Name: studying habituation in stentor coeruleus
Uploaded: 2023-01-06T13:45:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

Vi takker Tatyana Makushok for utallige diskusjoner om Stentor læring. Dette arbeidet ble finansiert av NSF-stipend MCB- 2012647 og av NIH-stipend R35 GM130327, samt av I2CELL-prisen fra Stiftelsen Fourmentin-Guilbert.

MERK: Et sammendrag av arbeidsflyten for tilvenningseksperimentet er vist i figur 2.
1. Montering av tilvenningsenheten
<ol><li>Koble motorføreren til motoren (se figur 3).<ol><li>Koble de to ledningene merket A fra førerkortet til de blå og røde ledningene på motoren. Koble de to ledningene merket B fra førerkortet til de grønne og svarte ledningene på motoren. MERK: Når du ser ned på førerkortet ovenfra med motorledningene øverst, skal de fire inngangsledningene kobles til motorledningene i denne rekkefølgen: blå, rød, svart og grønn.</li>
	</ol></li>
	<li>Bygg brødbrettkretsen vist i figur 4, med spesiell forsiktighet for å koble lysdiodene i riktig polaritet.</li>
	<li>Koble Vcc (+5 V) fra førerkortet til toppskinnen på det hvite brødbrettet og Gnd fra førerkortet til bunnskinnen på brødbrettet.</li>
	<li>Koble bakken på brødbrettet til jordstiften på mikrokontrollerkortet. Koble henholdsvis den grønne LED-lampen, den røde LED-lampen, bryteren og knappeledningene til mikrokontrollerkortets digitale pinner 8, 9, 10 og 11.</li>
	<li>Koble mikrokontrollerkortets digitale pinner 2 og 3 til driverkortledningene Step og Dir.</li>
	<li>Koble mikrokontrollerkortets digitale pinner 4, 5, 6 og 7 til ledningene til førerkortet.<ol><li>Koble Pin 4 til MS1, koble Pin 5 til MS2, koble Pin 6 til MS3, og koble Pin 7 til Aktiver.</li>
	</ol></li>
	<li>Strøm driverkortet med en 12 V strømforsyning. Koble 12 V-forsyningen til den svarte / grønne adapterpluggen som er festet med to røde ledninger til motorførerkortet. MERK: Ikke koble 12 V-tilførselen til mikrokontrollerkortpluggen.</li>
	<li>Last ned kontrollprogrammet (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) på mikrokontrollerkortet.</li>
	<li>Bruk en USB-kabel til å koble mikrokontrollerkortet til en datamaskin, som også vil fungere som strømkilde for mikrokontrollerkortet.</li>
	<li>Kontroller at brukerkontrollene fungerer.<ol><li>Bekreft at skyvebryteren slår automatisk modus av og på. I automatisk modus vil systemet ta et skritt med jevne mellomrom spesifisert av brukeren (se nedenfor).</li>
		<li>Kontroller at den grønne lampen slås på når automatisk modus er på.</li>
		<li>Kontroller at den røde LED-lampen blinker 1 s før motoren bruker puls. Den røde LED-lampen er en varsellampe som indikerer når systemet er i ferd med å levere en mekanisk puls.</li>
		<li>Test den røde knappen, som utløser et 1/16 mikrotrinn hver gang du trykker på knappen, uavhengig av om systemet er i automatisk modus.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig03.jpg"> Figur 3: Komponenter i tilvenningsenheten. All merket elektronikk er nødvendig for å montere maskinen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig04.jpg"> Figur 4: Elektronikk skjematisk. Dette er kretsen på brødbrettet. Ledningene som kobles til mikrokontrollerkortet er nummerert som beskrevet i protokollen. D1 og D2 er henholdsvis de røde og grønne lysdiodene, og er koblet til bakken gjennom 330 Ω motstander. De to bryterne trekkes opp med 10 KΩ motstander. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
2. Sette opp tilvenningseksperimentet
<ol><li>Få tak i Stentor.</li>
	<li>Belegg en 35 mm plate med 0,01% poly-ornitin løsning.<ol><li>Tilsett 3 ml av 0,01% polyornitinoppløsningen på platen og la stå over natten.</li>
		<li>Vask platen to ganger med ultrarent vann og en gang med pasteurisert kildevann (PSW) (materialtabell).</li>
	</ol></li>
	<li>Tilsett 3,5 ml PSW på 35 mm-platen.</li>
	<li>Vask Stentor i en 6-brønns plate (Table of Materials).<ol><li>Tilsett 3 ml PSW i den første brønnen og 5 ml PSW i den andre og tredje brønnen. Bruk en P1,000 pipette for å tilsette 2 ml Stentor fra en kulturrett til den første brønnen på 6-brønnsplaten.</li>
		<li>Identifiser individuell Stentor med et stereomikroskop (Table of Materials) og bruk deretter en P20-pipette for å overføre 100 Stentor fra den første brønnen til den andre brønnen. </li>
