Name: studying habituation in stentor coeruleus
Uploaded: 2023-01-06T13:45:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

אנו מודים לטטיאנה מקושוק על אינספור דיונים על למידת סטנטור . עבודה זו מומנה על ידי מענק NSF MCB- 2012647 ועל ידי מענק NIH R35 GM130327, כמו גם על ידי פרס I2CELL מקרן פורמנטין-גילברט.

הערה: סיכום של זרימת העבודה של ניסוי ההרגלה מוצג באיור 2.
1. הרכבת מכשיר ההרגלה
<ol><li>חברו את נהג המנוע למנוע ( ראו איור 3).<ol><li>חבר את שני החוטים המסומנים A מלוח הנהג לחוטים הכחולים והאדומים במנוע. חבר את שני החוטים המסומנים B מלוח הנהג לחוטים הירוקים והשחורים במנוע. הערה: במבט למטה על לוח הנהג מלמעלה עם חוטי המנוע בחלק העליון, ארבעת חוטי הכניסה צריכים להתחבר למוליכי המנוע בסדר זה: כחול, אדום, שחור וירוק.</li>
	</ol></li>
	<li>בנו את מעגל לוח הלחם שמוצג באיור 4, תוך הקפדה מיוחדת על חיבור נוריות ה-LED בקוטביות הנכונה.</li>
	<li>חבר את ה-Vcc (+5 V) מלוח הנהג למסילה העליונה של לוח הלחם הלבן ואת ה-Gnd מלוח הנהג למסילה התחתונה של לוח הלחם.</li>
	<li>חבר את הקרקע של לוח הלחם לסיכת ההארקה של לוח המיקרו-בקר. חבר את חוטי ה-LED הירוקים, הנורית האדומה, המתג והכפתור, בהתאמה, לפינים הדיגיטליים של לוח המיקרו-בקרים 8, 9, 10 ו-11.</li>
	<li>חבר את הפינים הדיגיטליים של לוח המיקרו-בקר 2 ו-3 לחוטי לוח הנהג Step ו-Dir.</li>
	<li>חבר את הפינים הדיגיטליים של לוח המיקרו-בקר 4, 5, 6 ו-7 לחוטי לוח הנהג.<ol><li>חבר את פין 4 ל- MS1, חבר את פין 5 ל- MS2, חבר את פין 6 ל- MS3 וחבר את פין 7 כדי להפוך לזמין.</li>
	</ol></li>
	<li>הפעל את לוח הנהג באמצעות ספק כוח של 12 וולט. חבר את אספקת ה- 12 V לתקע המתאם השחור/ירוק המחובר באמצעות שני חוטים אדומים ללוח הנהג של המנוע. הערה: אל תחבר את אספקת ה-12 וולט לתקע לוח המיקרו-בקרים.</li>
	<li>הורד את תוכנית הבקרה (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) ללוח המיקרו-בקרים.</li>
	<li>השתמש בכבל USB כדי לחבר את לוח המיקרו-בקר למחשב, שישמש גם כמקור החשמל של לוח המיקרו-בקרים.</li>
	<li>ודא שפקדי המשתמש פועלים.<ol><li>ודא שמתג השקופית מפעיל ומכבה את המצב האוטומטי. במצב אוטומטי, המערכת תנקוט צעד במרווחי זמן קבועים שצוינו על ידי המשתמש (ראה להלן).</li>
		<li>ודא שהנורית הירוקה נדלקת כאשר המצב האוטומטי מופעל.</li>
		<li>בדוק שהנורית האדומה מהבהבת 1 שניות לפני שהמנוע מפעיל דופק. נורית האזהרה האדומה היא נורת אזהרה המציינת מתי המערכת עומדת לספק פולס מכני.</li>
		<li>בדוק את הלחצן האדום, שמפעיל צעד של 1/16 מיקרו בכל פעם שלוחצים על הלחצן, ללא קשר לשאלה אם המערכת נמצאת במצב אוטומטי.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig03.jpg"> איור 3: מרכיבי מכשיר ההרגלה. כל האלקטרוניקה המסומנת נדרשת להרכבת המכונה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig04.jpg"> איור 4: סכמת אלקטרוניקה. זהו המעגל על לוח הלחם. החוטים המתחברים ללוח המיקרו-בקר ממוספרים כמתואר בפרוטוקול. D1 ו-D2 הן נוריות LED אדומות וירוקות, בהתאמה, ומחוברות לקרקע באמצעות 330 נגדי Ω. שני המתגים נמשכים למעלה עם 10 נגדי KΩ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
