Name: studying habituation in stentor coeruleus
Uploaded: 2023-01-06T13:45:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

نشكر تاتيانا ماكوشوك على المناقشات التي لا حصر لها حول تعلم Stentor . تم تمويل هذا العمل من خلال منحة NSF MCB- 2012647 ومنحة المعاهد الوطنية للصحة R35 GM130327 ، وكذلك من خلال جائزة I2CELL من مؤسسة Fourmentin-Guilbert.

ملاحظة: يظهر ملخص لسير عمل تجربة التعود في الشكل 2.
1. تجميع جهاز التعود
<ol><li>اربط سائق المحرك بالمحرك (انظر الشكل 3).<ol><li>قم بتوصيل السلكين المكتوب عليهما A من لوحة السائق بالأسلاك الزرقاء والحمراء على المحرك. قم بتوصيل السلكين المكتوب عليهما B من لوحة السائق بالأسلاك الخضراء والسوداء الموجودة على المحرك. ملاحظة: بالنظر لأسفل على لوحة السائق من الأعلى مع وجود أسلاك المحرك في الأعلى ، يجب توصيل أسلاك الإدخال الأربعة بأسلاك المحرك بهذا الترتيب: الأزرق والأحمر والأسود والأخضر.</li>
	</ol></li>
	<li>قم ببناء دائرة اللوح الموضح في الشكل 4 ، مع عناية خاصة لتوصيل مصابيح LED في القطبية الصحيحة.</li>
	<li>قم بتوصيل Vcc (+5 V) من لوحة السائق إلى السكة العلوية للوح التجارب الأبيض و Gnd من لوحة التشغيل إلى السكة السفلية للوح التجارب.</li>
	<li>قم بتوصيل أرضية اللوح بالدبوس الأرضي للوحة المتحكم الدقيقة. قم بتوصيل أسلاك LED الخضراء و LED الحمراء والمفتاح وأسلاك الزر ، على التوالي ، بالمسامير الرقمية للوحة التحكم الدقيقة 8 و 9 و 10 و 11.</li>
	<li>قم بتوصيل المسامير الرقمية للوحة التحكم الدقيقة 2 و 3 بأسلاك لوحة السائق Step و Dir.</li>
	<li>قم بتوصيل المسامير الرقمية للوحة التحكم الدقيقة 4 و 5 و 6 و 7 بأسلاك لوحة السائق.<ol><li>قم بتوصيل Pin 4 ب MS1 ، وقم بتوصيل Pin 5 ب MS2 ، وقم بتوصيل Pin 6 ب MS3 ، وقم بتوصيل Pin 7 بالتمكين.</li>
	</ol></li>
	<li>قم بتشغيل لوحة السائق بمصدر طاقة 12 فولت. قم بتوصيل مصدر 12 فولت بقابس المحول الأسود / الأخضر المتصل بسلكين أحمرين بلوحة سائق المحرك. ملاحظة: لا تقم بتوصيل مصدر 12 فولت بقابس لوحة التحكم الدقيقة.</li>
	<li>قم بتنزيل برنامج التحكم (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) على لوحة التحكم الدقيقة.</li>
	<li>استخدم كبل USB لتوصيل لوحة المتحكم الدقيق بجهاز كمبيوتر ، والذي سيكون أيضا بمثابة مصدر طاقة للوحة المتحكم الدقيقة.</li>
	<li>تحقق من عمل عناصر تحكم المستخدم.<ol><li>تأكد من أن مفتاح التمرير يقوم بتشغيل الوضع التلقائي وإيقاف تشغيله. في الوضع التلقائي ، سيتخذ النظام خطوة على فترات منتظمة يحددها المستخدم (انظر أدناه).</li>
		<li>تحقق من تشغيل مؤشر LED الأخضر عندما يكون الوضع التلقائي قيد التشغيل.</li>
		<li>تأكد من أن مؤشر LED الأحمر يومض 1 ثانية قبل أن يطبق المحرك نبضة. مؤشر LED الأحمر هو ضوء تحذير يشير إلى متى يكون النظام على وشك توصيل نبضة ميكانيكية.</li>
		<li>اختبر الزر الأحمر ، الذي يؤدي إلى تشغيل خطوة صغيرة 1/16 في كل مرة يتم فيها الضغط على الزر ، بغض النظر عما إذا كان النظام في الوضع التلقائي أم لا.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig03.jpg"> الشكل 3: مكونات جهاز التعود. جميع الإلكترونيات المصنفة مطلوبة لتجميع الماكينة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig04.jpg"> الشكل 4: تخطيط الإلكترونيات. هذه هي الدائرة على اللوح. يتم ترقيم الأسلاك المتصلة بلوحة التحكم الدقيق كما هو موضح في البروتوكول. D1 و D2 هما مصابيح LED الحمراء والخضراء ، على التوالي ، ويتم توصيلهما بالأرض من خلال مقاومات 330 Ω. يتم سحب المفتاحين بمقاومات 10 KΩ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