		<li>Identifiser individuell Stentor med et stereomikroskop og bruk deretter en P20-pipette til å overføre 100 Stentor fra den andre brønnen til den tredje brønnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bruk en P200-pipette til å overføre 100 Stentor i et totalvolum på 500 μL fra den tredje brønnen på 6-brønnsplaten til 35 mm-platen slik at det endelige volumet i 35 mm-platen er 4 ml.</li>
	<li>Tape et stykke (7 cm x 7 cm) hvitt papir til metalllinjalen på tilvenningsenheten. Sørg for at papirets venstre kant er 2 cm fra enden av linjalen nærmest ankeret.</li>
	<li>Bruk dobbeltsidig tape for å feste bunnen av 35 mm-platen til midten av 2 i x 2 i papir på toppen av linjalen på tilvenningsenheten.</li>
	<li>La 35 mm platen stå på tilvenningsanordningen i minst 2 timer (denne kan utvides til over natten) med lokket lukket. Gjennom denne akklimatiseringsperioden, hold platen i omgivende lysforhold som samsvarer med de eksperimentelle lysforholdene (dvs. ikke utsett cellene for lys / mørke svingninger). Videre må du sørge for at platen ikke opplever noen mekaniske forstyrrelser fra utilsiktet jostling.</li>
	<li>Midtstill USB-mikroskopkameraet (Table of Materials) rett over 35 mm-platen til Stentor. Plasser om nødvendig en rekvisitt, for eksempel en pipettespissboks, under mikroskopkameraet for universalseriell buss (USB) for å justere høyden. Alternativt kan et ringstativ brukes til å justere høyden.</li>
	<li>Installer Webcam-opptakerapplikasjonen på en bærbar PC (Table of Materials) og bruk den til å visualisere cellene via mikroskopinngangen.<ol><li>Åpne Webcam-opptaker-appen og velg USB-mikroskopet fra rullegardinmenyen. Juster fokuset på USB-mikroskopkameraet slik at cellene er tydelig synlige.</li>
		<li>Juster posisjonen til USB-mikroskopkameraet for å maksimere antall celler i synsfeltet.</li>
	</ol></li>
	<li>Åpne mikrokontrollerkortets serielle skjerm: velg No Line Ending og sett den til 9,600 baud.</li>
	<li>Bruk l-kommandoen på mikrokontrollerkortprogrammet for å senke ankeret til det knapt berører linjalen. Bruk r-kommandoen til å løfte armen om nødvendig for å justere den nøyaktige posisjonen. MERK: Hvis armaturen er en betydelig avstand fra linjalen, skriver du inn d-kommandoen for å deaktivere motorspolestrømmen slik at armen kan flyttes manuelt mot linjalen. Etter å ha flyttet armen manuelt, bruk e-kommandoen for å aktivere motorspolestrømmen og holde armen låst på plass. Når den er riktig senket før starten av et eksperiment, bør den nederste spissen av ankeret være 1 cm fra venstre kant av linjalen. Armaturen vil levere den mekaniske pulsen ved å treffe linjalen.</li>
	<li>Bruk i-kommandoen til å initialisere den automatiske modusen på tilvenningsenheten.</li>
	<li>Skriv inn trinnstørrelsen på kommandolinjen. Nivå 5 er det minste trinnet, og nivå 1 er det største trinnet. Nivå 4 er trinnstørrelsen som brukes til grunnleggende tilvenningseksperimenter. MERK: En stimulus på nivå 5 resulterer i en nedadgående forskyvning av linjalen med ~0,5 mm; Nivå 4 resulterer i nedadgående forskyvning med ~ 1 mm; Nivå 3 resulterer i nedadgående forskyvning med ~ 2 mm; Nivå 2 resulterer i nedadgående forskyvning med ~ 3-4 mm; og nivå 1 resulterer i nedforskyvning med ~8 mm. En nivå 5-stimulus resulterer i en nedadgående toppkraft av ankeret mot linjalen på ~ 0,122 N; Nivå 4 resulterer i en nedadgående toppkraft på ~ 0,288 N; og nivå 3 resulterer i en nedadgående toppkraft på ~ 0,557 N. De nedadgående kreftene som genereres av nivå 1 og nivå 2 er vanskeligere å empirisk kvantifisere med et dynamometer på grunn av de betydelige linjaloscillasjonene som oppstår etter at ankeret kommer i kontakt.</li>
	<li>Angi tiden mellom pulser i minutter. Intervallet som brukes til baseline habituation eksperimenter er 1 min.</li>
	<li>Begynn å ta en video ved hjelp av Webkameraopptaker-appen ved å trykke på den røde opptaksknappen. Vri deretter bryteren på tilvenningsapparatet for å starte eksperimentet med den første automatiserte mekaniske pulsleveransen.</li>
</ol>3. Analysere eksperimentvideoen