2. הגדרת ניסוי ההרגלה
<ol><li>השג סטנטור.</li>
	<li>מצפים צלחת 35 מ"מ עם תמיסת פולי-אורניתין 0.01%.<ol><li>מוסיפים 3 מ"ל של תמיסה פולי-אורניתין 0.01% לצלחת ולהשאיר לילה.</li>
		<li>שטפו את הצלחת פעמיים במים טהורים במיוחד ופעם אחת במי מעיין מפוסטרים (PSW) (טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
	<li>הוסף 3.5 מ"ל של PSW לצלחת 35 מ"מ.</li>
	<li>שוטפים את הסטנטור בצלחת 6 בארות (טבלת חומרים).<ol><li>הוסף 3 מ"ל של PSW לבאר הראשונה ו -5 מ"ל של PSW לבאר השנייה והשלישית. השתמשו בפיפטה P1,000 כדי להוסיף 2 מ"ל של סטנטור מצלחת תרבית לבאר הראשונה של צלחת 6 הבארות.</li>
		<li>זהה סטנטור בודד באמצעות מיקרוסקופ סטריאו (טבלת חומרים) ולאחר מכן השתמש בפיפטה P20 כדי להעביר 100 סטנטור מהבאר הראשונה לבאר השנייה.</li>
		<li>זהה סטנטור בודד באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ולאחר מכן השתמש בפיפטה P20 כדי להעביר 100 סטנטור מהבאר השנייה לבאר השלישית.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בפיפטה P200 כדי להעביר 100 סטנטור בנפח כולל של 500 μL מהבאר השלישית של צלחת 6 בארות לתוך צלחת 35 מ"מ כך שהנפח הסופי בלוח 35 מ"מ הוא 4 מ"ל.</li>
	<li>הדבק חתיכה (7 ס"מ x 7 ס"מ) של נייר לבן על סרגל המתכת בהתקן ההרגלה. ודא שהקצה השמאלי של הנייר נמצא במרחק של 2 ס"מ מקצה הסרגל הקרוב ביותר לארמטורה.</li>
	<li>השתמש בקלטת דו-צדדית כדי להדביק את החלק התחתון של לוח 35 מ"מ למרכז ה-2 אינץ' x 2 בנייר על גבי הסרגל בהתקן ההרגלה.</li>
	<li>השאירו את צלחת ה-35 מ"מ על מכשיר ההרגלה למשך שעתיים לפחות (ניתן להאריך זאת ללילה) כשהמכסה סגור. לאורך כל תקופת ההתאקלמות הזו, יש לשמור על הלוח בתנאי אור סביבה התואמים את תנאי האור הניסיוניים (כלומר, אין להכפיף את התאים לתנודות אור/חושך). יתר על כן, ודא כי הצלחת אינה חווה הפרעות מכניות כלשהן כתוצאה מריצה מקרית.</li>
	<li>מרכזו את מצלמת המיקרוסקופ USB (Table of Materials) ישירות מעל צלחת 35 מ"מ של Stentor. במידת הצורך, הנח אביזר כגון תיבת קצה פיפטה מתחת למצלמת המיקרוסקופ של אפיק טורי אוניברסלי (USB) כדי לכוונן את הגובה. לחלופין, ניתן להשתמש במעמד טבעת כדי לכוונן את הגובה.</li>
	<li>התקן את יישום מקליט מצלמות הרשת במחשב נייד (טבלת חומרים) והשתמש בו כדי לדמיין את התאים באמצעות קלט המיקרוסקופ.<ol><li>פתח את אפליקציית מקליט מצלמות הרשת ובחר את מיקרוסקופ ה- USB מהתפריט הנפתח. כוונן את המיקוד במצלמת מיקרוסקופ USB כך שהתאים ייראו בבירור.</li>
		<li>התאם את המיקום של מצלמת מיקרוסקופ USB כדי למקסם את מספר התאים בשדה הראייה.</li>
	</ol></li>
	<li>פתח את הצג הטורי של לוח המיקרו-בקר: בחר No Line Ending והגדר אותו ל-9,600 באוד.</li>
