Name: studying habituation in stentor coeruleus
Uploaded: 2023-01-06T13:45:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

Ringraziamo Tatyana Makushok per le innumerevoli discussioni sull'apprendimento di Stentor . Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione NSF MCB- 2012647 e dalla sovvenzione NIH R35 GM130327, nonché dal premio I2CELL della Fondazione Fourmentin-Guilbert.

NOTA: un riepilogo del flusso di lavoro dell'esperimento di assuefazione è illustrato nella Figura 2.
1. Montaggio del dispositivo di assuefazione
<ol><li>Agganciare il driver del motore al motore (vedere la Figura 3).<ol><li>Collegare i due fili etichettati A dalla scheda driver ai fili blu e rosso sul motore. Collegare i due fili etichettati B dalla scheda driver ai fili verde e nero sul motore. NOTA: guardando in basso sulla scheda driver dall'alto con i fili del motore in alto, i quattro fili di ingresso devono essere collegati ai cavi del motore in questo ordine: blu, rosso, nero e verde.</li>
	</ol></li>
	<li>Costruire il circuito breadboard mostrato in Figura 4, con particolare attenzione a collegare i LED nella polarità corretta.</li>
	<li>Collegare il Vcc (+5 V) dalla scheda del conducente alla guida superiore della breadboard bianca e il Gnd dalla scheda driver alla guida inferiore della breadboard.</li>
	<li>Collegare la massa della breadboard al pin di massa della scheda del microcontroller. Collegare rispettivamente i cavi LED verde, LED rosso, interruttore e pulsante ai pin digitali 8, 9, 10 e 11 della scheda microcontroller.</li>
	<li>Collegare i pin digitali della scheda microcontrollore 2 e 3 ai fili della scheda driver Step e Dir.</li>
	<li>Collegare i pin digitali 4, 5, 6 e 7 della scheda microcontroller ai cavi della scheda driver.<ol><li>Collegare il Pin 4 a MS1, collegare il Pin 5 a MS2, collegare il Pin 6 a MS3 e collegare il Pin 7 ad Abilita.</li>
	</ol></li>
	<li>Alimentare la scheda driver con un alimentatore a 12 V. Collegare l'alimentazione a 12 V alla spina dell'adattatore nero/verde collegata da due fili rossi alla scheda del driver del motore. NOTA: non collegare l'alimentazione a 12 V alla spina della scheda del microcontrollore.</li>
	<li>Scaricare il programma di controllo (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) sulla scheda del microcontrollore.</li>
	<li>Utilizzare un cavo USB per collegare la scheda del microcontroller a un computer, che fungerà anche da fonte di alimentazione per la scheda del microcontroller.</li>
	<li>Verificare che i controlli utente funzionino.<ol><li>Verificare che l'interruttore a scorrimento attivi e spenga la modalità automatica. In modalità automatica, il sistema eseguirà un passo a intervalli regolari specificati dall'utente (vedi sotto).</li>
		<li>Verificare che il LED verde si accenda quando la modalità automatica è attiva.</li>
		<li>Verificare che il LED rosso lampeggi 1 s prima che il motore applichi un impulso. Il LED rosso è una spia luminosa che indica quando il sistema sta per emettere un impulso meccanico.</li>
		<li>Testare il pulsante rosso, che attiva un micropasso di 1/16 ogni volta che il pulsante viene premuto, indipendentemente dal fatto che il sistema sia in modalità automatica.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig03.jpg"> Figura 3: Componenti del dispositivo di abituazione. Tutta l'elettronica etichettata è necessaria per assemblare la macchina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig04.jpg"> Figura 4: Schema dell'elettronica. Questo è il circuito sulla breadboard. I fili che si collegano alla scheda del microcontrollore sono numerati come descritto nel protocollo. D1 e D2 sono rispettivamente i LED rosso e verde e sono collegati a terra tramite resistori da 330 Ω. I due interruttori sono tirati su con resistori da 10 KΩ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
2. Impostazione dell'esperimento di assuefazione
<ol><li>Ottenere Stentor.</li>
	<li>Rivestire una piastra da 35 mm con una soluzione di poli-ornitina allo 0,01%.<ol><li>Aggiungere 3 ml della soluzione di poli-ornitina allo 0,01% nella piastra e lasciare per una notte.</li>