<ol><li>Umiddelbart før den første mekaniske pulsen vises på videoen, pause og telle antall Stentor som både er forankret til bunnen av 35 mm-platen og utvidet i en langstrakt, trompetlignende form (figur 5A, video 1).</li>
	<li>Umiddelbart etter den første pulsen teller du antall Stentor som både er forankret til bunnen av platen og kontrahert til en kulelignende form (figur 5B, video 1). MERK: Kontraherte celler er lett å skille fra langstrakte celler fordi Stentor forkorter kroppslengden med over 50% innen 10 ms under en sammentrekningshendelse3.</li>
	<li>Del den andre tellingen med den første tellingen for å bestemme brøkdelen av Stentor som trakk seg sammen som svar på den mekaniske stimulansen.</li>
	<li>Gjenta trinn 3.1–3.3 for alle mekaniske pulser i eksperimentvideoen.</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig05.jpg"> Figur 5: Stentor trekker seg sammen etter å ha mottatt en mekanisk stimulus . (A) Stentor er i langstrakt tilstand og forankret til bunnen av petriplaten. (B) Stentor har kontrakt etter å ha mottatt en nivå 4 mekanisk stimulering fra habituation enheten. Bildene ble tatt med et USB-mikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Video 1: Video av Stentor kontrahering. Stentor mottar en mekanisk stimulus på nivå 4 fra tilvenningsenheten hvert minutt. Disse cellene har ennå ikke tilvennet seg, så de trekker seg sammen etter å ha mottatt pulsen. Cellene er i petriplaten plassert på toppen av tilvenningsapparatet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_1_JoVE.mp4" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>

<ol>
	<li>Dussutour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+single+cell+organisms.">Learning in single cell organisms.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).</li><li>Sternberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intelligence.">Intelligence.</a> Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parametric+studies+of+the+response+decrement+produced+by+mechanical+stimuli+in+the+protozoan,+Stentor+coeruleus.">Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus.</a> Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+learning.">Cell learning.</a> Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specific+habituation+in+a+protozoan.">Stimulus specific habituation in a protozoan.</a> Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).</li><li>Thompson, R. F., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation:+A+model+phenomenon+for+the+study+of+neuronal+substrates+of+behavior.">Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior.</a> Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).</li><li>Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stentor+coeruleus.">Stentor coeruleus.</a> Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).</li><li>McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+is+altered+in+neuropsychiatric+disorders-A+comprehensive+review+with+recommendations+for+experimental+design+and+analysis.">Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

De mest kritiske trinnene i protokollen er å sikre at Stentor forblir i optimale forhold for sammentrekninger. Kontraksjonsresponsen i tilvenningsanalysen krever at stentorer er forankret til en overflate ved hjelp av sin klissete holdfast, siden de sjelden trekker seg sammen når de svømmer fritt. Bunnflaten på 35 mm petriplaten som brukes til tilvenningseksperimenter bidrar imidlertid vanligvis ikke til forankring med mindre den er belagt med polyornitin. Videre kan Stentor ikke bli utsatt for mekanisk forstyrrelse i minst 2 timer før starten av tilvenningseksperimentet fordi Stentor glemmer tidsskalaen er 2-6 timer3. Hvis Stentor mottar mekanisk stimulering innen 2 timer etter tilvenningseksperimentets starttid, er det en mulighet for at denne tidligere stimuleringen vil indusere et lite nivå av tilvenning i forkant av forsøket, og dermed redusere kontraksjonssannsynligheten etter at tilvenningsanordningen leverer den første mekaniske pulsen. Til slutt, under analysefasen, er det viktig å bare telle antall Stentor som trekker seg sammen etter en puls - i stedet for tilfeldige spontane sammentrekninger som oppstår før pulsleveransen - for å oppnå en nøyaktig avlesning av brøkdelen av celler som kontraherte som svar på den mekaniske stimuleringen.
