Name: studying habituation in stentor coeruleus
Uploaded: 2023-01-06T13:45:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

Vi tackar Tatyana Makushok för otaliga diskussioner om Stentor-lärande . Detta arbete finansierades av NSF-bidrag MCB- 2012647 och av NIH-bidrag R35 GM130327, samt av I2CELL-utmärkelsen från Foundation Fourmentin-Guilbert.

OBS: En sammanfattning av arbetsflödet för tillvänjningsexperiment visas i figur 2.
1. Montering av tillvänjningsanordningen
<ol><li>Haka fast motordrivrutinen i motorn (se figur 3).<ol><li>Anslut de två ledningarna märkta A från förarkortet till de blå och röda ledningarna på motorn. Anslut de två ledningarna märkta B från förarkortet till de gröna och svarta ledningarna på motorn. OBS: När man tittar ner på förarkortet ovanifrån med motorkablarna högst upp bör de fyra ingångskablarna anslutas till motorkablarna i denna ordning: blå, röd, svart och grön.</li>
	</ol></li>
	<li>Bygg brödbrädekretsen som visas i figur 4, med särskild försiktighet för att ansluta lysdioderna i rätt polaritet.</li>
	<li>Anslut Vcc (+5 V) från förarkortet till den övre skenan på den vita brödbrädan och Gnd från förarkortet till brödbrädans nedre skena.</li>
	<li>Anslut brödbrädans mark till mikrokontrollkortets jordstift. Anslut den gröna lysdioden, den röda lysdioden, omkopplaren respektive knappkablarna till mikrokontrollerkortets digitala stift 8, 9, 10 och 11.</li>
	<li>Anslut mikrokontrollerkortets digitala stift 2 och 3 till förarkortets ledningar Step och Dir.</li>
	<li>Anslut mikrokontrollerkortets digitala stift 4, 5, 6 och 7 till förarkortets ledningar.<ol><li>Anslut stift 4 till MS1, anslut stift 5 till MS2, anslut stift 6 till MS3 och anslut stift 7 till aktivera.</li>
	</ol></li>
	<li>Strömförarkortet med en 12 V strömförsörjning. Anslut 12 V-matningen till den svart/gröna adapterkontakten som är fäst med två röda ledningar på motorförarkortet. OBS: Anslut inte 12 V-matningen till mikrokontrollerkortets kontakt.</li>
	<li>Ladda ner kontrollprogrammet (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) på mikrokontrollerkortet.</li>
	<li>Använd en USB-kabel för att ansluta mikrokontrollerkortet till en dator, som också fungerar som strömkälla för mikrokontrollerkortet.</li>
	<li>Kontrollera att användarkontroller fungerar.<ol><li>Kontrollera att skjutreglaget slår på och av det automatiska läget. I automatiskt läge tar systemet ett steg med jämna mellanrum som anges av användaren (se nedan).</li>
		<li>Kontrollera att den gröna lysdioden tänds när det automatiska läget är på.</li>
		<li>Kontrollera att den röda lysdioden blinkar 1 s innan motorn applicerar en puls. Den röda lysdioden är en varningslampa som indikerar när systemet är på väg att leverera en mekanisk puls.</li>
		<li>Testa den röda knappen, som utlöser ett 1/16 mikrosteg varje gång knappen trycks in, oavsett om systemet är i automatiskt läge.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig03.jpg"> Bild 3: Komponenter i tillvänjningsanordningen. All märkt elektronik krävs för att montera maskinen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig04.jpg"> Figur 4: Elektronikschema. Detta är kretsen på brödbrädan. Ledningarna som ansluter till mikrokontrollerkortet är numrerade enligt beskrivningen i protokollet. D1 och D2 är de röda respektive gröna lysdioderna och är anslutna till jord genom 330 Ω motstånd. De två omkopplarna dras upp med 10 KΩ motstånd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
2. Ställa in tillvänjningsexperimentet
<ol><li>Skaffa Stentor.</li>
	<li>Täck en 35 mm platta med 0,01% poly-ornitinlösning.<ol><li>Tillsätt 3 ml av 0,01% poly-ornitinlösning till plattan och låt stå över natten.</li>
		<li>Tvätta plattan två gånger med ultrarent vatten och en gång med pastöriserat källvatten (PSW) (Materialtabell).</li>
	</ol></li>
	<li>Tillsätt 3,5 ml PSW till 35 mm-plattan.</li>
	<li>Tvätta Stentor i en 6-brunnsplatta (Materialtabell).<ol><li>Tillsätt 3 ml PSW till den första brunnen och 5 ml PSW till den andra och tredje brunnen. Använd en P1,000-pipett för att tillsätta 2 ml Stentor från en odlingsskål till den första brunnen på 6-brunnsplattan.</li>
		<li>Identifiera enskilda Stentor med ett stereomikroskop (Materialtabell) och använd sedan en P20-pipett för att överföra 100 Stentor från den första brunnen till den andra brunnen.</li>