	<li>השתמש בפקודה l בתוכנית לוח המיקרו-בקר כדי להוריד את הזרוע עד שהיא בקושי נוגעת בסרגל. השתמש בפקודה r כדי להרים את הזרוע במידת הצורך כדי להתאים את המיקום המדויק. הערה: אם הזרוע נמצאת במרחק משמעותי מהסרגל, הקלד את הפקודה d כדי להשבית את זרם סליל המנוע כך שניתן יהיה להזיז את הזרוע באופן ידני לכיוון הסרגל. לאחר הזזת הזרוע באופן ידני, השתמש בפקודה e כדי להפעיל את זרם סליל המנוע ולשמור על הזרוע נעולה במקומה. כאשר מורידים כראוי לפני תחילת הניסוי, הקצה התחתון של הארמטורה צריך להיות במרחק של 1 ס"מ מהקצה השמאלי של הסרגל. הארמטורה תעביר את הדופק המכני על ידי פגיעה בסרגל.</li>
	<li>השתמש בפקודה i כדי לאתחל את המצב האוטומטי בהתקן ההרגלה.</li>
	<li>הזן את גודל הצעד בשורת הפקודה. רמה 5 היא הצעד הקטן ביותר, ורמה 1 היא הצעד הגדול ביותר. רמה 4 היא גודל הצעד המשמש לניסויי הרגלה בסיסיים. הערה: גירוי ברמה 5 גורם לתזוזה כלפי מטה של הסרגל ב~0.5 מ"מ; רמה 4 גורמת לתזוזה כלפי מטה ב~1 מ"מ; רמה 3 גורמת לתזוזה כלפי מטה ב~ 2 מ"מ; רמה 2 גורמת לתזוזה כלפי מטה על ידי ~ 3-4 מ"מ; ורמה 1 גורמת לתזוזה כלפי מטה ב~8 מ"מ. גירוי רמה 5 גורם לכוח שיא כלפי מטה של הארמטורה כנגד הסרגל של ~0.122 N; רמה 4 מביאה לכוח שיא כלפי מטה של ~0.288 N; ורמה 3 מביאה לכוח שיא כלפי מטה של ~0.557 N. את הכוחות כלפי מטה הנוצרים על ידי רמה 1 ורמה 2 קשה יותר לכמת באופן אמפירי עם דינמומטר בשל תנודות הסרגל המשמעותיות המתרחשות לאחר שהארמטורה יוצרת מגע.</li>
	<li>הזן את הזמן בין פולסים תוך דקות. המרווח המשמש לניסויי הרגלה בסיסיים הוא דקה אחת.</li>
	<li>התחל לצלם סרטון באמצעות אפליקציית מקליט מצלמות הרשת על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה האדום. לאחר מכן, הפוך את המתג על מנגנון ההרגלה כדי להתחיל את הניסוי עם אספקת הדופק המכנית האוטומטית הראשונה.</li>
</ol>3. ניתוח סרטון הניסוי
<ol><li>מיד לפני שהפולס המכני הראשון מופיע בסרטון, השהו וספרו את מספר הסטנטור ששניהם מעוגנים לתחתית לוחית ה-35 מ"מ ומורחבים בצורה מוארכת דמוית חצוצרה (איור 5A, וידאו 1).</li>
	<li>מיד לאחר הפעימה הראשונה, ספרו את מספר הסטנטורים ששניהם מעוגנים לתחתית הצלחת ומתכווצים לצורה דמוית כדור (איור 5B, וידאו 1). הערה: ניתן להבחין בקלות בתאים מתכווצים מתאים מוארכים מכיוון שסטנטור מקצר את אורך גופם ביותר מ-50% בתוך 10 אלפיות השנייה במהלך אירוע כיווץ3.</li>
	<li>חלק את הספירה השנייה בספירה הראשונה כדי לקבוע את החלק של סטנטור שהתכווץ בתגובה לגירוי המכני.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.1-3.3 עבור כל הפולסים המכניים בסרטון הניסוי.</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig05.jpg"> איור 5: סטנטור מתכווץ לאחר קבלת גירוי מכני . (A) הסטנטור נמצאים במצבם המוארך ומעוגנים לתחתית לוח פטרי. (B) הסטנטור התכווץ לאחר שקיבל גירוי מכני ברמה 4 ממכשיר ההרגלה. התמונות צולמו במיקרוסקופ USB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
סרטון 1: סרטון של התכווצות סטנטור. הסטנטור מקבלים גירוי מכני ברמה 4 ממכשיר ההרגלה בכל דקה. תאים אלה עדיין לא התרגלו, ולכן הם מתכווצים לאחר קבלת הדופק. התאים נמצאים בצלחת פטרי הממוקמת על גבי מכשיר ההרגלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_1_JoVE.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.</a>

