Name: analysis of raw and processed cyperi rhizoma samples using liquid chromatography-tandem mass spectrometry in rats with primary dysmenorrhea
Uploaded: 2022-12-23T14:40:00
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这项工作得到了重庆市卫生和计划生育委员会中医药科技项目（项目编号：ZY201802297）、重庆市自然科学基金面上项目（项目编号：cstc2019jcyj-msxmX065）、重庆市现代山区特色高效农业科技体系创新团队建设规划2022[10]、重庆市卫生健康委员会中药重点学科建设项目的支持。 医药加工。

所有与动物有关的实验均经重庆中医药研究院实验伦理委员会批准进行。本实验使用了24只8-10周龄，体重200克±20克的雌性Sprague Dawley大鼠（SD）。
1. 提取的准备
<ol><li>计算<ol><li>计划将CR或CRV提取物施用于六只Sprague-Dawley大鼠（10g / [kg∙day]）的治疗组3天。使用浓度为 1 g/mL 的 CR 或 CRV 提取物（1 mL 提取物来自 1 g 草药）。 注意：CR的剂量为6-10克。在这项研究中?...

由于中药种类繁多，性质各异，这些中药材有时在临床上不起作用，这可能是由于中药加工和煎煮不当造成的。随着当代科学技术的使用，中医的机制变得越来越明显29，30.本研究表明，CR和CRV均对PD模型大鼠具有治疗效果，且CRV的治疗效果更为显著。CRV的作用机制可能与醋加工可能影响被吸收到血液中的CR成分有关，并且可能与亚油酸代谢和不饱和脂肪...

原发性痛经（PD）是临床妇科中最普遍的疾病。它的特征是月经前或月经期间背痛、肿胀、腹痛或不适，生殖系统中没有盆腔病变1.一份关于其患病率的报告显示，85.7%的学生患有PD2。低剂量口服避孕药是标准疗法，但其不良副作用，如深静脉血栓形成，引起了越来越多的关注3。口服避孕药使用者深静脉血栓形成的患病率为每 1，000 名妇女 >1 例，在最初 6-12 个月和 40 岁以上的使用者中风险最高4。
长期用于传统中药（TCM），Cyperi rhizoma（CR）来源于Cyperaceae家族Cyperus rotundus L.的干燥根茎。CR调节月经紊乱，缓解抑郁和疼痛5.CR广泛用于妇科，被认为是治疗女性疾病的普通药物6。用醋（CRV）加工的CR通常用于临床。与CR相比，CRV显示出对月经和疼痛缓解的增强调节。现代研究表明，CR抑制环氧合酶-2（COX-2）和随后前列腺素（PGs）的合成，从而达到抗炎作用。同时，CR表现出无副作用的镇痛作用7，使CR成为痛经患者的不错选择。然而，CRV调节月经和缓解疼痛的机制尚不清楚。CR研究主要集中在其活性化学成分和药理活性的变化，如其抗炎，抗抑郁和镇痛作用8，9，10，11，12。
虽然中医的成分很复杂，但它们被吸收到血液中，必须达到特定的血液浓度才能有效13。通过利用血液中成分测定的策略，可以缩小中药活性成分的筛选范围。在体外研究化学成分时可以避免盲目，在研究单个成分时可以避免片面性14。通过比较血液中CR和CRV的组成，可以有效，快速地检测处理后的CR活性成分的变化。药物功效是药物影响身体的过程。由于身体的代谢反应引起的药物成分的变化，可能与药物的作用机制有关，可以用代谢组学来确定。代谢组学旨在测量整体和动态代谢反应，这与确定中药的整体疗效一致15。此外，代谢物是基因表达的最终产物，与表型16最密切相关。因此，代谢组学可能适用于探索CR和CRV在PD治疗中的代谢途径的差异。 基于液相色谱-高分辨率串联质谱（LC-MS/MS）的非靶向代谢组学具有高通量、高灵敏度和高分辨率的特点，可用于测量许多不同的小分子成分17，18.该方法可以同时测定吸收到血液中的内源性代谢物和外源性成分。代谢组学已广泛应用于中医19、药物毒理学20、健康管理21、运动22、食品23等领域。
本研究采用基于LC-MS/MS的非靶向代谢组学，测定CR处理和CRV治疗痛经模型大鼠血液中吸收的外源成分和内源性代谢物的差异，揭示CRV镇痛作用的机制。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetonitrile&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA</td>
			<td>197164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BECKMAN COULTER Microfuge 20</td>
			<td>Beckman&#160;Coulter, Inc.</td>
			<td>MRZ15K047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Estradiol benzoate</td>
			<td>Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd</td>
			<td>C10042616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA</td>
			<td>177799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC 30A system</td>
			<td>Shimadzu, Kyoto, Japan</td>
			<td>228-45162-46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olive oil</td>
			<td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>H25A11P111909</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxytocin synthetic</td>
			<td>Zhejiang peptide biology Co., Ltd&#160;</td>
			<td>2019092001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat PGF2&#945; ELISA kit</td>
			<td>Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd</td>
			<td>202101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat PGFE2 ELISA kit</td>
			<td>Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd</td>
			<td>EDL202006217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPF Sprague-Dawley rats</td>
			<td>Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd</td>
			<td>Certificate number SCXK (Hunan) 2019-0004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite 200 PRO&#160;&#160;</td>
			<td>Tecan Austria GmbH, Austria</td>
			<td>1510002987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triple TOF 4600 system</td>
			<td>SCIEX, Framingham, MA, USA</td>
			<td>BK20641402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA</td>
			<td>152720</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of raw and processed cyperi rhizoma samples using liquid chromatography-tandem mass spectrometry in rats with primary dysmenorrhea