		<li>Lavare la piastra due volte con acqua ultrapura e una volta con acqua di sorgente pastorizzata (PSW) (Tabella dei materiali).</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere 3,5 ml di PSW alla piastra da 35 mm.</li>
	<li>Lavare lo stentor in una piastra a 6 pozzetti (tabella dei materiali).<ol><li>Aggiungere 3 ml di PSW al primo pozzetto e 5 mL di PSW al secondo e terzo pozzetto. Utilizzare una pipetta P1.000 per aggiungere 2 ml di Stentor da un piatto di coltura al primo pozzetto della piastra a 6 pozzetti.</li>
		<li>Identificare il singolo Stentor con un microscopio stereo (Table of Materials) e quindi utilizzare una pipetta P20 per trasferire 100 Stentor dal primo pozzetto al secondo pozzetto. </li>
		<li>Identificare il singolo Stentor con un microscopio stereo e quindi utilizzare una pipetta P20 per trasferire 100 Stentor dal secondo pozzetto al terzo pozzetto.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare una pipetta P200 per trasferire 100 Stentor in un volume totale di 500 μL dal terzo pozzetto della piastra a 6 pozzetti alla piastra da 35 mm in modo tale che il volume finale nella piastra da 35 mm sia di 4 ml.</li>
	<li>Fissare un pezzo (7 cm x 7 cm) di carta bianca sul righello metallico sul dispositivo di abituazione. Assicurarsi che il bordo sinistro della carta si trovi a 2 cm dall'estremità del righello più vicina all'armatura.</li>
	<li>Utilizzare del nastro biadesivo per far aderire il fondo della piastra da 35 mm al centro del 2 in x 2 in carta sopra il righello sul dispositivo di abitudine.</li>
	<li>Lasciare la piastra da 35 mm sul dispositivo di assuefazione per almeno 2 ore (questo può essere esteso a tutta la notte) con il coperchio chiuso. Durante questo periodo di acclimatazione, mantenere la piastra in condizioni di luce ambientale che corrispondano alle condizioni di luce sperimentali (cioè, non sottoporre le celle a fluttuazioni di luce / buio). Inoltre, assicurarsi che la piastra non subisca perturbazioni meccaniche dovute a spintoni accidentali.</li>
	<li>Centrare la fotocamera del microscopio USB (Table of Materials) direttamente sopra la piastra da 35 mm di Stentor. Se necessario, posizionare un puntello come una scatola di punta per pipette sotto la fotocamera del microscopio USB (Universal Serial Bus) per regolare l'altezza. In alternativa, è possibile utilizzare un supporto ad anello per regolare l'altezza.</li>
	<li>Installare l'applicazione Webcam recorder su un laptop (Table of Materials) e utilizzarla per visualizzare le cellule tramite l'ingresso del microscopio.<ol><li>Apri l'app Registratore webcam e seleziona il microscopio USB dal menu a discesa. Regolare la messa a fuoco sulla fotocamera del microscopio USB in modo che le celle siano chiaramente visibili.</li>
		<li>Regolare la posizione della fotocamera del microscopio USB per massimizzare il numero di celle nel campo visivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Aprire il monitor seriale della scheda microcontroller: selezionare No Line Ending e impostarlo su 9.600 baud.</li>
	<li>Utilizzare il comando l sul programma della scheda del microcontrollore per abbassare l'armatura fino a quando non tocca a malapena il righello. Utilizzare il comando r per sollevare il braccio, se necessario, per regolare la posizione esatta. NOTA: se l'armatura si trova a una distanza significativa dal righello, digitare il comando d per disattivare la corrente della bobina del motore in modo che il braccio possa essere spostato manualmente verso il righello. Dopo aver spostato manualmente il braccio, utilizzare il comando e per abilitare la corrente della bobina del motore e mantenere il braccio bloccato in posizione. Se correttamente abbassato prima dell'inizio di un esperimento, la punta inferiore dell'armatura dovrebbe essere a 1 cm di distanza dal bordo sinistro del righello. L'armatura fornirà l'impulso meccanico colpendo il righello.</li>
	<li>Utilizzare il comando i per inizializzare la modalità automatica sul dispositivo di abituazione.</li>