<ol>
	<li>Dussutour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+single+cell+organisms.">Learning in single cell organisms.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).</li><li>Sternberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intelligence.">Intelligence.</a> Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parametric+studies+of+the+response+decrement+produced+by+mechanical+stimuli+in+the+protozoan,+Stentor+coeruleus.">Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus.</a> Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+learning.">Cell learning.</a> Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specific+habituation+in+a+protozoan.">Stimulus specific habituation in a protozoan.</a> Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).</li><li>Thompson, R. F., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation:+A+model+phenomenon+for+the+study+of+neuronal+substrates+of+behavior.">Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior.</a> Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).</li><li>Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stentor+coeruleus.">Stentor coeruleus.</a> Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).</li><li>McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+is+altered+in+neuropsychiatric+disorders-A+comprehensive+review+with+recommendations+for+experimental+design+and+analysis.">Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול מתייחסים להבטיח כי Stentor להישאר בתנאים אופטימליים עבור התכווצויות להתרחש. תגובת הכיווץ במבחן ההרגלה דורשת שהסטנטורים יהיו מעוגנים למשטח באמצעות האחיזה הדביקה שלהם מכיוון שהם כמעט ולא מתכווצים כשהם שוחים בחופשיות. עם זאת, המשטח התחתון של צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ המשמשת לניסויים בהרגלה אינו תורם בדרך כלל לעיגון אלא אם כן הוא מצופה בפולי-אורניתין. יתר על כן, לא ניתן לחשוף את הסטנטור להפרעה מכנית כלשהי למשך שעתיים לפחות לפני תחילת ניסוי ההרגלה מכיוון שציר הזמן של השכחה של סטנטור הוא 2-6 שעות3. אם סטנטור יקבל גירוי מכני תוך שעתיים משעת ההתחלה של ניסוי ההרגלה, קיימת אפשרות שגירוי מוקדם זה יגרום לרמה קלה של הרגלה לפני הניסוי, ובכך יפחית את הסתברות ההתכווצות לאחר שמכשיר ההרגלה יספק את הפולס המכני הראשון. לבסוף, בשלב הניתוח, חשוב לספור רק את מספר הסטנטור המתכווץ לאחר הדופק - ולא התכווצויות ספונטניות מקריות המתרחשות לפני מסירת הדופק - כדי לקבל קריאה מדויקת של חלק התאים שהתכווץ בתגובה לגירוי המכני.
ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לחקור סוגים שונים של דינמיקת הרגלה על ידי שינוי הכוח והתדירות של הפולסים המכניים המועברים על ידי מכשיר ההרגלה. זה גם מספק הזדמנות לחקור סוגים אחרים של למידה, כגון רגישות, שעשויים להתרחש ב - Stentor. ניתן גם להתאים את קוד התוכנית של לוח המיקרו-בקר עצמו כדי לספק תבניות שונות של ברזים מכניים ל-Stentor.
בעיה פוטנציאלית אחת לפתרון בעיות בפרוטוקול זה היא התדירות הנמוכה של עיגון סטנטור , מה שעלול להגביל את מספר הסטנטור שניתן לראות בניסוי ההרגלה. תדירות העיגון מופחתת לעיתים בתרביות סטנטור שלא הוזנו לאחרונה או מזוהמות. כדי לטפל בבעיה זו, יש לשטוף אצווה חדשה של סטנטור כדי להתחיל תרבות חדשה ולהאכיל אותם באופן קבוע על פי הפרוטוקול המתואר ב Lin et al.10.
פרוטוקול זה מוגבל בכך שניתן לבדוק רק צלחת אחת של סטנטור בכל פעם, וכתוצאה מכך מדידות תפוקה נמוכות יחסית. יתר על כן, התוכנה הנוכחית אינה מאפשרת אוטומציה של ניתוח תמונה של תא בודד. רוב הנתונים הנרכשים הם, אם כן, ברמת האוכלוסייה. מודלים עתידיים של מכשיר ההרגלה וכלי ניתוח תמונה עשויים להקל על ניסויים חד-תאיים בעלי תפוקה גבוהה.
ההרגלה בסטנטור נחקרה בעבר בשיטות שתוארו על ידי Wood3, אך פרוטוקול חדש זה מאפשר להפוך את הניסויים לאוטומטיים. אוטומציה לא רק מאפשרת לחוקר לספק פולסים מכניים של כוח ותדר מוגדרים, אלא גם מאפשרת ניסויי הרגלה ארוכי טווח מכיוון שניתן להשאיר את המכשיר פועל ללא פיקוח במשך ימים. יתר על כן, שימוש במנוע צעד ולא בסולנואיד המשמש בניסויים של ווד3 מפחית את הסיכון לדמגנטיזציה לאורך זמן וגם מאפשר לגוון את עוצמת הגירוי במהלך ניסוי יחיד.
חקר הרגלי התאים עשוי לחשוף תובנות קליניות לגבי מצבים כמו הפרעת קשב וריכוז (ADHD) ותסמונת טורט שבה ההרגלה נפגעת11. מנגנוני הרגלת סטנטור עשויים גם לחשוף פרדיגמות למידה לא-סינפטיות חדשות, ללא תלות במעגלים תאיים מורכבים. לבסוף, תובנות על למידה חד-תאית עשויות להוות השראה לשיטות לתכנות מחדש של תאים בתוך רקמות רב-תאיות - אפיק פוטנציאלי נוסף להילחם במחלות.