2. إعداد تجربة التعود
<ol><li>الحصول على الدعامة.</li>
	<li>معطف لوحة 35 مم مع 0.01 ٪ محلول بولي أورنيثين.<ol><li>أضف 3 مل من محلول البولي أورنيثين 0.01٪ إلى اللوحة واتركه طوال الليل.</li>
		<li>اغسل الطبق مرتين بماء عالي النقاء ومرة واحدة بمياه الينابيع المبسترة (PSW) (جدول المواد).</li>
	</ol></li>
	<li>أضف 3.5 مل من PSW إلى لوحة 35 مم.</li>
	<li>اغسل الدعامة في طبق من 6 آبار (جدول المواد).<ol><li>أضف 3 مل من PSW إلى البئر الأول و 5 مل من PSW إلى البئرين الثاني والثالث. استخدم ماصة P1,000 لإضافة 2 مل من Stentor من طبق الاستزراع إلى البئر الأول من اللوحة المكونة من 6 آبار.</li>
		<li>حدد Stentor الفردي باستخدام مجهر ستيريو (جدول المواد) ثم استخدم ماصة P20 لنقل 100 Stentor من البئر الأول إلى البئر الثاني.</li>
		<li>حدد Stentor الفردي باستخدام مجهر ستيريو ثم استخدم ماصة P20 لنقل 100 Stentor من البئر الثاني إلى البئر الثالث.</li>
	</ol></li>
	<li>استخدم ماصة P200 لنقل 100 Stentor بحجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر من البئر الثالث للوحة ذات 6 آبار إلى لوحة 35 مم بحيث يكون الحجم النهائي في لوحة 35 مم 4 مل.</li>
	<li>قم بلصق قطعة (7 سم × 7 سم) من الورق الأبيض بالمسطرة المعدنية على جهاز التعود. تأكد من أن الحافة اليسرى للورقة على بعد 2 سم من نهاية المسطرة الأقرب إلى المحرك.</li>
	<li>استخدم شريطا على الوجهين للصق الجزء السفلي من اللوحة مقاس 35 مم بمركز 2 بوصة × 2 في ورقة أعلى المسطرة على جهاز التعود.</li>
	<li>اترك اللوحة مقاس 35 مم على جهاز التعود لمدة 2 ساعة على الأقل (يمكن تمديد ذلك طوال الليل) مع إغلاق الغطاء. طوال فترة التأقلم هذه ، احتفظ باللوحة في ظروف الإضاءة المحيطة التي تتوافق مع ظروف الإضاءة التجريبية (أي لا تعرض الخلايا لتقلبات الضوء / الظلام). علاوة على ذلك ، تأكد من أن اللوحة لا تواجه أي اضطرابات ميكانيكية من التدافع العرضي.</li>
	<li>قم بتوسيط كاميرا مجهر USB (جدول المواد) مباشرة فوق لوحة 35 مم من Stentor. إذا لزم الأمر ، ضع دعامة مثل صندوق طرف ماصة أسفل كاميرا مجهر الناقل التسلسلي العالمي (USB) لضبط الارتفاع. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام حامل حلقي لضبط الارتفاع.</li>
	<li>قم بتثبيت تطبيق مسجل كاميرا الويب على جهاز كمبيوتر محمول (جدول المواد) واستخدمه لتصور الخلايا عبر إدخال المجهر.<ol><li>افتح تطبيق مسجل كاميرا الويب وحدد مجهر USB من القائمة المنسدلة. اضبط التركيز على كاميرا مجهر USB بحيث تكون الخلايا في العرض بوضوح.</li>
		<li>اضبط موضع كاميرا مجهر USB لزيادة عدد الخلايا في مجال الرؤية.</li>
	</ol></li>
	<li>افتح الشاشة التسلسلية للوحة التحكم الدقيقة: حدد No Line Ending واضبطها على 9600 باود.</li>