Protokollen kan lett modifiseres for å studere ulike typer tilvenningsdynamikk ved å endre kraften og frekvensen til de mekaniske pulser som leveres av tilvenningsanordningen. Dette gir også en mulighet til å utforske andre typer læring, for eksempel sensibilisering, som kan oppstå i Stentor. Selve mikrokontrollerkortprogramkoden kan også justeres for å levere forskjellige mønstre av mekaniske kraner til Stentor.
Et potensielt problem å feilsøke med denne protokollen er den lave frekvensen av Stentor-forankring , noe som kan begrense antall Stentor som kan observeres i habituation-eksperimentet. Forankringsfrekvensen reduseres noen ganger i Stentor-kulturer som ikke nylig har blitt matet eller er forurenset. For å løse dette problemet, bør man vaske en ny gruppe Stentor for å starte en ny kultur og mate dem regelmessig i henhold til protokollen beskrevet i Lin et al.10.
Denne protokollen er begrenset ved at bare en enkelt plate Stentor kan testes om gangen, noe som resulterer i relativt lave gjennomstrømningsmålinger. Videre tillater ikke nåværende programvare automatisering av enkeltcellet bildeanalyse. De fleste innhentede data er derfor på befolkningsnivå. Fremtidige modeller av habituation-enheten og bildeanalyseverktøyene kan legge til rette for enkeltcelleeksperimenter med høy gjennomstrømning.
Habituation i Stentor har tidligere blitt studert ved hjelp av metoder beskrevet av Wood3, men denne nye protokollen gjør det mulig å automatisere eksperimenter. Automatisering tillater ikke bare forskeren å reproduserbart levere mekaniske pulser av en spesifisert kraft og frekvens, men letter også langsiktige habituation eksperimenter siden enheten kan stå i gang uten tilsyn i flere dager. Videre reduserer bruk av en steppermotor i stedet for solenoiden som ble brukt i Woods eksperimenter3 risikoen for demagnetisering over tid og gjør det også mulig å variere styrken på stimulansen i løpet av et enkelt eksperiment.
Studier av cellulær tilvenning kan avsløre klinisk innsikt for tilstander som attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) og Tourettes syndrom der tilvenning er svekket11. Stentor habituation mekanismer kan også avdekke nye ikke-synaptiske læringsparadigmer uavhengig av komplekse cellulære kretser. Endelig kan innsikt om encellet læring inspirere metoder for omprogrammering av celler i flercellulært vev - en annen potensiell vei for å bekjempe sykdom.

Læring er vanligvis forbundet med et komplekst nervesystem, men det er økende bevis på at livet på alle nivåer, ned til enkeltceller, kan vise intelligent atferd. I både naturlige og kunstige systemer er læring den adaptive oppdateringen av systemparametere basert på ny informasjon1, og intelligens er et mål på beregningsprosessen som letter læring2.
Stentor coeruleus er en encellet damboende organisme som utviser habituation, en form for læring der en atferdsrespons avtar etter en gjentatt stimulus3. Stentor trekker seg sammen som svar på mekanisk stimulering3, som er en tilsynelatende rømningsrespons fra akvatiske rovdyr. Imidlertid induserer gjentatte forstyrrelser med lav kraft tilvenning, demonstrert ved en progressiv reduksjon i kontraksjonssannsynlighet3. Den tilvennede Stentor trekker seg fortsatt sammen etter å ha mottatt høykrafts mekanisk stimulering4 eller fotisk stimulering5. Disse observasjonene, som samsvarer med Thompson og Spencers klassiske kriterier for tilvenning hos dyr6, tyder sterkt på at den opprinnelige kontraktile responsreduksjonen skyldes læring i stedet for tretthet eller ATP-utmattelse. Som en frittlevende celle kan Stentor studeres uten mye interferens fra omkringliggende celler, slik tilfellet ville være i et flercellet vev. Flere tilleggsfunksjoner gjør Stentor til et trekkbart system for å studere læring: dens store størrelse (1 mm), dens kvantifiserbare tilvenningsrespons3, enkel injeksjon og mikromanipulering7, det fullt sekvenserte genomet8 og tilgjengeligheten av RNA-interferens (RNAi) verktøy9. Å bruke denne modellorganismen til å utforske cellelæring uten hjerne eller nervesystem krever en reproduserbar prosedyre for å stimulere Stentor-celler og måle responsen.