	<li>Immettere la dimensione del passaggio nella riga di comando. Il livello 5 è il gradino più piccolo e il livello 1 è il gradino più grande. Il livello 4 è la dimensione del passo utilizzata per gli esperimenti di assuefazione di base. NOTA: uno stimolo di livello 5 provoca uno spostamento verso il basso del righello di ~ 0,5 mm; Il livello 4 provoca uno spostamento verso il basso di ~ 1 mm; Il livello 3 provoca uno spostamento verso il basso di ~ 2 mm; Il livello 2 provoca uno spostamento verso il basso di ~3-4 mm; e il livello 1 provoca uno spostamento verso il basso di ~ 8 mm. Uno stimolo di livello 5 si traduce in una forza di picco verso il basso dell'armatura contro il righello di ~ 0,122 N; Il livello 4 provoca una forza di picco verso il basso di ~ 0,288 N; e il livello 3 si traduce in una forza di picco verso il basso di ~ 0,557 N. Le forze verso il basso generate dal livello 1 e dal livello 2 sono più difficili da quantificare empiricamente con un dinamometro a causa delle significative oscillazioni del righello che si verificano dopo che l'armatura entra in contatto.</li>
	<li>Inserisci il tempo tra gli impulsi in minuti. L'intervallo utilizzato per gli esperimenti di assuefazione al basale è di 1 min.</li>
	<li>Inizia a registrare un video utilizzando l'app Webcam recorder premendo il pulsante rosso di registrazione. Quindi, premere l'interruttore sull'apparecchio di assuefazione per iniziare l'esperimento con la prima erogazione automatica di impulsi meccanici.</li>
</ol>3. Analisi del video dell'esperimento
<ol><li>Immediatamente prima che il primo impulso meccanico appaia sul video, metti in pausa e conta il numero di Stentor che sono entrambi ancorati al fondo della piastra da 35 mm ed estesi in una forma allungata simile a una tromba (Figura 5A, Video 1).</li>
	<li>Subito dopo il primo impulso, contare il numero di Stentor che sono entrambi ancorati al fondo della piastra e contratti in una forma a sfera (Figura 5B, Video 1). NOTA: Le cellule contratte sono facilmente distinguibili dalle cellule allungate perché Stentor riduce la loro lunghezza corporea di oltre il 50% entro 10 ms durante un evento di contrazione3.</li>
	<li>Dividere il secondo conteggio per il primo conteggio per determinare la frazione di Stentor che si è contratta in risposta allo stimolo meccanico.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.1-3.3 per tutti gli impulsi meccanici nel video dell'esperimento.</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig05.jpg"> Figura 5: Contratto dello stentore dopo aver ricevuto uno stimolo meccanico . (A) Gli stentor sono nel loro stato allungato e ancorati al fondo della piastra di Petri. (B) Lo stentor si è contratto dopo aver ricevuto una stimolazione meccanica di livello 4 dal dispositivo di assuefazione. Le immagini sono state scattate con un microscopio USB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Video 1: Video del contratto di Stentor. Lo stentor riceve uno stimolo meccanico di livello 4 dal dispositivo di assuefazione ogni minuto. Queste cellule non si sono ancora abituate, quindi si contraggono dopo aver ricevuto l'impulso. Le cellule sono nella piastra di Petri posta sopra il dispositivo di assuefazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_1_JoVE.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>

<ol>
	<li>Dussutour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+single+cell+organisms.">Learning in single cell organisms.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).</li><li>Sternberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intelligence.">Intelligence.</a> Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parametric+studies+of+the+response+decrement+produced+by+mechanical+stimuli+in+the+protozoan,+Stentor+coeruleus.">Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus.</a> Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+learning.">Cell learning.</a> Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specific+habituation+in+a+protozoan.">Stimulus specific habituation in a protozoan.</a> Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).</li><li>Thompson, R. F., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation:+A+model+phenomenon+for+the+study+of+neuronal+substrates+of+behavior.">Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior.</a> Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).</li><li>Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stentor+coeruleus.">Stentor coeruleus.</a> Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).</li><li>McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+is+altered+in+neuropsychiatric+disorders-A+comprehensive+review+with+recommendations+for+experimental+design+and+analysis.">Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I passaggi più critici del protocollo riguardano la garanzia che lo Stentor rimanga in condizioni ottimali per il verificarsi di contrazioni. La risposta di contrazione nel saggio di assuefazione richiede che gli stentori siano ancorati a una superficie usando la loro appigliatura appiccicosa poiché raramente si contraggono quando nuotano liberamente. Tuttavia, la superficie inferiore della piastra di Petri da 35 mm utilizzata per gli esperimenti di assuefazione non è tipicamente favorevole all'ancoraggio a meno che non sia rivestita con poli-ornitina. Inoltre, lo Stentor non può essere esposto ad alcuna perturbazione meccanica per un minimo di 2 ore prima dell'inizio dell'esperimento di assuefazione perché lo Stentor dimenticando la scala temporale è di 2-6 h3. Se Stentor riceve una stimolazione meccanica entro 2 ore dall'ora di inizio dell'esperimento, esiste la possibilità che questa stimolazione precedente induca un leggero livello di assuefazione prima dell'esperimento, riducendo così la probabilità di contrazione dopo che il dispositivo di assuefazione eroga il primo impulso meccanico. Infine, durante la fase di analisi, è importante contare solo il numero di Stentor che si contraggono dopo un impulso - piuttosto che eventuali contrazioni spontanee accidentali che si verificano prima della consegna dell'impulso - per ottenere una lettura accurata della frazione di cellule che si sono contratte in risposta alla stimolazione meccanica.
Il protocollo può essere facilmente modificato per studiare diversi tipi di dinamica di assuefazione modificando la forza e la frequenza degli impulsi meccanici erogati dal dispositivo di assuefazione. Ciò offre anche l'opportunità di esplorare altri tipi di apprendimento, come la sensibilizzazione, che potrebbero verificarsi in Stentor. Il codice di programma della scheda del microcontrollore può anche essere regolato per fornire diversi modelli di rubinetti meccanici allo Stentor.
Un potenziale problema da risolvere con questo protocollo è la bassa frequenza di ancoraggio di Stentor , che potrebbe limitare il numero di Stentor che possono essere osservati nell'esperimento di assuefazione. La frequenza di ancoraggio è talvolta ridotta nelle colture di Stentor che non sono state recentemente alimentate o sono contaminate. Per affrontare questo problema, si dovrebbe lavare un nuovo lotto di Stentor per iniziare una nuova coltura e nutrirli regolarmente secondo il protocollo descritto in Lin et al.10.
Questo protocollo è limitato in quanto è possibile testare solo una singola piastra di Stentor alla volta, con conseguenti misurazioni a produttività relativamente bassa. Inoltre, il software attuale non consente l'automazione dell'analisi delle immagini a cella singola. La maggior parte dei dati acquisiti sono, quindi, a livello di popolazione. I modelli futuri del dispositivo di assuefazione e gli strumenti di analisi delle immagini possono facilitare esperimenti a singola cellula ad alto rendimento.
L'assuefazione in Stentor è stata precedentemente studiata utilizzando i metodi descritti da Wood3, ma questo nuovo protocollo consente di automatizzare gli esperimenti. L'automazione non solo consente al ricercatore di fornire impulsi meccanici riproducibili di una forza e frequenza specificate, ma facilita anche esperimenti di assuefazione a lungo termine poiché il dispositivo può essere lasciato in funzione senza supervisione per giorni. Inoltre, l'uso di un motore passo-passo piuttosto che del solenoide impiegato negli esperimenti di Wood3 riduce il rischio di smagnetizzazione nel tempo e consente anche di variare la forza dello stimolo nel corso di un singolo esperimento.