	<li>استخدم الأمر l في برنامج لوحة التحكم الدقيق لخفض المحرك حتى بالكاد يلمس المسطرة. استخدم الأمر r لرفع الذراع إذا لزم الأمر لضبط الموضع الدقيق. ملاحظة: إذا كان المحرك على بعد مسافة كبيرة من المسطرة ، فاكتب الأمر d لتعطيل تيار ملف المحرك بحيث يمكن تحريك الذراع يدويا نحو المسطرة. بعد تحريك الذراع يدويا ، استخدم الأمر e لتمكين تيار ملف المحرك والحفاظ على الذراع مغلقا في موضعه. عند إنزاله بشكل صحيح قبل بدء التجربة ، يجب أن يكون الطرف السفلي للمحرك على بعد 1 سم من الحافة اليسرى للمسطرة. سيقوم المحرك بتوصيل النبض الميكانيكي عن طريق ضرب المسطرة.</li>
	<li>استخدم الأمر i لتهيئة الوضع التلقائي على جهاز التعود.</li>
	<li>أدخل حجم الخطوة في سطر الأوامر. المستوى 5 هو أصغر خطوة ، والمستوى 1 هو أكبر خطوة. المستوى 4 هو حجم الخطوة المستخدم لتجارب التعود الأساسية. ملاحظة: ينتج عن حافز المستوى 5 إزاحة هبوطية للمسطرة بمقدار ~ 0.5 مم ؛ ينتج عن المستوى 4 إزاحة هبوطية بمقدار ~ 1 مم ؛ ينتج عن المستوى 3 إزاحة هبوطية بمقدار ~ 2 مم ؛ ينتج عن المستوى 2 إزاحة هبوطية بمقدار ~ 3-4 مم ؛ وينتج عن المستوى 1 إزاحة هبوطية بمقدار ~ 8 مم. ينتج عن محفز المستوى 5 قوة ذروة هبوطية للمحرك مقابل المسطرة ~ 0.122 نيوتن ؛ ينتج عن المستوى 4 قوة ذروة هبوطية تبلغ ~ 0.288 نيوتن ؛ وينتج عن المستوى 3 قوة ذروة هبوطية تبلغ ~ 0.557 N. يصعب تحديد القوى الهابطة الناتجة عن المستوى 1 والمستوى 2 تجريبيا باستخدام مقياس ديناميكي بسبب تذبذبات المسطرة الكبيرة التي تحدث بعد اتصال المحرك.</li>
	<li>أدخل الوقت بين النبضات بالدقائق. الفاصل الزمني المستخدم لتجارب التعود الأساسي هو 1 دقيقة.</li>
	<li>ابدأ في التقاط مقطع فيديو باستخدام تطبيق مسجل كاميرا الويب بالضغط على زر التسجيل الأحمر. بعد ذلك ، اقلب المفتاح على جهاز التعود لبدء التجربة مع أول توصيل نبض ميكانيكي آلي.</li>
</ol>3. تحليل فيديو التجربة
<ol><li>مباشرة قبل ظهور النبضة الميكانيكية الأولى على الفيديو ، توقف مؤقتا واحسب عدد Stentor المثبتة في الجزء السفلي من اللوحة مقاس 35 مم والممتدة في شكل ممدود يشبه البوق (الشكل 5 أ ، الفيديو 1).</li>
	<li>مباشرة بعد النبضة الأولى ، احسب عدد Stentor المثبتة في أسفل اللوحة وتقلصت في شكل يشبه الكرة (الشكل 5B ، الفيديو 1). ملاحظة: يمكن تمييز الخلايا المنقبضة بسهولة من الخلايا الممدودة لأن Stentor يقصر طول جسمها بأكثر من 50٪ في غضون 10 مللي ثانية أثناء حدث الانكماش3.</li>
	<li>اقسم العد الثاني على العد الأول لتحديد كسر Stentor الذي انكمش استجابة للمثير الميكانيكي.</li>
	<li>كرر الخطوات 3.1-3.3 لجميع النبضات الميكانيكية في فيديو التجربة.</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig05.jpg"> الشكل 5: تنقبض الدعامة بعد تلقي حافز ميكانيكي . (أ) الدعامة في حالتها الممدودة ومثبتة في قاع صفيحة بتري. (ب) تعاقد الدعامة بعد تلقي تحفيز ميكانيكي من المستوى 4 من جهاز التعود. تم التقاط الصور باستخدام مجهر USB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
فيديو 1: فيديو لمقاولات الدعامة. يتلقى Stentor حافزا ميكانيكيا من المستوى 4 من جهاز التعود كل دقيقة. هذه الخلايا لم تعتاد بعد ، لذلك تنقبض بعد تلقي النبض. الخلايا موجودة في صفيحة بتري الموضوعة فوق جهاز التعود. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_1_JoVE.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>