למידה קשורה בדרך כלל למערכת עצבים מורכבת, אך יש ראיות הולכות וגוברות לכך שחיים בכל הרמות, עד לתאים בודדים, יכולים להציג התנהגויות אינטליגנטיות. במערכות טבעיות ומלאכותיות כאחד, למידה היא עדכון מסתגל של פרמטרים במערכת המבוססים על מידע חדש1, ואינטליגנציה היא מדד לתהליך החישובי המאפשר למידה2.
Stentor coeruleus הוא אורגניזם חד-תאי השוכן בבריכה המציג הרגלה, סוג של למידה שבה התגובה ההתנהגותית פוחתת בעקבות גירוי חוזר3. סטנטור מתכווץ בתגובה לגירוי מכני3, שהוא תגובת בריחה לכאורה מטורפים ימיים. עם זאת, הפרעות חוזרות ונשנות בכוח נמוך גורמות להרגלה, המודגמת על ידי הפחתה הדרגתית בהסתברות ההתכווצות3. הסטנטור המורגל עדיין מתכווץ לאחר שקיבל גירוי מכני בעוצמה גבוהה4 או גירוי פוטי5. תצפיות אלה, המתיישבות עם הקריטריונים הקלאסיים של תומפסון וספנסר להתרגלות בבעלי חיים6, מצביעות על כך שתגובת ההתכווצות המקורית נובעת מלמידה ולא מעייפות או מדלדול ATP. כתא חי חופשי, ניתן לחקור את סטנטור ללא הפרעות רבות מהתאים הסובבים אותו, כפי שקורה ברקמה רב-תאית. מספר תכונות נוספות הופכות את Stentor למערכת ניתנת למתיחה לחקר למידה: גודלה הגדול (1 מ"מ), תגובת ההרגלה הניתנת לכימותשלה 3, קלות ההזרקה והמיקרומניפולציה7, הגנוםהמרוצף במלואו 8, והזמינות של כלי הפרעת RNA (RNAi)9. שימוש באורגניזם מודל זה כדי לחקור למידת תאים ללא מוח או מערכת עצבים דורש הליך הניתן לשחזור לגירוי תאי סטנטור ומדידת התגובה.
כאן אנו מציגים שיטה לכימות הרגלת סטנטור באמצעות מנגנון המחובר ללוח מיקרו-בקר שיכול לספק פולסים מכניים בעוצמה ובתדר מוגדרים, כולל שיטות לבניית המנגנון והגדרת הניסוי באופן שממזער הפרעות חיצוניות (איור 1). הבנת ההרגלה ברמה של תא בודד תסייע לאפיין פרדיגמות למידה שאינן תלויות במעגלים מורכבים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig01.jpg"> איור 1: הגדרת ניסוי הרגלה. לוחית הפטרי המכילה סטנטור ממוקמת על גבי סרגל המתכת הגמיש של מכשיר ההרגלה. לאחר מכן, הארמטורה של מכשיר ההרגלה פוגעת בסרגל המתכת בכוח ובתדר מוגדרים, ומייצרת גל גירוי על פני שדה התאים. מצלמת המיקרוסקופ USB מתעדת את תגובות הסטנטור לגירוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig02.jpg"> איור 2: סיכום של זרימת העבודה של ניסוי ההרגלה. האיור מציג את השלבים הבסיסיים הכרוכים בחקר סטנטור באמצעות מכשיר ההרגלה. הדמות נוצרה עם BioRender.com. מעובד מתוך "תרשים זרימה תהליך", על ידי BioRender.com (2022). אוחזר מתוך https://app.biorender.com/biorender-templates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% Poly-ornithine&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Used to coat Petri plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Petri plate</td>
			<td>Benz Microscope Optics Center Inc.</td>
			<td>L331</td>
			<td>Contains Stentor during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>38016</td>
			<td>Used to wash Stentor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard, 4&#34; x 24&#34; x 1/2&#34; (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB424</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big easy driver stepper motor driver board (x1)</td>
			<td>Sparkfun</td>
			<td>ROB-12859</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Construction rail, 1&#34; x 5&#39;&#39; (x2)</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport CR-1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://www.apple.com/macbook-air-m1/</td>
			<td>Connect laptop to USB microscope to visualize experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large right-angle bracket (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90RL</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>A000066</td>
			<td>Used to control habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A&#160;84oz.in&#160;48mm 4-Lead&#160;</td>
			<td>Stepperonline.com</td>
			<td>5-17HS19-2004S1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized spring water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td>Media for Stentor experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize Stentor during wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>131598</td>
			<td>These are the cells used for habituation experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB microscope</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>44308</td>
			<td>Used to visualize and record experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcam recorder</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12</td>
			<td>Install this application to take videos of experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying habituation in stentor coeruleus