根瘤（CR）广泛用于妇科，是我国治疗妇女疾病的全科药物。由于用醋加工后CR的镇痛作用增强，因此临床上一般采用醋处理的CR（CRV）。然而，醋加工增强镇痛作用的机制尚不清楚。本研究采用超高压液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）技术检测CR处理和CRV处理痛经大鼠外源成分和代谢物血液水平的变化。结果显示，这些大鼠血液中的15种成分和两种代谢物含量不同。其中，CRV组的（-）-肉豆蔻醇和[（1R，2S，3R，4R）-3-羟基-1，4，7，7-四甲基双环[2.2.1]庚-2-基]乙酸水平明显高于CR组。CRV降低具有促炎、血小板聚集和血管收缩活性的2系列前列腺素和4系列白三烯的水平，并通过调节花生四烯酸和亚油酸代谢以及不饱和脂肪酸的生物合成提供镇痛作用。本研究表明，醋加工增强了CR的镇痛作用，有助于我们了解CRV的作用机制。

痛经模型实验分析 对照组30分钟内无扭动反应，因为这些大鼠未腹腔注射催产素和苯甲酸雌二醇引起疼痛。模型组、CR组和CRV组的大鼠在注射催产素后表现出大量的扭动反应。这些结果证明了苯甲酸雌二醇和催产素联合用药诱导痛经的疗效。模型组和对照组之间PGF 2α、PGE 2和PGF2α/PGE2水平的差异显著（P < 0.001，P < 0.05），证明了 模型的有效性（...

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Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea

在这里，使用超高效液相色谱-高分辨率串联质谱（UPLC-MS/MS）对原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi rhizoma（CR）样品进行了比较分析。检查CR处理的大鼠和醋处理的CR（CRV）大鼠之间代谢物和样品成分的血液水平变化。

使用液相色谱-串联质谱分析原发性痛经大鼠的原始和加工的Cyperi Rhizoma样品

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is ...

