används ofta i kombination med kollagenas, dispase eller trypsin för dissocierande lungvävnad8. Hyaluronidas klyver hyaluronans glykosidbindningar, vilket bidrar till matsmältningen av den extracellulära matrisen i olika bindväv och hud 9,23.
I allmänhet är kollagenas och dispase bra alternativ för extracellulär matrisnedbrytning. De har använts vid dissociation av humana, mus- och zebrafisktarmar24,25,26,27. Kollagenas förstör peptidbindningen i kollagen, främjar matsmältningen av den extracellulära matrisen och frigör cellerna i suspension, och sålunda används kollagenas ofta för dissociation av fast vävnad hos människa och mus, inklusive för levern 28,29, mjälte30, bukspottkörtel31 och tarm 25. Dispase är ett proteas som hydrolyserar de N-terminala peptidbindningarna av icke-polära aminosyrarester och är mildare än kollagenas. Det klyver de extracellulära matriskomponenterna, såsom fibronektin, typ IV-kollagen och i mindre utsträckning typ I-kollagen, utan att påverka cell-cellkorsningar. Dispase används separat eller tillsammans med andra enzymer för vävnadsdissociation, såsom för tarm25,32, hjärna33, lever34, etc. Dessutom är kommersiellt tillgängliga matsmältningscocktails, inklusive liberas, accutas och trypLE, också bra alternativ för dissociation av fast vävnad, särskilt för hud, lever och njure 8,9.
Niltilapia (Oreochromis niloticus) tillhör familjen Cichlidae av ordningen Perciformes. Det är en av de mest odlade sötvattensfiskarterna i tropiska och subtropiska områden, med en årlig produktion på 4,5 miljoner ton 202235. Det är en av de bäst studerade vattenbruksfiskarterna med ett väl annoterat genom. Nile tilapia är en idealisk forskningsmodell för vattenbruksfiskarter på grund av dess korta generationstid, enkla uppfödning och anpassningsförmåga till ett brett spektrum av uppfödningsmiljöer. Tarmen är av stort forskningsintresse eftersom det är näringsorganet, matsmältning och absorption, metabolism och slemhinneimmunitet. Tarmen är livsmiljön för mikrobiella populationer och är en viktig immunvävnad36. Det är immunologiskt aktivt på grund av närvaron av många immuncellstyper, inklusive makrofager, B-celler, granulocyter och T-celler.
I den aktuella studien utvecklade vi ett protokoll för att förbereda en högkvalitativ encellssuspension från Niltilapiatarmen för att underlätta studier på encellsnivå i vattenbruksfiskarter. Enligt egenskaperna hos dessa vävnadsspecifika enzymer och förarbete är kollagenas / dispas lämpligt för dissociering av tilapia tarmvävnad. Den slutliga enzymtypen att överväga vid framställning av encellssuspensioner är DNase-I, som förhindrar cellaggregering genom att bryta ned fritt DNA som frigörs genom död celllys under enzymatisk nedbrytning utan att initiera apoptotiska vägar9 och ökar utbytet av levande celler36. Dessutom tillsätts bovint serumalbumin (BSA) till tvättbufferten för att minska cellklumpar och förbättra cellviabiliteten. Flera reagensföretag beskriver BSA som en enzymstabilisator. Tillsatsen av 0,04% -1% BSA till PBS (fosfatbuffrad saltlösning) har använts för att utveckla en tvättlösning för beredning av encellssekvenseringssuspensioner utan negativa effekter38. Tillägget av en låg kvot BSA kan bidra till att upprätthålla cellviabiliteten och undvika fri DNA-inducerad aggregering av celler på grund av celllys. Detta protokoll kan också ge en värdefull referens för att utveckla celldissociationsprotokoll från tarmarna hos andra vattenbruksfiskarter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22-&#956;m Sterile Filter</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>SLGV033RB</td>
			<td>It is used to filter and sterilize the enzyme solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40-&#956;m Cell Strainer</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>F8200</td>
			<td>Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SRE0098</td>
			<td>Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1&#215; DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 - 8 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A004202</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638-001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4818</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td>DNase I helps reduce cell clumping.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>E607009-0500</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600438</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted&#160;Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>qTOWER3G</td>
			<td>It is used to examine cell viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5401119001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile tilpia (Oreochromis niloticus)</td>
			<td>ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>P1020</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424</td>
			<td>It is used to spin down the tissue and cell petet.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0314L</td>
			<td>Inhibit RNase activity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>B644201-0050</td>
			<td>It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td>For fish euthanasia.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C0040</td>
			<td>It is used for staining dead cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>E607001</td>
			<td>Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell suspension preparation from nile tilapia intestine for single-cell sequencing