למידה קשורה בדרך כלל למערכת עצבים מורכבת, אך יש ראיות הולכות וגוברות לכך שחיים בכל הרמות, עד לתאים בודדים, יכולים להציג התנהגויות אינטליגנטיות. במערכות טבעיות ומלאכותיות כאחד, למידה היא עדכון מסתגל של פרמטרים במערכת המבוססים על מידע חדש, ואינטליגנציה היא מדד לתהליך החישובי המאפשר למידה. Stentor coeruleus הוא אורגניזם חד-תאי השוכן בבריכה המציג הרגלה, סוג של למידה שבה התגובה ההתנהגותית פוחתת בעקבות גירוי חוזר. סטנטור מתכווץ בתגובה לגירוי מכני, שהוא תגובת בריחה לכאורה של טורפים ימיים. עם זאת, הפרעות חוזרות ונשנות בכוח נמוך גורמות להרגלה, המודגמת על ידי הפחתה הדרגתית בהסתברות ההתכווצות. כאן אנו מציגים שיטה לכימות הרגלת סטנטור באמצעות מנגנון מיקרו-בקרים המקושר ללוח שיכול לספק פולסים מכניים בעוצמה ובתדר מוגדרים, כולל שיטות לבניית המנגנון והגדרת הניסוי באופן שממזער הפרעות חיצוניות. בניגוד לגישות שתוארו לעיל לגירוי מכני של סטנטור, מכשיר זה מאפשר לכוח הגירוי להיות מגוון תחת בקרת מחשב במהלך ניסוי יחיד, ובכך להגדיל מאוד את מגוון רצפי הקלט שניתן ליישם. הבנת ההרגלה ברמה של תא בודד תסייע לאפיין פרדיגמות למידה שאינן תלויות במעגלים מורכבים.