Lo studio dell'assuefazione cellulare può rivelare intuizioni cliniche per condizioni come il disturbo da deficit di attenzione / iperattività (ADHD) e la sindrome di Tourette in cui l'assuefazione è compromessa11. I meccanismi di assuefazione dello stentor possono anche svelare nuovi paradigmi di apprendimento non sinaptici indipendenti da complessi circuiti cellulari. Infine, approfondimenti sull'apprendimento a singola cellula potrebbero ispirare metodi per riprogrammare le cellule all'interno dei tessuti multicellulari - un'altra potenziale strada per combattere le malattie.

L'apprendimento è solitamente associato a un sistema nervoso complesso, ma vi è una crescente evidenza che la vita a tutti i livelli, fino alle singole cellule, può mostrare comportamenti intelligenti. Sia nei sistemi naturali che in quelli artificiali, l'apprendimento è l'aggiornamento adattivo dei parametri del sistema basato su nuove informazioni1, e l'intelligenza è una misura del processo computazionale che facilita l'apprendimento2.
Stentor coeruleus è un organismo unicellulare che vive in uno stagno che mostra assuefazione, una forma di apprendimento in cui una risposta comportamentale diminuisce a seguito di uno stimolo ripetuto3. Lo stentor si contrae in risposta alla stimolazione meccanica3, che è un'apparente risposta di fuga dai predatori acquatici. Tuttavia, ripetute perturbazioni a bassa forza inducono assuefazione, dimostrata da una progressiva riduzione della probabilità di contrazione3. Lo Stentor abituato si contrae ancora dopo aver ricevuto la stimolazione meccanica ad alta forza4 o la stimolazione fotica5. Queste osservazioni, che si allineano con i criteri classici di Thompson e Spencer per l'assuefazione negli animali6, suggeriscono fortemente che il decremento della risposta contrattile originale è dovuto all'apprendimento piuttosto che alla fatica o all'esaurimento dell'ATP. Come cellula a vita libera, Stentor può essere studiato senza troppe interferenze da parte delle cellule circostanti, come sarebbe il caso in un tessuto multicellulare. Diverse caratteristiche aggiuntive rendono Stentor un sistema trattabile per lo studio dell'apprendimento: le sue grandi dimensioni (1 mm), la sua risposta di assuefazione quantificabile3, la facilità di iniezione e micromanipolazione7, ilgenoma 8 completamente sequenziato e la disponibilità di strumenti di interferenza dell'RNA (RNAi)9. L'utilizzo di questo organismo modello per esplorare l'apprendimento cellulare senza cervello o sistema nervoso richiede una procedura riproducibile per stimolare le cellule Stentor e misurare la risposta.
Qui, introduciamo un metodo per quantificare l'assuefazione di Stentor utilizzando un apparato collegato alla scheda di microcontrollore in grado di fornire impulsi meccanici a una forza e frequenza specificate, compresi i metodi per costruire l'apparato e impostare l'esperimento in modo da ridurre al minimo le perturbazioni esterne (Figura 1). Comprendere l'assuefazione a livello di una singola cellula aiuterà a caratterizzare paradigmi di apprendimento indipendenti da circuiti complessi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig01.jpg"> Figura 1: Impostazione dell'esperimento di assuefazione. La piastra di Petri contenente Stentor è posizionata sopra il righello metallico flessibile del dispositivo di abituazione. L'armatura del dispositivo di assuefazione colpisce quindi il righello metallico a una forza e frequenza specificate, producendo un'onda di stimolo attraverso il campo delle cellule. La fotocamera del microscopio USB registra le risposte dello stentor alla stimolazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig02.jpg"> Figura 2: Riepilogo del flusso di lavoro dell'esperimento di assuefazione. La figura mostra i passaggi fondamentali coinvolti nello studio di Stentor utilizzando il dispositivo di assuefazione. La figura è stata creata con BioRender.com. Adattato da "Process Flowchart", di BioRender.com (2022). Estratto da https://app.biorender.com/biorender-templates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% Poly-ornithine&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Used to coat Petri plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Petri plate</td>
			<td>Benz Microscope Optics Center Inc.</td>
			<td>L331</td>
			<td>Contains Stentor during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>38016</td>
			<td>Used to wash Stentor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard, 4&#34; x 24&#34; x 1/2&#34; (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB424</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big easy driver stepper motor driver board (x1)</td>
			<td>Sparkfun</td>
			<td>ROB-12859</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Construction rail, 1&#34; x 5&#39;&#39; (x2)</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport CR-1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://www.apple.com/macbook-air-m1/</td>