Her introduserer vi en metode for å kvantifisere Stentor habituation ved hjelp av et mikrokontrollerbrettkoblet apparat som kan levere mekaniske pulser med en spesifisert kraft og frekvens, inkludert metoder for å bygge apparatet og sette opp eksperimentet på en måte som minimerer eksterne forstyrrelser (figur 1). Å forstå habituation på nivået av en enkelt celle vil bidra til å karakterisere læringsparadigmer som er uavhengige av komplekse kretsløp.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig01.jpg"> Figur 1: Oppsett av tilvenningseksperiment. Petriplaten som inneholder Stentor er plassert på toppen av den fleksible metalllinjalen til tilvenningsanordningen. Armaturen til habituation-enheten treffer deretter metalllinjalen ved en spesifisert kraft og frekvens, og produserer en stimulusbølge over cellefeltet. USB-mikroskopkameraet registrerer Stentors respons på stimuleringen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig02.jpg"> Figur 2: Sammendrag av arbeidsflyten for tilvenningseksperimentet. Figuren viser de grunnleggende trinnene som er involvert i å studere Stentor ved hjelp av tilvenningsenheten. Figuren ble opprettet med BioRender.com. Tilpasset fra «Prosessflytskjema», av BioRender.com (2022). Hentet fra https://app.biorender.com/biorender-templates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% Poly-ornithine&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Used to coat Petri plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Petri plate</td>
			<td>Benz Microscope Optics Center Inc.</td>
			<td>L331</td>
			<td>Contains Stentor during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>38016</td>
			<td>Used to wash Stentor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard, 4&#34; x 24&#34; x 1/2&#34; (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB424</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big easy driver stepper motor driver board (x1)</td>
			<td>Sparkfun</td>
			<td>ROB-12859</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Construction rail, 1&#34; x 5&#39;&#39; (x2)</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport CR-1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://www.apple.com/macbook-air-m1/</td>
			<td>Connect laptop to USB microscope to visualize experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large right-angle bracket (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90RL</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>A000066</td>
			<td>Used to control habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A&#160;84oz.in&#160;48mm 4-Lead&#160;</td>
			<td>Stepperonline.com</td>
			<td>5-17HS19-2004S1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized spring water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td>Media for Stentor experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize Stentor during wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>131598</td>
			<td>These are the cells used for habituation experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB microscope</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>44308</td>
			<td>Used to visualize and record experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcam recorder</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12</td>
			<td>Install this application to take videos of experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying habituation in stentor coeruleus

Læring er vanligvis forbundet med et komplekst nervesystem, men det er økende bevis på at livet på alle nivåer, ned til enkeltceller, kan vise intelligent atferd. I både naturlige og kunstige systemer er læring den adaptive oppdateringen av systemparametere basert på ny informasjon, og intelligens er et mål på beregningsprosessen som letter læring. Stentor coeruleus er en encellet damboende organisme som utviser habituation, en form for læring der en atferdsrespons avtar etter en gjentatt stimulus. Stentor trekker seg sammen som svar på mekanisk stimulering, som er en tilsynelatende rømningsrespons fra akvatiske rovdyr. Imidlertid induserer gjentatte forstyrrelser med lav kraft tilvenning, demonstrert av en progressiv reduksjon i kontraksjonssannsynligheten. Her introduserer vi en metode for å kvantifisere Stentor habituation ved hjelp av et mikrokontrollerkortkoblet apparat som kan levere mekaniske pulser med en spesifisert kraft og frekvens, inkludert metoder for å bygge apparatet og sette opp eksperimentet på en måte som minimerer eksterne forstyrrelser. I motsetning til de tidligere beskrevne tilnærmingene for mekanisk stimulering av Stentor, tillater denne enheten at stimuleringskraften kan varieres under datastyring i løpet av et enkelt eksperiment, og øker dermed mangfoldet av inngangssekvenser som kan brukes. Å forstå habituation på nivået av en enkelt celle vil bidra til å karakterisere læringsparadigmer som er uavhengige av komplekse kretsløp.