השיטה שתוארה לעיל, תוך שימוש בפולס המכני ברמה 4 בתדירות של הקשה אחת לדקה, אמורה לגרום להפחתה הדרגתית בהסתברות ההתכווצות של הסטנטור תוך שעה. זה מעיד על הרגלה ( ראו איור 6, וידאו 2).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig06v2.jpg"> איור 6: הרגל בסיסית. הסתברות ההתכווצות של סטנטור יורדת בהדרגה במשך שעה לאחר קבלת פולסים מכניים ברמה 4 בתדירות של 1 ברז/דקה (n = 22-27). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
וידאו 2. וידאו של סטנטור רגיל. התאים מקבלים גירוי מכני ברמה 4 לאחר שעה אחת של קבלת פולסים מכניים באותו כוח בתדר של 1 הקשה לדקה. רוב התאים התרגלו לגירויים במהלך השעה, ולכן אינם מתכווצים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_2_JoVE.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.</a>
שינוי הכוח ו/או התדירות של העברת הפולס המכני יכול לשנות את דינמיקת ההרגלה של סטנטור . לדוגמה, שימוש בפעימה ברמה 2 בתדירות של הקשה אחת לדקה מונע הרגלה במשך שעה אחת ( ראו איור 7). פולס רמה 5 אמור לעורר התכווצויות אצל מעטים עד אפס סטנטור.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig7v2.jpg"> איור 7: חוסר התרגלות תוך שעה אחת לכוחות חזקים יותר. הסתברות ההתכווצות של סטנטור אינה יורדת באופן ניכר במשך שעה אחת לאחר קבלת פולסים מכניים ברמה 2 בתדירות של 1 ברז/דקה (n = 7-33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig07largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