			<td>Connect laptop to USB microscope to visualize experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large right-angle bracket (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90RL</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>A000066</td>
			<td>Used to control habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A&#160;84oz.in&#160;48mm 4-Lead&#160;</td>
			<td>Stepperonline.com</td>
			<td>5-17HS19-2004S1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized spring water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td>Media for Stentor experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize Stentor during wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>131598</td>
			<td>These are the cells used for habituation experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB microscope</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>44308</td>
			<td>Used to visualize and record experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcam recorder</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12</td>
			<td>Install this application to take videos of experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying habituation in stentor coeruleus

L'apprendimento è solitamente associato a un sistema nervoso complesso, ma vi è una crescente evidenza che la vita a tutti i livelli, fino alle singole cellule, può mostrare comportamenti intelligenti. Sia nei sistemi naturali che in quelli artificiali, l'apprendimento è l'aggiornamento adattivo dei parametri del sistema basato su nuove informazioni e l'intelligenza è una misura del processo computazionale che facilita l'apprendimento. Stentor coeruleus è un organismo unicellulare che vive in uno stagno che mostra assuefazione, una forma di apprendimento in cui una risposta comportamentale diminuisce a seguito di uno stimolo ripetuto. Lo stentor si contrae in risposta alla stimolazione meccanica, che è un'apparente risposta di fuga dai predatori acquatici. Tuttavia, ripetute perturbazioni a bassa forza inducono assuefazione, dimostrata da una progressiva riduzione della probabilità di contrazione. Qui, introduciamo un metodo per quantificare l'assuefazione di Stentor utilizzando un apparato collegato alla scheda di microcontrollore in grado di fornire impulsi meccanici a una forza e frequenza specificate, compresi i metodi per costruire l'apparato e impostare l'esperimento in modo da ridurre al minimo le perturbazioni esterne. In contrasto con gli approcci precedentemente descritti per stimolare meccanicamente Stentor, questo dispositivo consente di variare la forza di stimolazione sotto il controllo del computer durante il corso di un singolo esperimento, aumentando così notevolmente la varietà di sequenze di input che possono essere applicate. Comprendere l'assuefazione a livello di una singola cellula aiuterà a caratterizzare paradigmi di apprendimento indipendenti da circuiti complessi.

Il metodo sopra descritto, utilizzando l'impulso meccanico di livello 4 ad una frequenza di 1 tap/min, dovrebbe comportare una progressiva riduzione della probabilità di contrazione dello stentor entro 1 ora. Questo è indicativo di assuefazione (vedi Figura 6, Video 2).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig06v2.jpg"> Figura 6: Assuefazione al basale. La probabilità di contrazione di Stentor diminuisce progressivamente nel corso di 1 ora dopo aver ricevuto impulsi meccanici di livello 4 ad una frequenza di 1 tap/min (n = 22-27). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
Video 2. Video di Stentor abituato. Le cellule ricevono uno stimolo meccanico di livello 4 dopo 1 ora di ricezione di impulsi meccanici della stessa forza ad una frequenza di 1 tocco / min. La maggior parte delle cellule si sono abituate agli stimoli durante l'ora e, quindi, non si contraggono. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_2_JoVE.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo video.</a>
L'alterazione della forza e/o della frequenza dell'erogazione dell'impulso meccanico può modificare la dinamica di assuefazione dello Stentor . Ad esempio, l'utilizzo dell'impulso di livello 2 ad una frequenza di 1 tocco/min preclude l'assuefazione nel corso di 1 ora (vedere la figura 7). Un impulso di livello 5 dovrebbe provocare contrazioni in pochi o zero Stentor.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig7v2.jpg"> Figura 7: Mancanza di assuefazione entro 1 ora per forze più forti. La probabilità di contrazione di Stentor non diminuisce sensibilmente nel corso di 1 ora dopo aver ricevuto impulsi meccanici di livello 2 ad una frequenza di 1 tap/min (n = 7-33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig07largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Introduciamo un metodo per quantificare l'assuefazione di Stentor utilizzando un apparato collegato alla scheda di microcontrollore in grado di fornire impulsi meccanici a una forza e una frequenza specificate. Includiamo anche metodi per assemblare l'apparato e impostare l'esperimento in modo da ridurre al minimo le perturbazioni esterne.