<ol>
	<li>Dussutour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+single+cell+organisms.">Learning in single cell organisms.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).</li><li>Sternberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intelligence.">Intelligence.</a> Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parametric+studies+of+the+response+decrement+produced+by+mechanical+stimuli+in+the+protozoan,+Stentor+coeruleus.">Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus.</a> Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+learning.">Cell learning.</a> Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specific+habituation+in+a+protozoan.">Stimulus specific habituation in a protozoan.</a> Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).</li><li>Thompson, R. F., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation:+A+model+phenomenon+for+the+study+of+neuronal+substrates+of+behavior.">Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior.</a> Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).</li><li>Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stentor+coeruleus.">Stentor coeruleus.</a> Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).</li><li>McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+is+altered+in+neuropsychiatric+disorders-A+comprehensive+review+with+recommendations+for+experimental+design+and+analysis.">Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تتعلق أهم الخطوات في البروتوكول بضمان بقاء Stentor في الظروف المثلى لحدوث الانقباضات. تتطلب استجابة الانكماش في مقايسة التعود أن تكون الدعامات مثبتة على سطح باستخدام ثباتها اللزجة لأنها نادرا ما تنقبض عندما تسبح بحرية. ومع ذلك ، فإن السطح السفلي للوحة بتري 35 مم المستخدمة في تجارب التعود لا يفضي عادة إلى التثبيت ما لم يكن مطليا ببولي أورنيثين. علاوة على ذلك ، لا يمكن تعريض Stentor لأي اضطراب ميكانيكي لمدة لا تقل عن 2 ساعة قبل بدء تجربة التعود لأن مقياس وقت نسيان Stentor هو 2-6 h3. إذا تلقى Stentor تحفيزا ميكانيكيا في غضون 2 ساعة من وقت بدء تجربة التعود ، فهناك احتمال أن يؤدي هذا التحفيز المسبق إلى مستوى طفيف من التعود قبل التجربة ، وبالتالي تقليل احتمالية الانكماش بعد أن يسلم جهاز التعود النبضة الميكانيكية الأولى. أخيرا ، خلال مرحلة التحليل ، من المهم فقط حساب عدد Stentor الذي ينقبض بعد النبض - بدلا من أي تقلصات عفوية عرضية تحدث قبل توصيل النبض - للحصول على قراءة دقيقة لجزء الخلايا التي تقلصت استجابة للتحفيز الميكانيكي.
يمكن تعديل البروتوكول بسهولة لدراسة أنواع مختلفة من ديناميكيات التعود عن طريق تغيير قوة وتردد النبضات الميكانيكية التي يقدمها جهاز التعود. يوفر هذا أيضا فرصة لاستكشاف أنواع أخرى من التعلم ، مثل التوعية ، التي قد تحدث في Stentor. يمكن أيضا تعديل رمز برنامج لوحة التحكم الدقيق نفسه لتقديم أنماط مختلفة من الصنابير الميكانيكية إلى Stentor.
تتمثل إحدى المشكلات المحتملة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها باستخدام هذا البروتوكول في التردد المنخفض لإرساء Stentor ، مما قد يقيد عدد Stentor الذي يمكن ملاحظته في تجربة التعود. يتم تقليل تردد التثبيت في بعض الأحيان في ثقافات Stentor التي لم يتم تغذيتها مؤخرا أو ملوثة. لمعالجة هذه المشكلة ، يجب على المرء غسل دفعة جديدة من Stentor لبدء ثقافة جديدة وإطعامهم بانتظام وفقا للبروتوكول الموضح في Lin et al.10.
هذا البروتوكول محدود حيث يمكن اختبار لوحة واحدة فقط من Stentor في كل مرة ، مما يؤدي إلى قياسات إنتاجية منخفضة نسبيا. علاوة على ذلك ، لا تسمح البرامج الحالية بأتمتة تحليل الصور أحادية الخلية. وبالتالي ، فإن معظم البيانات التي تم الحصول عليها هي على مستوى السكان. قد تسهل النماذج المستقبلية لجهاز التعود وأدوات تحليل الصور تجارب الخلية الواحدة عالية الإنتاجية.
تمت دراسة التعود في Stentor سابقا باستخدام الطرق التي وصفها Wood3 ، لكن هذا البروتوكول الجديد يسمح بأتمتة التجارب. لا تسمح الأتمتة للباحث بتقديم نبضات ميكانيكية لقوة وتردد محددين فحسب ، بل تسهل أيضا تجارب التعود طويلة المدى حيث يمكن ترك الجهاز يعمل دون إشراف لعدة أيام. علاوة على ذلك ، فإن استخدام محرك متدرج بدلا من الملف اللولبي المستخدم في تجارب وود3 يقلل من خطر إزالة المغناطيسية بمرور الوقت ويسمح أيضا بتغيير قوة التحفيز أثناء تجربة واحدة.
قد تكشف دراسة التعود الخلوي عن رؤى سريرية لحالات مثل اضطراب نقص الانتباه / فرط النشاط (ADHD) ومتلازمة توريت التي يضعف فيها التعود11. قد تكشف آليات تعويد الدعامة أيضا عن نماذج تعلم جديدة غير متشابكة مستقلة عن الدوائر الخلوية المعقدة. وأخيرا، يمكن أن تلهم الأفكار حول التعلم أحادي الخلية طرقا لإعادة برمجة الخلايا داخل الأنسجة متعددة الخلايا، وهي وسيلة محتملة أخرى لمكافحة المرض.