Studying Habituation in Stentor coeruleus

אנו מציגים שיטה לכימות הרגלת סטנטור באמצעות מנגנון מיקרו-בקרים המקושר ללוח שיכול לספק פולסים מכניים בכוח ובתדר מוגדרים. אנו כוללים גם שיטות להרכבת המנגנון והגדרת הניסוי באופן שימזער הפרעות חיצוניות.

לימוד הרגלה בסטנטור קורולוס

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display ...

לימוד הרגלה ברמה של תא בודד יעזור לאפיין פרדיגמות למידה שאינן תלויות במעגלים עצביים מורכבים ובכך יעזור לנו להבין את מקורות האינטליגנציה. טכניקה זו מאפשרת לכוח ולתדירות של גירוי מכני המועבר לתאים להיות מגוונים תחת בקרת מחשב אוטומטית ובכך להגדיל מאוד את מגוון רצפי הקלט. שימוש בשיטות אלה כדי לחקור את ההרגלה התאית יעזור לנו ללמוד יותר על מצבים כמו ADHD ותסמונת טורט שבהם ההרגלה נפגעת.כדי להתחיל, חבר את נהג המנוע למנוע על ידי חיבור שני החוטים המסומנים A מלוח הנהג לחוטים הכחולים והאדומים על המנוע. לאחר מכן חבר את שני החוטים המסומנים B מלוח הנהג לחוטים הירוקים והשחורים במנוע. לאחר בניית מעגל לוח הלחם בזהירות מיוחדת לחיבור נוריות ה- LED בקוטביות הנכונה, חבר את ה- VCC מלוח הנהג למסילה העליונה של לוח הלחם הלבן.והקרקע מלוח הנהג למעקה התחתון של לוח הלחם. לאחר מכן, חבר את הקרקע של לוח הלחם לסיכת הקרקע של לוח המיקרו-בקר. לאחר מכן חבר את חוטי ה- LED הירוקים, הנורית האדומה, המתגים והכפתורים, בהתאמה לפינים הדיגיטליים של לוח המיקרו-בקר 8, 9, 10 ו- 11.חבר את הפינים הדיגיטליים של לוח המיקרו-בקר שניים ושלושה לחוטי לוח הנהג, צעד וכיוון. לאחר מכן חבר את פין ארבע ל- MS1, הצמד חמש ל- MS2, ה- PIN שש ל- MS3 והצמד שבע כדי להפעיל. כדי להפעיל את לוח הנהג, חבר את אספקת 12 וולט לתקע המתאם הירוק השחור, המחובר באמצעות שני חוטים אדומים ללוח מנהל ההתקן של המנוע.הורד את תוכנית הבקרה ללוח בקר המיקרו. השתמש בכבל USB כדי לחבר את לוח המיקרו-בקר למחשב, שישמש גם כמקור החשמל של לוח המיקרו-בקרים. לאחר קבלת Stentor, מצפים צלחת 35 מילימטר על ידי הוספת שלושה מיליליטר של תמיסה 0.01% polyornithine לצלחת ולהשאיר לילה.שטפו את הצלחת פעמיים במים אולטרה-טהורים ופעם אחת במי מעיין מפוסטרים. לאחר מכן מוסיפים 3.5 מיליליטר של מי מעיין מפוסטרים לצלחת 35 מילימטר. הוסף שלושה מיליליטר של מי מעיין מפוסטרים לבאר הראשונה וחמישה מיליליטר לבאר השנייה והשלישית.באמצעות פיפטה P1000, הוסף שני מיליליטר של סטנטור מצלחת תרבית לבאר הראשונה מבין שש צלחות הבאר. זהה סטנטור בודד באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ולאחר מכן השתמש בפיפטה P20 כדי להעביר 100 סטנטור מהבאר הראשונה לבאר השנייה. באופן דומה, לאחר זיהוי סטנטור בודד באמצעות מיקרוסקופ סטריאו כפי שהוכח קודם לכן, העבר 100 סטנטור מהבאר השנייה לבאר השלישית באמצעות פיפטה P20.לאחר מכן באמצעות פיפטה P200, להעביר 100 Stentor בנפח כולל של 500 microliters, מן הבאר השלישית של שש צלחת הבאר לתוך צלחת 35 מילימטר כך נפח הסופי הוא ארבעה מיליליטר. הדבק פיסת נייר לבן לסרגל המתכת בהתקן ההרגלה, כדי להבטיח שהקצה השמאלי של הנייר נמצא שני סנטימטרים מקצה הסרגל הקרוב ביותר לארמטורה. באמצעות סרט הדבקה דו-צדדי, הדביקו את החלק התחתון של לוח ה-35 מילימטר למרכז השניים על ידי שני אינץ' נייר על גבי הסרגל בהתקן ההרגול.השאירו את צלחת 35 המילימטר על מכשיר ההרגלה למשך שעתיים לפחות כשהמכסה סגור. מרכז את מצלמת המיקרוסקופ USB ישירות מעל צלחת 35 מילימטר של Stentor. כדי להתקין את יישום מקליט מצלמות הרשת, פתח את אפליקציית מקליט מצלמות הרשת ובחר את מיקרוסקופ ה- USB מהתפריט הנפתח.כוונן את המיקוד במצלמת מיקרוסקופ USB כך שהתאים יהיו בתצוגה ברורה ואת מיקום המצלמה כדי למקסם את מספר התאים בשדה הראייה. לאחר פתיחת הצג הטורי של לוח המיקרו-בקרים, בחר ללא סיום קו"והגדר אותו ל-9, 600 באוד. השתמש בפקודת L בתוכנית לוח המיקרו-בקר כדי להוריד את הזרוע עד שהיא בקושי נוגעת בסרגל ובפקודה R כדי להרים את הזרוע במידת הצורך כדי להתאים את המיקום המדויק.השתמש בפקודה I כדי לאתחל את המצב האוטומטי בהתקן ההרגלה. הזן את גודל הצעדים והזמן בין פולסים בדקות בשורת הפקודה. התחל לצלם סרטון באמצעות אפליקציית מקליט מצלמות הרשת על ידי לחיצה על כפתור ההקלטה האדום.לאחר מכן הפוך את המתג על מנגנון ההרגלה כדי להתחיל את הניסוי עם אספקת הדופק המכנית האוטומטית הראשונה. מיד לפני שהדופק המכני הראשון מופיע בסרטון, השהו וספרו את מספר הסטנטור ששניהם מעוגנים לתחתית הלוח בקוטר 35 מילימטר ומורחבים בצורה מוארכת דמוית חצוצרה. באופן דומה, לאחר הפעימה הראשונה, ספרו את מספר הסטנטור ששניהם מעוגנים לתחתית הצלחת ומתכווצים לצורה דמוית כדור.חלקו את הספירה השנייה בספירה הראשונה כדי לקבוע את החלק של סטנטור שהתכווץ בתגובה לגירוי המכני, תוך חזרה על הפרוצדורה של כל הפולסים המכניים בניסוי. הסתברות ההתכווצות של הסטנטור הייתה במעקב והתוצאות הראו כי הוא יורד בהדרגה במשך שעה אחת. לאחר קבלת רמה ארבע פולסים מכניים בתדירות של הקשה אחת לדקה, המעידים על הרגלה.שינוי הכוח או התדירות של העברת הדופק המכני יכול לשנות את דינמיקת ההרגלה של סטנטור. תוך שימוש בסט הדופק ברמה שתיים של תדר של הקשה אחת לדקה, מונע הרגלה במשך שעה אחת. אנו יכולים לחקור סוגים שונים של דינמיקת הרגלה על ידי שינוי הכוח והתדירות של גירוי מכני.זוהי הזדמנות לחקור סוגים שונים של למידה, כגון רגישות. תובנות כמותיות על למידת תאים בודדים, שנלקחו מהשיטות שלנו, יכולות להוות השראה לאפיקים אחרים לתכנות מחדש של תאים בתוך רקמות רב-תאיות. דרך פוטנציאלית נוספת להילחם במחלות.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

לימוד תוקפנות תסיסנית (זבובי פירות)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

חלון על המיקרו: מערכות Microfluidic פשוט לחקר התחבורה מיקרוביאלית בתווך נקבובי

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

לימוד ה-DNA Looping ידי סריג Single-מולקולה

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

לימוד מבנה ותפקוד מיטוכונדריאלי<em&gt; תסיסנית</em&gt; שחלות

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...