Metoden beskrevet ovenfor, ved bruk av nivå 4 mekanisk puls med en frekvens på 1 trykk / min, bør resultere i en progressiv reduksjon i sammentrekningssannsynligheten for Stentor innen 1 time. Dette er en indikasjon på tilvenning (se figur 6, video 2).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig06v2.jpg"> Figur 6: Tilvenning ved baseline. Kontraksjonssannsynligheten for Stentor avtar gradvis i løpet av 1 time etter å ha mottatt mekaniske pulser på nivå 4 med en frekvens på 1 trykk/min (n = 22-27). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Video 2. Video av habituated Stentor. Cellene mottar en nivå 4 mekanisk stimulus etter 1 time for å motta mekaniske pulser av samme kraft med en frekvens på 1 trykk / min. De fleste cellene har habituert til stimuli i løpet av timen og trekker seg dermed ikke sammen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_2_JoVE.mp4" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Endring av kraften og/eller frekvensen til den mekaniske pulstilførselen kan endre Stentor habituation-dynamikken. For eksempel utelukker bruk av nivå 2-pulsen med en frekvens på 1 trykk/min tilvenning i løpet av 1 time (se figur 7). En nivå 5-puls skal fremkalle sammentrekninger hos få til null Stentor.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig7v2.jpg"> Figur 7: Mangel på tilvenning innen 1 time for sterkere krefter. Kontraksjonssannsynligheten for Stentor avtar ikke nevneverdig i løpet av 1 time etter å ha mottatt mekaniske pulser på nivå 2 med en frekvens på 1 trykk/min (n = 7-33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig07largev2.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Vi introduserer en metode for å kvantifisere Stentor habituation ved hjelp av et mikrokontrollerkortkoblet apparat som kan levere mekaniske pulser med en spesifisert kraft og frekvens. Vi inkluderer også metoder for montering av apparatet og oppsett av eksperimentet på en måte som minimerer eksterne forstyrrelser.

Studerer Habituation i Stentor coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display ...

Å studere habituation på nivået av en enkelt celle vil bidra til å karakterisere læringsparadigmer som er uavhengige av komplekse nevrale kretser, og dermed hjelpe oss å forstå opprinnelsen til intelligens. Denne teknikken gjør at kraften og frekvensen av mekanisk stimulering levert til celler kan varieres under automatisk datastyring, og dermed øke mangfoldet av inngangssekvenser. Ved å bruke disse metodene for å studere cellulær habituation vil vi lære mer om forhold som ADHD og Tourettes syndrom der habituation er svekket.For å begynne, koble motorføreren til motoren ved å koble de to ledningene merket A fra førerkortet til de blå og røde ledningene på motoren. Koble deretter de to ledningene merket B fra førerkortet til de grønne og svarte ledningene på motoren. Etter å ha bygget brødbrettkretsen med spesiell forsiktighet for å koble lysdiodene i riktig polaritet, kobler du VCC fra førerkortet til toppskinnen på det hvite brødbrettet.Og bakken fra førerbrettet til bunnen av brødbrettet. Deretter kobler du bakken på brødbrettet til jordstiften på mikrokontrollerkortet. Koble deretter henholdsvis den grønne LED-lampen, den røde LED-lampen, bryteren og knappledningene til mikrokontrollerkortets digitale pinner 8, 9, 10 og 11.Koble mikrokontrollerkortets digitale pinner to og tre til førerkortets ledninger, trinn og retning. Koble deretter pinne fire til MS1, fest fem til MS2, PIN seks til MS3, og fest syv for å aktivere. For å drive driverkortet, koble 12 volt forsyningen til den svarte grønne adapterpluggen, festet med to røde ledninger til motordriverkortet.Last ned kontrollprogrammet til mikrokontrollerkortet. Bruk en USB-kabel til å koble mikrokontrollerkortet til en datamaskin, som også vil fungere som strømkilde for mikrokontrollerkortet. Etter å ha oppnådd Stentor, belegg en 35 millimeter plate ved å legge til tre milliliter av 0,01% polyornitinoppløsningen til platen og la stå over natten.Vask platen to ganger med ultrarent vann og en gang med pasteurisert kildevann. Tilsett deretter 3, 5 ml pasteurisert kildevann til 35 