عادة ما يرتبط التعلم بجهاز عصبي معقد ، ولكن هناك أدلة متزايدة على أن الحياة على جميع المستويات ، وصولا إلى الخلايا المفردة ، يمكن أن تظهر سلوكيات ذكية. في كل من الأنظمة الطبيعية والاصطناعية ، التعلم هو التحديث التكيفي لمعلمات النظام بناء على المعلومات الجديدة1 ، والذكاء هو مقياس للعملية الحسابية التي تسهل التعلم2.
Stentor coeruleus هو كائن حي وحيد الخلية يعيش في البركة يظهر التعود ، وهو شكل من أشكال التعلم تنخفض فيه الاستجابة السلوكية بعد التحفيز المتكرر3. ينقبض Stentor استجابة للتحفيز الميكانيكي3 ، وهو استجابة هروب واضحة من الحيوانات المفترسة المائية. ومع ذلك ، فإن الاضطرابات المتكررة منخفضة القوة تحفز التعود ، كما يتضح من الانخفاض التدريجي في احتمال الانكماش3. لا يزال Stentor المعتاد ينقبض بعد تلقي التحفيز الميكانيكي عالي القوة4 أو التحفيز الفوتيكي5. تشير هذه الملاحظات ، التي تتوافق مع معايير طومسون وسبنسر الكلاسيكية للتعود في الحيوانات6 ، بقوة إلى أن انخفاض الاستجابة الانقباضية الأصلي يرجع إلى التعلم بدلا من التعب أو استنفاد ATP. كخلية حية حرة ، يمكن دراسة Stentor دون تدخل كبير من الخلايا المحيطة ، كما هو الحال في الأنسجة متعددة الخلايا. العديد من الميزات الإضافية تجعل Stentor نظاما قابلا للتتبع لدراسة التعلم: حجمه الكبير (1 مم) ، واستجابة التعود القابلة للقياسالكمي 3 ، وسهولة الحقن والمعالجة الدقيقة7 ، والجينومالمتسلسل بالكامل 8 ، وتوافر أدوات تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi)9. يتطلب استخدام هذا الكائن الحي النموذجي لاستكشاف التعلم الخلوي بدون دماغ أو جهاز عصبي إجراء قابل للتكرار لتحفيز خلايا Stentor وقياس الاستجابة.
هنا ، نقدم طريقة لقياس ارتياد Stentor باستخدام جهاز مرتبط بلوحة التحكم الدقيقة يمكنه توصيل نبضات ميكانيكية بقوة وتردد محددين ، بما في ذلك طرق بناء الجهاز وإعداد التجربة بطريقة تقلل من الاضطرابات الخارجية (الشكل 1). سيساعد فهم التعود على مستوى خلية واحدة في توصيف نماذج التعلم المستقلة عن الدوائر المعقدة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig01.jpg"> الشكل 1: إعداد تجربة التعود. يتم وضع لوحة Petri التي تحتوي على Stentor فوق المسطرة المعدنية المرنة لجهاز التعود. ثم يصطدم حديد التسليح لجهاز التعود بالمسطرة المعدنية بقوة وتردد محددين ، مما ينتج عنه موجة تحفيز عبر مجال الخلايا. تسجل كاميرا مجهر USB استجابات Stentor للتحفيز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig02.jpg"> الشكل 2: ملخص سير عمل تجربة التعود. يوضح الشكل الخطوات الأساسية التي تنطوي عليها دراسة Stentor باستخدام جهاز التعود. تم إنشاء الرقم مع BioRender.com. مقتبس من "مخطط انسيابي العملية" ، بواسطة BioRender.com (2022). تم الاسترجاع من https://app.biorender.com/biorender-templates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% Poly-ornithine&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Used to coat Petri plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Petri plate</td>
			<td>Benz Microscope Optics Center Inc.</td>
			<td>L331</td>
			<td>Contains Stentor during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>38016</td>
			<td>Used to wash Stentor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard, 4&#34; x 24&#34; x 1/2&#34; (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB424</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big easy driver stepper motor driver board (x1)</td>
			<td>Sparkfun</td>
			<td>ROB-12859</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Construction rail, 1&#34; x 5&#39;&#39; (x2)</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport CR-1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://www.apple.com/macbook-air-m1/</td>
			<td>Connect laptop to USB microscope to visualize experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large right-angle bracket (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90RL</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>A000066</td>
			<td>Used to control habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A&#160;84oz.in&#160;48mm 4-Lead&#160;</td>
			<td>Stepperonline.com</td>
			<td>5-17HS19-2004S1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized spring water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td>Media for Stentor experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize Stentor during wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>131598</td>
			<td>These are the cells used for habituation experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB microscope</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>44308</td>
			<td>Used to visualize and record experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcam recorder</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12</td>
			<td>Install this application to take videos of experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying habituation in stentor coeruleus