		<li>Identifiera enskilda Stentor med ett stereomikroskop och använd sedan en P20-pipett för att överföra 100 Stentor från den andra brunnen till den tredje brunnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Använd en P200-pipett för att överföra 100 Stentor i en total volym på 500 μl från den tredje brunnen på 6-brunnsplattan till 35 mm-plattan så att den slutliga volymen i 35 mm-plattan är 4 ml.</li>
	<li>Tejpa en bit (7 cm x 7 cm) vitt papper på metalllinjalen på tillvänjningsanordningen. Se till att papperets vänstra kant är 2 cm från änden av linjalen närmast ankaret.</li>
	<li>Använd dubbelhäftande tejp för att fästa botten på 35 mm-plattan i mitten av 2 tum x 2 i papper ovanpå linjalen på tillvänjningsanordningen.</li>
	<li>Lämna 35 mm-plattan på tillvänjningsanordningen i minst 2 timmar (detta kan förlängas till över natten) med locket stängt. Under hela denna acklimatiseringsperiod, håll plattan i omgivande ljusförhållanden som matchar de experimentella ljusförhållandena (dvs. utsätt inte cellerna för ljusa / mörka fluktuationer). Se också till att plattan inte upplever några mekaniska störningar från oavsiktlig stötning.</li>
	<li>Centrera USB-mikroskopkameran (Table of Materials) direkt ovanför Stentors 35 mm-platta. Placera vid behov en rekvisita som en pipettspetslåda under USB-mikroskopkameran (Universal Serial Bus) för att justera höjden. Alternativt kan ett ringställ användas för att justera höjden.</li>
	<li>Installera webbkamerainspelningsprogrammet på en bärbar dator (materialtabell) och använd den för att visualisera cellerna via mikroskopingången.<ol><li>Öppna appen Webbkamerainspelare och välj USB-mikroskopet i rullgardinsmenyn. Justera fokus på USB-mikroskopkameran så att cellerna syns tydligt.</li>
		<li>Justera USB-mikroskopkamerans position för att maximera antalet celler i synfältet.</li>
	</ol></li>
	<li>Öppna den seriella bildskärmen för mikrokontrollerkortet: välj No Line Ending och ställ in den på 9,600 baud.</li>
	<li>Använd kommandot l på mikrokontrollerkortprogrammet för att sänka ankaret tills det knappt rör linjalen. Använd kommandot r för att höja armen om det behövs för att justera den exakta positionen. OBS: Om ankaret är ett betydande avstånd från linjalen, skriv in d-kommandot för att inaktivera motorspolens ström så att armen kan flyttas manuellt mot linjalen. När du har flyttat armen manuellt använder du kommandot e för att aktivera motorspolens ström och hålla armen låst på plats. När den sänks ordentligt före starten av ett experiment bör armaturens nedre spets vara 1 cm från linjalens vänstra kant. Ankaret kommer att leverera den mekaniska pulsen genom att slå linjalen.</li>
	<li>Använd kommandot i för att initiera det automatiska läget på tillvänjningsenheten.</li>
	<li>Ange stegstorleken i kommandoraden. Nivå 5 är det minsta steget och nivå 1 är det största steget. Nivå 4 är den stegstorlek som används för baslinjetillvänjningsexperiment. OBS: En nivå 5-stimulans resulterar i en nedåtgående förskjutning av linjalen med ~ 0,5 mm; Nivå 4 resulterar i förskjutning nedåt med ~ 1 mm; Nivå 3 resulterar i nedåtgående förskjutning med ~ 2 mm; Nivå 2 resulterar i nedåtgående förskjutning med ~ 3-4 mm; och nivå 1 resulterar i nedåtgående förskjutning med ~ 8 mm. En nivå 5-stimulans resulterar i en nedåtgående toppkraft för ankaret mot linjalen på ~ 0,122 N; Nivå 4 resulterar i en nedåtgående toppkraft på ~ 0,288 N; och nivå 3 resulterar i en nedåtgående toppkraft på ~ 0,557 N. De nedåtgående krafterna som genereras av nivå 1 och nivå 2 är svårare att empiriskt kvantifiera med en dynamometer på grund av de signifikanta linjaloscillationerna som uppstår efter att ankaret har kommit i kontakt.</li>
	<li>Ange tiden mellan pulserna i minuter. Intervallet som används för baslinjetillvänjningsexperiment är 1 min.</li>
	<li>Börja ta en video med webbkamerainspelningsappen genom att trycka på den röda inspelningsknappen. Vänd sedan på strömbrytaren på tillvänjningsapparaten för att börja experimentet med den första automatiserade mekaniska pulsleveransen.</li>
</ol>3. Analysera experimentvideon