Niltilapia är en av de mest odlade sötvattensfiskarterna i världen och är en allmänt använd forskningsmodell för vattenbruksfiskstudier. Beredningen av högkvalitativa encellssuspensioner är avgörande för studier på encellsnivå, såsom encells-RNA eller genomsekvensering. Det finns dock inget färdigt protokoll för vattenbruksfiskarter, särskilt för tarmarna av tilapia. De effektiva dissociationsenzymerna varierar beroende på vävnadstyp. Därför är det viktigt att optimera vävnadsdissociationsprotokollet genom att välja lämplig enzym- eller enzymkombination för att erhålla tillräckligt med livskraftiga celler med minimal skada. Denna studie illustrerar ett optimerat protokoll för att förbereda en högkvalitativ encellssuspension från Niltilapiatall med en enzymkombination av kollagenas / dispas. Denna kombination är mycket effektiv för dissociation med användning av bovint serumalbumin och DNas för att minska cellaggregering efter matsmältning. Cellutgången uppfyller kraven för encellssekvensering, med 90% cellviabilitet och hög cellkoncentration. Detta protokoll kan också modifieras för att förbereda en encellssuspension från tarmarna hos andra fiskarter. Denna forskning ger ett effektivt referensprotokoll och minskar behovet av ytterligare försök vid framställning av encellssuspensioner för vattenbruksfiskarter.

Detta protokoll beskriver beredningen av en högkvalitativ encellssuspension av Niltilapiatall för encellssekvensering (figur 1). Denna forskning visar att kollagenas / dispasblandningen har en god dissociationseffekt och är mild för tarmvävnad. Valet av det optimala matsmältningsenzymet är avgörande för framställning av en högkvalitativ encellssuspension. I det preliminära arbetet jämfördes dissociationseffektiviteten hos flera vanliga enzymer och resultaten listas i ta...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing at JoVE.com

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Här demonstrerar vi beredningen av en högkvalitativ encellssuspension av tilapiatall för encellssekvensering.