代谢组学测量整体和动态代谢反应，与确定传统中药的整体疗效一致。由于身体代谢反应引起的药物成分的变化可以通过代谢组学来确定。利用该技术可以缩小中药有效成分的筛选范围。通过研究单个成分可以避免片面性。该方法可以同时测定吸收到血液中的内源性代谢物和外源性成分。代谢组学已广泛应用于中医药、药物毒理学、健康管理、体育、食品等领域的研究。首先，确定所需的Cyperi rhizoma提取物，或CR，或用醋或CRV处理的Cyperi rhizoma，以治疗一组六只Sprague Dawley大鼠三天。使用此公式计算每只大鼠要施加的CR或CRV的体积。要处理CRV，请充分混合100克CR和20克醋，每100毫升含有超过5.5克乙酸，并孵育12小时。孵育后，将混合物在 110 至 120 摄氏度的铁锅中翻炒 10 分钟。然后，取出混合物，让它在室温下冷却。要制备CR提取物，请用10倍于CR量的纯水浸泡CR两个小时，确保药材低于液位。接下来，将水和药物的混合物用大火煮沸，并在小火下煮沸20分钟。然后，通过100目滤布过滤内容物，并收集滤液。然后，将收集的滤液浓缩到带有旋转蒸发器的提取物中至每毫升一克。要制备 CRV 提取物，请执行浸泡、煮沸和浓缩的步骤，如 CR 提取所示。为了测试CR和CRV提取物，将500微升提取物移液到1.5毫升微量离心管中的500微升甲醇中，并涡旋30秒以混合。将样品在 16， 500 g 下在 4 摄氏度下离心 15 分钟。然后，取出上清液，并将其转移到样品瓶中进行测试。测试样品后，使用分析软件执行主成分分析或PCA和建模。将代谢物的标准化数据导入软件，然后使用Autofit构建分析模型。最后，使用分数获得PCA的分数散点图。要执行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），请将代谢物以及CR和CRV组的标准化数据导入软件。然后，将 CR 和 CRV 数据导入到各自创建的组中。然后，使用自动拟合构建分析模型，并使用分数获取OPLS-DA的分数散点图。最后，使用VIP获取投影中的可变显著性或OPLS-DA中的VIP值。要识别潜在的差异代谢物，请筛选出VIP值大于1的代谢物。然后，使用统计软件通过学生的T检验计算筛选代谢物的P值。接下来，要鉴定差异代谢物，请使用注释的代谢物，并筛选出要在KEGG数据库中匹配的差异代谢物。通过绘制热图显示CR和CRV组中差异代谢物的变化。要检查潜在的代谢途径，请访问MetaboAnalyst数据库。使用途径分析上传不同的代谢物以获得潜在的代谢途径。将不同的代谢物上传到KEGG数据库，以分析潜在的代谢途径。分析的痛经模型实验显示前列腺素水平存在显著差异。模型CR组和CRV组的大鼠在注射催产素后表现出大量的扭动反应。PCA分析结果表明，在正负离子模式下，CR组和CRV组与模型组的团簇均有显著分离。采用OPLS-DA筛查代谢差异，散点图结果表明CR组和CRV组是分开的。进行单变量统计分析以确定代谢变化。显示了火山图，其中每个点对应于不同的代谢物。在阳性模式下观察到63种代谢物和阴性模式下的30种代谢物发生显着变化。使用KEGG和HDMB数据库测定差异代谢物，并列出精确匹配的化合物。计算CR组和CRV组间差异代谢物的定量值并进行聚类。色块表示每种代谢物相对于其他代谢物的表达方式。与CR组相比，CRV组4种差异代谢物水平升高，11种代谢物水平在正离子模式下下降。在负离子模式的情况下，四种差异代谢物增加，七种代谢物减少。KEGG通路分析结果表明，差异代谢产物在正负模式下与9个通路相关。差异代谢物越多，结果越好，因此可以链接足够的代谢途径，筛选的关键代谢途径将更准确。

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