<ol><li>Omedelbart innan den första mekaniska pulsen visas på videon, pausa och räkna antalet Stentor som både är förankrade i botten av 35 mm-plattan och utsträckta i en långsträckt, trumpetliknande form (figur 5A, video 1).</li>
	<li>Omedelbart efter den första pulsen, räkna antalet Stentor som både är förankrade i botten av plattan och sammandragna i en bollliknande form (figur 5B, video 1). OBS: Kontrakterade celler är lätta att urskilja från långsträckta celler eftersom Stentor förkortar deras kroppslängd med över 50% inom 10 ms under en sammandragningshändelse3.</li>
	<li>Dela den andra räkningen med den första räkningen för att bestämma fraktionen av Stentor som kontrakterade som svar på den mekaniska stimulansen.</li>
	<li>Upprepa steg 3.1–3.3 för alla mekaniska pulser i experimentvideon.</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig05.jpg"> Figur 5: Stentor kontraherar efter att ha fått en mekanisk stimulans. (A) Stentor är i sitt långsträckta tillstånd och förankrade i botten av petriplattan. (B) Stentor har dragit ihop sig efter att ha fått en mekanisk stimulering på nivå 4 från tillvänjningsanordningen. Bilderna är tagna med ett USB-mikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Video 1: Video av Stentor-kontrakt. Stentor får en mekanisk stimulans på nivå 4 från tillvänjningsanordningen varje minut. Dessa celler har ännu inte vant sig, så de kontraherar efter att ha fått pulsen. Cellerna finns i petriplattan placerad ovanpå tillvänjningsanordningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_1_JoVE.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>

<ol>
	<li>Dussutour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+single+cell+organisms.">Learning in single cell organisms.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).</li><li>Sternberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intelligence.">Intelligence.</a> Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parametric+studies+of+the+response+decrement+produced+by+mechanical+stimuli+in+the+protozoan,+Stentor+coeruleus.">Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus.</a> Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+learning.">Cell learning.</a> Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specific+habituation+in+a+protozoan.">Stimulus specific habituation in a protozoan.</a> Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).</li><li>Thompson, R. F., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation:+A+model+phenomenon+for+the+study+of+neuronal+substrates+of+behavior.">Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior.</a> Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).</li><li>Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stentor+coeruleus.">Stentor coeruleus.</a> Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).</li><li>McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+is+altered+in+neuropsychiatric+disorders-A+comprehensive+review+with+recommendations+for+experimental+design+and+analysis.">Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

De mest kritiska stegen i protokollet avser att säkerställa att Stentor förblir i optimala förhållanden för att sammandragningar ska inträffa. Sammandragningssvaret i tillvänjningsanalysen kräver att stentorer är förankrade i en yta med hjälp av sin klibbiga hållfasthet eftersom de sällan drar ihop sig när de simmar fritt. Bottenytan på den 35 mm petriplatta som används för tillvänjningsexperiment bidrar dock vanligtvis inte till förankring om den inte är belagd med polyornitin. Dessutom kan Stentor inte utsättas för någon mekanisk störning i minst 2 timmar före tillvänjningsexperimentets början eftersom Stentor-glömskans tidsskala är 2-6 h3. Om Stentor får mekanisk stimulering inom 2 timmar efter tillvänjningsexperimentets starttid, finns det en möjlighet att denna tidigare stimulering kommer att inducera en liten nivå av tillvänjning före experimentet, vilket minskar sammandragningssannolikheten efter att tillvänjningsanordningen levererar den första mekaniska pulsen. Slutligen, under analyssteget, är det viktigt att bara räkna antalet Stentor som dras samman efter en puls - snarare än några tillfälliga spontana sammandragningar som inträffar före pulsleveransen - för att få en korrekt avläsning av den fraktion av celler som drog ihop sig som svar på den mekaniska stimuleringen.