millimeterplaten. Tilsett tre milliliter pasteurisert kildevann til den første brønnen og fem milliliter til den andre og tredje brønnen.Bruk en P1000-pipette til å tilsette to milliliter Stentor fra en kulturrett til den første brønnen på tallerkenen med seks brønner. Identifiser individuell Stentor med et stereomikroskop og bruk deretter en P20-pipette til å overføre 100 Stentor fra den første brønnen til den andre brønnen. Tilsvarende, etter å ha identifisert individuell Stentor med et stereomikroskop som vist tidligere, overfør 100 Stentor fra den andre brønnen til den tredje brønnen ved hjelp av en P20-pipette.Bruk deretter en P200-pipette, overfør 100 Stentor i et totalt volum på 500 mikroliter, fra den tredje brønnen på den seks brønnplaten til 35 millimeterplaten slik at det endelige volumet er fire milliliter. Tape et stykke hvitt papir til metalllinjalen på tilvenningsanordningen, og sørg for at venstre kant av papiret er to centimeter fra enden av linjalen nærmest ankeret. Bruk dobbeltsidig tape, fest bunnen av 35 millimeterplaten til midten av det to ganger to tommer papiret på toppen av linjalen på tilvenningsenheten.La 35 millimeterplaten stå på tilvenningsanordningen i minst to timer med lokket lukket. Sentrer USB-mikroskopkameraet rett over Stentors 35 millimeter plate. For å installere webkameraopptakerprogrammet, åpne webkameraopptaker-appen og velg USB-mikroskopet fra rullegardinmenyen.Juster fokuset på USB-mikroskopkameraet slik at cellene er tydelig synlige og kameraposisjonen for å maksimere antall celler i synsfeltet. Etter å ha åpnet mikrokontrollerkortets serielle skjerm, velg ingen linjeavslutning"og sett den til 9.600 baud. Bruk L-kommandoen på mikrokontrollerkortprogrammet for å senke ankeret til det knapt berører linjalen og R-kommandoen for å heve armen om nødvendig for å justere den nøyaktige posisjonen.Bruk I-kommandoen til å initialisere den automatiske modusen på tilvenningsenheten. Skriv inn trinnstørrelsen og tiden mellom pulser i minutter på kommandolinjen. Begynn å ta en video ved hjelp av webkameraopptaker-appen ved å trykke på den røde opptaksknappen.Vri deretter bryteren på tilvenningsapparatet for å starte eksperimentet med den første automatiserte mekaniske pulsleveransen. Umiddelbart før den første mekaniske pulsen vises på videoen, pause og telle antall Stentor som både er forankret til bunnen av 35 millimeterplaten og utvidet i en langstrakt trompetlignende form. På samme måte, etter den første pulsen, teller antall Stentor som både er forankret til bunnen av platen og kontrahert til en balllignende form.Del den andre tellingen med den første tellingen for å bestemme brøkdelen av Stentor som kontraherte som svar på den mekaniske stimulansen, mens du gjentar prosedyren for alle mekaniske pulser i forsøket. Sammentrekningssannsynligheten for Stentor ble overvåket, og resultatene viste at den gradvis avtar i løpet av en time. Etter å ha mottatt nivå fire mekaniske pulser med en frekvens på ett trykk per minutt, noe som indikerer habituation.Endring av kraften eller frekvensen til den mekaniske pulsleveransen kan endre Stentor habituation-dynamikken. Mens du bruker nivå to pulssett med frekvens på ett trykk per minutt, utelukker tilvenning i løpet av en time. Vi kan studere ulike typer tilvenningsdynamikk ved å endre kraften og frekvensen av mekanisk stimulering.Dette er en mulighet til å utforske ulike typer læring, for eksempel sensibilisering. Kvantitativ innsikt om enkeltcellelæring, hentet fra våre metoder, kan inspirere andre veier for omprogrammering av celler i flercellet vev. En annen potensiell måte å bekjempe sykdom på.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studerer proteolyse av Cyclin B på Single Cell nivå i hele cellepopulasjoner

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studerer DNA Looping av Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

En In Vitro -modellen for å undersøke mobilnettet transformasjon av Kaposis sarkom Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studerer mitokondrie struktur og funksjon i<em&gt; Drosophila</em&gt; Eggstokkene

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...