عادة ما يرتبط التعلم بجهاز عصبي معقد ، ولكن هناك أدلة متزايدة على أن الحياة على جميع المستويات ، وصولا إلى الخلايا المفردة ، يمكن أن تظهر سلوكيات ذكية. في كل من الأنظمة الطبيعية والاصطناعية ، التعلم هو التحديث التكيفي لمعلمات النظام بناء على معلومات جديدة ، والذكاء هو مقياس للعملية الحسابية التي تسهل التعلم. Stentor coeruleus هو كائن حي وحيد الخلية يعيش في البركة ويظهر التعود ، وهو شكل من أشكال التعلم تنخفض فيه الاستجابة السلوكية بعد التحفيز المتكرر. تتقلص الدعامة استجابة للتحفيز الميكانيكي ، وهي استجابة واضحة للهروب من الحيوانات المفترسة المائية. ومع ذلك ، فإن الاضطرابات المتكررة منخفضة القوة تحفز التعود ، كما يتضح من الانخفاض التدريجي في احتمال الانكماش. هنا ، نقدم طريقة لقياس ارتياد Stentor باستخدام جهاز مرتبط بلوحة التحكم الدقيقة يمكنه توصيل نبضات ميكانيكية بقوة وتردد محددين ، بما في ذلك طرق بناء الجهاز وإعداد التجربة بطريقة تقلل من الاضطرابات الخارجية. على عكس الأساليب الموصوفة سابقا لتحفيز Stentor ميكانيكيا ، يسمح هذا الجهاز بتغيير قوة التحفيز تحت تحكم الكمبيوتر أثناء تجربة واحدة ، مما يزيد بشكل كبير من تنوع تسلسلات الإدخال التي يمكن تطبيقها. سيساعد فهم التعود على مستوى خلية واحدة في توصيف نماذج التعلم المستقلة عن الدوائر المعقدة.