Studiare l'assuefazione in Stentor coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display ...

Studiare l'assuefazione a livello di una singola cellula aiuterà a caratterizzare paradigmi di apprendimento indipendenti da complessi circuiti neurali aiutandoci così a comprendere le origini dell'intelligenza. Questa tecnica consente di variare la forza e la frequenza della stimolazione meccanica erogata alle cellule sotto il controllo automatico del computer, aumentando così notevolmente la diversità delle sequenze di input. L'utilizzo di questi metodi per studiare l'assuefazione cellulare ci aiuterà a saperne di più su condizioni come l'ADHD e la sindrome di Tourette in cui l'assuefazione è compromessa.Per iniziare, agganciare il driver del motore al motore collegando i due fili etichettati A dalla scheda driver ai fili blu e rosso sul motore. Quindi collegare i due fili etichettati B dalla scheda driver ai fili verde e nero sul motore. Dopo aver costruito il circuito breadboard con particolare attenzione per collegare i LED nella polarità corretta, collegare il VCC dalla scheda driver alla guida superiore della breadboard bianca.E il terreno dalla scheda del conducente al binario inferiore della breadboard. Quindi, collegare la massa della breadboard al pin di massa della scheda del microcontrollore. Quindi collegare i fili del LED verde, del LED rosso, dell'interruttore e del pulsante, rispettivamente ai pin digitali 8, 9, 10 e 11 della scheda del microcontrollore.Collegare i pin digitali della scheda microcontrollore due e tre ai fili della scheda driver, passo e direzione. Quindi collegare il pin quattro a MS1, il pin cinque a MS2, il PIN sei a MS3 e il pin sette per abilitare. Per alimentare la scheda driver, collegare l'alimentazione da 12 volt alla spina adattatore verde nera, collegata da due fili rossi alla scheda driver del motore.Scaricare il programma di controllo sulla scheda microcontrollore. Utilizzare un cavo USB per collegare la scheda del microcontroller a un computer, che fungerà anche da fonte di alimentazione per la scheda del microcontroller. Dopo aver ottenuto Stentor, rivestire una piastra da 35 millimetri aggiungendo tre millilitri della soluzione di poliornitina allo 0,01% alla piastra e lasciare durante la notte.Lavare la piastra due volte con acqua ultrapura e una volta con acqua di sorgente pastorizzata. Quindi aggiungere 3,5 millilitri di acqua di sorgente pastorizzata alla piastra da 35 millimetri. Aggiungere tre millilitri di acqua di sorgente pastorizzata al primo pozzo e cinque millilitri al secondo e terzo pozzetto.Utilizzando una pipetta P1000, aggiungere due millilitri di Stentor da un piatto di coltura al primo pozzetto della piastra a sei pozzetti. Identificare il singolo Stentor con uno stereomicroscopio e quindi utilizzare una pipetta P20 per trasferire 100 Stentor dal primo pozzetto al secondo pozzetto. Allo stesso modo, dopo aver identificato il singolo Stentor con uno stereomicroscopio come dimostrato in precedenza, trasferire 100 Stentor dal secondo pozzetto al terzo pozzetto utilizzando una pipetta P20.Quindi, utilizzando una pipetta P200, trasferire 100 Stentor in un volume totale di 500 microlitri, dal terzo pozzetto della piastra a sei pozzetti nella piastra da 35 millimetri in modo tale che il volume finale sia di quattro millilitri. Fissare un pezzo di carta bianca sul righello metallico sul dispositivo di abituazione, assicurandosi che il bordo sinistro della carta sia a due centimetri dall'estremità del righello più vicino all'armatura. Utilizzando del nastro biadesivo, far aderire il fondo della piastra da 35 millimetri al centro della carta da due di due pollici in cima al righello sul dispositivo di