Encellssuspensionspreparat från Nile Tilapia-tarmen för encellssekvensering

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Detta protokoll ger en tillförlitlig referens för att förbereda en högkvalitativ encellssuspension från Niltilapiatarmen för att underlätta studier på encellsnivå i vattenbruksfiskarter. Tekniken är mycket effektiv och kan implementeras i de flesta laboratorieförhållanden. Det minskar behovet av ytterligare försök för att förbereda encellssuspensioner för vattenbruksfiskarter.Börja med att skölja sex månader gammal Nile tilapia fisk i väl luftat sterilt vatten i 15 minuter för att tvätta bort löst bundna bakterier från ytan. För beredning av det enzymatiska celldissociationsreagenset, späd kollagenasdispasen i PBS till en slutlig koncentration av ett milligram per milliliter. Blanda 95 volymprocent av den beredda enzymatiska lösningen och 5 volymprocent FBS.Förkyl sedan centrifugen till fyra grader Celsius före användning. För vävnadsdissektion, placera den avlivade fisken på is och samla tre till fyra centimeter av tarmarnas mittsektion. Punktskatt fett och mesenteri med pincett.Ta bort fettet som är fäst vid tarmytan och den elastiska och formbara klara slemhinnan. Skölj försiktigt tarmfragmentet med steril iskall PBS med en spruta för att tvätta bort tarminnehållet och slem. Efter flera tvättar, dissekera fragmentet i små bitar och överför dem till ett 1,5 milliliter rör innehållande en milliliter iskall PBS.Centrifugera blandningen vid 300 x g i fyra grader Celsius i fem minuter. Och byt ut supernatanten med en milliliter iskall 0,08% BSA-DPBS. Använd en glaspipett försiktigt för att resuspendera vävnadsfragmenten.Efter tvättning av bitarna en gång till, ta bort supernatanten och tillsätt en milliliter av det beredda enzymatiska dissociationsreagenset. Blanda också fem mikroliter RNA-hämmare med dissociationsreagenset för encells RNA-sekvensering. Placera röret vid 37 grader Celsius härdat vattenbad och vänd röret manuellt var femte minut under inkubationstiden på 30 till 60 minuter.När rören har snurrats, avlägsna det enzymatiska celldissociationsreagenset med bredborrade spetsar. Tillsätt en milliliter iskall 0,08% BSA-DPBS och pipettera försiktigt cellerna upp och ner för att förhindra cellstörningar. Efter centrifusion och resuspendering av cellerna en gång till, placera 40 mikrometer cellsil förfuktad med 0,08% BSA-DPBS på ett 50 ml koniskt rör.För cellsuspensionen genom silen. Knacka på silen, skölj den sedan med 200 mikroliter DPBS och samla upphängningen längst ner på röret. Efter överföring av suspensionen till ett 1,5 ml rör, tillsätt fem mikroliter DNA och inkubera suspensionen i 15 minuter vid 15 till 20 grader Celsius.Efter centrifugering, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 400 mikroliter iskall DPBS utan kalcium- och magnesiumjoner. Pipettera sedan försiktigt upp och ner med bredborrade spetsar för att blanda cellerna och upprepa denna process en gång till. För färgning, blanda cellsuspensionen i 0,4% trypanblå lösning i lika förhållande och inkubera i tre minuter vid rumstemperatur.Tillsätt sedan 10 mikroliter av blandningen på glasskivan. Räkna de livskraftiga och döda cellerna under mikroskopet i tre fält och beräkna cellviabilitetsprocenten. Dissociationseffektiviteten hos flera vanliga enzymer jämfördes.Kollagenasdispasblandningen verifierades ha en bättre dissociationseffekt än kollagenasdispasen eller trypsin ensam och flera andra enzymblandningar. Den mikroskopiska undersökningen visade att tarmcellerna hade hög livskraft och dispergerade som enskilda celler. De flesta celler var livskraftiga, medan några färgades döda på grund av det permeabliserade cellmembranet.Var uppmärksam på vilken typ av PBS som används. Enzymatisk digestionslösning kan inte användas med kalcium / magnesiumfri PBS eftersom enzymet kräver kalcium / magnesiumjoner för att fungera effektivt. Förfarandet underlättar studier på encellsnivå i vattenbruksfiskarter, vilket ger en värdefull referens för att utveckla celldissociationsprotokoll för vattenbruksfiskarter.

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Beredning av encelliga Suspensioner från musmjälte med gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Standardiserade Beredning av encelliga Suspensioner från mus lungvävnad med gentleMACS Dissociator

The preparation of single-cell suspensions from tissues is an important prerequisite for many experiments in cellular research. The process of ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Generering av encelliga Suspensioner från mus nervvävnad

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Encelliga Sug Inspelningar från fotoreceptorer Mus Cone

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

Single Cell transkriptionell Profilering av Vuxen mus Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Encelliga mikroinjektion för analys Cell Communication

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Isolation of Nuclei from Flash-Frozen Liver Tissue for Single-Cell Multiomics

Isolering av kärnor från flashfrusen levervävnad för encells multiomik

The liver is a complex and heterogenous tissue responsible for carrying out many critical physiological functions, such as the maintenance of energy ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolering och transkriptomanalys av växtcelltyper

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Fluorescence-Activated Single-Cell Sorting of Human Mesenchymal Stem Cells

Single-Cell Sorting of Immunophenotyped Mesenchymal Stem Cells from Human Exfoliated Deciduous Teeth

Importance of Single Cell Sorting in Isolating Purified Populations of Mesenchymal Stem Cells (Video) | JoVE

Encellssortering av immunfenotypade mesenkymala stamceller från humana exfolierade mjölktänder

The mesenchymal stem cells (MSCs) of an organism possess an extraordinary capacity to differentiate into multiple lineages of adult cells in the body and ...

Two-Step Cell Digestion of Mouse Carotid Artery

Preparation of a Single-Cell Suspension from Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Sequencing

Vascular Tissue Dissociation and Exploring Single-Cell Subclusters for Targeted Therapy (Video) | JoVE

Beredning av en encellssuspension från mössens halspulsådror för encellssekvensering

Carotid arteries are major blood vessels in the neck that supply blood and oxygen to the brain, but carotid stenosis occurs when carotid arteries are ...