يجب أن تؤدي الطريقة الموضحة أعلاه ، باستخدام النبضة الميكانيكية من المستوى 4 بتردد 1 نقرة / دقيقة ، إلى انخفاض تدريجي في احتمال تقلص Stentor في غضون 1 ساعة. هذا يدل على التعود (انظر الشكل 6 ، الفيديو 2).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig06v2.jpg"> الشكل 6: التعود الأساسي. ينخفض احتمال تقلص Stentor تدريجيا على مدار 1 ساعة بعد تلقي نبضات ميكانيكية من المستوى 4 بتردد 1 نقرة / دقيقة (n = 22-27). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig06large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
فيديو 2. فيديو من ستينتور المعتادة. تتلقى الخلايا محفزا ميكانيكيا من المستوى 4 بعد 1 ساعة من تلقي نبضات ميكانيكية بنفس القوة بتردد 1 نقرة / دقيقة. اعتادت معظم الخلايا على المنبهات خلال الساعة ، وبالتالي لا تتقلص. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_2_JoVE.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
يمكن أن يؤدي تغيير قوة و / أو تردد توصيل النبض الميكانيكي إلى تغيير ديناميكيات التعود على Stentor . على سبيل المثال ، استخدام نبضة المستوى 2 بتردد 1 نقرة / دقيقة يمنع التعود على مدار 1 ساعة (انظر الشكل 7). يجب أن يؤدي نبض المستوى 5 إلى تقلصات في عدد قليل إلى صفر من Stentor.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig7v2.jpg"> الشكل 7: عدم التعود في غضون 1 ساعة لقوى أقوى. لا ينخفض احتمال انكماش Stentor بشكل ملحوظ على مدار ساعة واحدة بعد تلقي نبضات ميكانيكية من المستوى 2 بتردد 1 نقرة / دقيقة (n = 7-33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig07largev2.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