abituazione.Lasciare la piastra da 35 millimetri sul dispositivo di assuefazione per almeno due ore con il coperchio chiuso. Centrare la fotocamera del microscopio USB direttamente sopra la piastra da 35 millimetri di Stentor. Per installare l'applicazione di registrazione webcam, apri l'app del registratore della webcam e seleziona il microscopio USB dal menu a discesa.Regolare la messa a fuoco sulla fotocamera del microscopio USB in modo che le celle siano chiaramente in vista e la posizione della telecamera per massimizzare il numero di celle nel campo visivo. Dopo aver aperto il monitor seriale della scheda del microcontroller, selezionare nessuna fine di linea "e impostarlo su 9, 600 baud. Utilizzare il comando L sul programma della scheda del microcontrollore per abbassare l'armatura fino a quando non tocca a malapena il righello e il comando R per sollevare il braccio se necessario per regolare la posizione esatta.Utilizzare il comando I per inizializzare la modalità automatica sul dispositivo di abituazione. Immettere la dimensione dei passaggi e il tempo tra gli impulsi in minuti nella riga di comando. Inizia a registrare un video utilizzando l'app di registrazione della webcam premendo il pulsante rosso di registrazione.Quindi premere l'interruttore sull'apparecchio di assuefazione per iniziare l'esperimento con la prima erogazione automatica di impulsi meccanici. Immediatamente prima che il primo impulso meccanico appaia sul video, metti in pausa e conta il numero di Stentor che sono entrambi ancorati al fondo della piastra da 35 millimetri ed estesi in una forma allungata simile a una tromba. Allo stesso modo, dopo il primo impulso, conta il numero di Stentor che sono entrambi ancorati al fondo della piastra e contratti in una forma simile a una palla.Dividere il secondo conteggio per il primo conteggio per determinare la frazione di Stentor che si è contratta in risposta allo stimolo meccanico, ripetendo la procedura per tutti gli impulsi meccanici nell'esperimento. La probabilità di contrazione dello stentor è stata monitorata e i risultati hanno dimostrato che diminuisce progressivamente nel corso di un'ora. Dopo aver ricevuto impulsi meccanici di livello quattro ad una frequenza di un tocco al minuto, indicando l'abitudine.Alterare la forza o la frequenza dell'erogazione dell'impulso meccanico può modificare la dinamica di assuefazione dello Stentor. Durante l'utilizzo del set di impulsi di livello due di frequenza di un tocco al minuto, preclude l'assuefazione nel corso di un'ora. Possiamo studiare diversi tipi di dinamica di assuefazione alterando la forza e la frequenza della stimolazione meccanica.Questa è un'opportunità per esplorare diversi tipi di apprendimento, come la sensibilizzazione. Le intuizioni quantitative sull'apprendimento di singole cellule, raccolte dai nostri metodi, potrebbero ispirare altre strade per riprogrammare le cellule all'interno dei tessuti multicellulari. Un altro modo potenziale per combattere le malattie.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studiare Aggressione in Drosophila (moscerino della frutta)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Ricerca

Biologia

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Finestra su un micromondo: Sistemi Microfluidic semplice per studiare il trasporto microbica in mezzi porosi

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studiare Looping DNA a singola molecola FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Un modello In Vitro per lo studio della trasformazione cellulare da Herpesvirus Sarcoma di Kaposi

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in<em&gt; Drosophila</em&gt; ovaie

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...