Studying Habituation in Stentor coeruleus

نقدم طريقة لقياس تعود Stentor باستخدام جهاز مرتبط بلوحة التحكم الدقيقة يمكنه توصيل نبضات ميكانيكية بقوة وتردد محددين. نقوم أيضا بتضمين طرق لتجميع الجهاز وإعداد التجربة بطريقة تقلل من الاضطرابات الخارجية.

دراسة التعود في Stentor coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display ...

ستساعد دراسة التعود على مستوى خلية واحدة في توصيف نماذج التعلم المستقلة عن الدوائر العصبية المعقدة مما يساعدنا على فهم أصول الذكاء. تسمح هذه التقنية بتغيير قوة وتواتر التحفيز الميكانيكي الذي يتم توصيله إلى الخلايا تحت التحكم التلقائي في الكمبيوتر وبالتالي زيادة تنوع تسلسلات الإدخال بشكل كبير. سيساعدنا استخدام هذه الطرق لدراسة التعود الخلوي على معرفة المزيد عن حالات مثل اضطراب فرط الحركة ونقص الانتباه ومتلازمة توريت التي يضعف فيها التعود.للبدء ، قم بتوصيل سائق المحرك بالمحرك عن طريق توصيل السلكين المسمى A من لوحة السائق بالأسلاك الزرقاء والحمراء على المحرك. ثم قم بتوصيل السلكين المكتوب عليهما B من لوحة السائق بالأسلاك الخضراء والسوداء على المحرك. بعد بناء دائرة اللوح بعناية خاصة لتوصيل مصابيح LED في القطبية الصحيحة ، قم بتوصيل VCC من لوحة السائق بالسكة العلوية للوح التجارب الأبيض.والأرض من لوحة السائق إلى السكة السفلية للوحة. بعد ذلك ، قم بتوصيل أرضية اللوح بدبوس الأرض للوحة المتحكم الدقيقة. ثم قم بتوصيل LED الأخضر و LED الأحمر وأسلاك التبديل والأزرار ، على التوالي بالمسامير الرقمية للوحة التحكم الدقيقة 8 و 9 و 10 و 11.قم بتوصيل المسامير الرقمية للوحة التحكم الدقيقة اثنين وثلاثة بأسلاك لوحة السائق والخطوة والاتجاه. ثم قم بتوصيل الدبوس أربعة ب MS1 ، وتثبيت خمسة ب MS2 ، ورقم التعريف الشخصي ب MS3 ، وتثبيت سبعة للتمكين. لتشغيل لوحة السائق ، قم بتوصيل مصدر 12 فولت بقابس المحول الأخضر الأسود ، المتصل بسلكين أحمرين بلوحة سائق المحرك.قم بتنزيل برنامج التحكم على لوحة التحكم الدقيقة. استخدم كبل USB لتوصيل لوحة المتحكم الدقيق بجهاز كمبيوتر ، والذي سيكون أيضا بمثابة مصدر طاقة للوحة المتحكم الدقيقة. بعد الحصول على Stentor ، قم بتغطية صفيحة 35 ملم بإضافة ثلاثة ملليلتر من محلول البولي أورنيثين 0.01٪ إلى اللوحة واتركها طوال الليل.اغسل الطبق مرتين بالماء عالي النقاء ومرة واحدة بمياه الينابيع المبسترة. ثم أضف 3.5 ملليلتر من مياه الينابيع المبسترة إلى لوحة 35 ملم. أضف ثلاثة ملليلتر من مياه الينابيع المبسترة إلى البئر الأول وخمسة ملليلتر إلى البئرين الثاني والثالث.باستخدام ماصة P1000 ، أضف ملليلتر من Stentor من طبق الاستزراع إلى البئر الأول من لوحة البئر الستة. حدد Stentor الفردي باستخدام مجهر ستيريو ثم استخدم ماصة P20 لنقل 100 Stentor من البئر الأول إلى البئر الثاني. وبالمثل ، بعد تحديد Stentor الفردي باستخدام مجهر ستيريو كما هو موضح سابقا ، قم بنقل 100 Stentor من البئر الثاني إلى البئر الثالث باستخدام ماصة P20.ثم باستخدام ماصة P200 ، انقل 100 Stentor بحجم إجمالي قدره 500 ميكرولتر ، من البئر الثالث من لوحة الآبار الستة إلى لوحة 35 ملم بحيث يكون الحجم النهائي أربعة ملليلتر. قم بلصق قطعة من الورق الأبيض على المسطرة المعدنية على جهاز التعود ، مع التأكد من أن الحافة اليسرى للورقة على بعد سنتيمترين من نهاية المسطرة الأقرب إلى المحرك. باستخدام شريط على الوجهين ، قم بتثبيت الجزء السفلي من اللوحة مقاس 35 ملم بمركز الورق ذي البوصة الاثنين فوق المسطرة على جهاز التعود.اترك لوحة 35 ملم على جهاز التعود لمدة ساعتين على الأقل مع إغلاق الغطاء. قم بتوسيط كاميرا مجهر USB مباشرة فوق لوحة 35 ملم من Stentor. لتثبيت تطبيق مسجل كاميرا الويب ، افتح تطبيق مسجل كاميرا الويب وحدد مجهر USB من القائمة المنسدلة.اضبط التركيز على كاميرا مجهر USB بحيث تكون الخلايا في العرض بوضوح وموضع الكاميرا لزيادة عدد الخلايا في مجال الرؤية إلى أقصى حد. بعد فتح الشاشة التسلسلية للوحة التحكم الدقيق ، حدد عدم إنهاء الخط"واضبطه على 9،600 باود. استخدم الأمر L في برنامج لوحة التحكم الدقيق لخفض المحرك حتى يلمس المسطرة بالكاد والأمر R لرفع الذراع إذا لزم الأمر لضبط الموضع الدقيق.استخدم الأمر I لتهيئة الوضع التلقائي على جهاز التعود. أدخل حجم الخطوات والوقت بين النبضات بالدقائق في سطر الأوامر. ابدأ في التقاط مقطع فيديو باستخدام تطبيق مسجل كاميرا الويب بالضغط على زر التسجيل الأحمر.ثم اقلب المفتاح على جهاز التعود لبدء التجربة مع أول توصيل نبض ميكانيكي آلي. مباشرة قبل ظهور النبضة الميكانيكية الأولى على الفيديو ، توقف مؤقتا واحسب عدد Stentor المثبتة في الجزء السفلي من اللوحة 35 ملم والممتدة في شكل ممدود يشبه البوق. وبالمثل ، بعد النبضة الأولى ، احسب عدد Stentor المثبتة في أسفل اللوحة وتقلصت في شكل يشبه الكرة.اقسم العد الثاني على العد الأول لتحديد جزء Stentor الذي انكمش استجابة للمثير الميكانيكي ، مع تكرار الإجراء لجميع النبضات الميكانيكية في التجربة. تمت مراقبة احتمال تقلص Stentor وأظهرت النتائج أنه ينخفض تدريجيا على مدار ساعة واحدة. بعد تلقي نبضات ميكانيكية من المستوى الرابع بتردد نقرة واحدة في الدقيقة ، مما يشير إلى التعود.يمكن أن يؤدي تغيير قوة أو تردد توصيل النبض الميكانيكي إلى تغيير ديناميكيات التعود على Stentor. أثناء استخدام مجموعة نبضات المستوى الثاني من التردد بنقرة واحدة في الدقيقة ، يمنع التعود على مدار ساعة واحدة. يمكننا دراسة أنواع مختلفة من ديناميكيات التعود عن طريق تغيير قوة وتواتر التحفيز الميكانيكي.هذه فرصة لاستكشاف أنواع مختلفة من التعلم ، مثل التوعية. يمكن للرؤى الكمية حول التعلم أحادي الخلية ، المستقاة من أساليبنا ، أن تلهم طرقا أخرى لإعادة برمجة الخلايا داخل الأنسجة متعددة الخلايا. طريقة أخرى محتملة لمكافحة المرض.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

دراسة العدوان في ذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

نافذة على المجهري : نظم ميكروفلويديك بسيطة لدراسة النقل في وسائل الإعلام الميكروبية المسامية

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

دراسة الحمض النووي عن طريق حلقات جزيء واحد الحنق

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

نموذج في المختبر لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

دراسة الميتوكوندريا هيكل وظيفة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المبايض

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...