Protokollet kan lätt modifieras för att studera olika typer av tillvänjningsdynamik genom att ändra kraften och frekvensen hos de mekaniska pulser som levereras av tillvänjningsanordningen. Detta ger också en möjlighet att utforska andra typer av lärande, såsom sensibilisering, som kan uppstå i Stentor. Själva programkoden för mikrokontrollerkortet kan också justeras för att leverera olika mönster av mekaniska kranar till Stentor.
Ett potentiellt problem att felsöka med detta protokoll är den låga frekvensen av Stentor-förankring , vilket kan begränsa antalet Stentor som kan observeras i tillvänjningsexperimentet. Förankringsfrekvensen reduceras ibland i Stentor-kulturer som inte nyligen har matats eller är förorenade. För att lösa detta problem bör man tvätta en ny sats Stentor för att starta en ny kultur och mata dem regelbundet enligt protokollet som beskrivs i Lin et al.10.
Detta protokoll är begränsat genom att endast en enda platta av Stentor kan testas åt gången, vilket resulterar i relativt låga genomströmningsmätningar. Dessutom tillåter nuvarande programvara inte automatisering av encellsbildanalys. De flesta uppgifter som inhämtas är därför på befolkningsnivå. Framtida modeller av tillvänjningsanordningen och bildanalysverktyg kan underlätta encellsexperiment med hög genomströmning.
Tillvänjning i Stentor har tidigare studerats med metoder som beskrivs av Wood3, men detta nya protokoll gör det möjligt att automatisera experiment. Automatisering gör det inte bara möjligt för forskaren att reproducerbart leverera mekaniska pulser med en viss kraft och frekvens utan underlättar också långsiktiga tillvänjningsexperiment eftersom enheten kan lämnas igång utan övervakning i flera dagar. Att använda en stegmotor snarare än solenoiden som används i Woods experiment3 minskar dessutom risken för avmagnetisering över tid och gör det också möjligt att variera stimulansens styrka under ett enda experiment.
Att studera cellulär tillvänjning kan avslöja kliniska insikter för tillstånd som uppmärksamhetsunderskott / hyperaktivitetsstörning (ADHD) och Tourettes syndrom där tillvänjningen är nedsatt11. Stentors tillvänjningsmekanismer kan också avslöja nya icke-synaptiska inlärningsparadigmer oberoende av komplexa cellulära kretsar. Slutligen kan insikter om encellsinlärning inspirera metoder för omprogrammering av celler i flercelliga vävnader - en annan potentiell väg att bekämpa sjukdomar.

Lärande är vanligtvis förknippat med ett komplext nervsystem, men det finns ökande bevis för att livet på alla nivåer, ner till enskilda celler, kan visa intelligenta beteenden. I både naturliga och artificiella system är lärande den adaptiva uppdateringen av systemparametrar baserat på ny information1, och intelligens är ett mått på beräkningsprocessen som underlättar inlärning2.
Stentor coeruleus är en encellig dammboende organism som uppvisar tillvänjning, en form av inlärning där ett beteendemässigt svar minskar efter en upprepad stimulans3. Stentor kontraherar som svar på mekanisk stimulering3, vilket är ett uppenbart flyktsvar från vattenlevande rovdjur. Upprepade störningar med låg kraft inducerar emellertid tillvänjning, vilket demonstreras av en progressiv minskning av sammandragningssannolikheten3. Den vana Stentor drar sig fortfarande samman efter att ha fått mekanisk stimulering med hög kraft4 eller fotisk stimulering5. Dessa observationer, som överensstämmer med Thompson och Spencers klassiska kriterier för tillvänjning hos djur6, tyder starkt på att den ursprungliga kontraktila svarsminskningen beror på inlärning snarare än trötthet eller ATP-utarmning. Som en fritt levande cell kan Stentor studeras utan mycket störningar från omgivande celler, vilket skulle vara fallet i en multicellulär vävnad. Flera ytterligare funktioner gör Stentor till ett lätthanterligt system för att studera inlärning: dess stora storlek (1 mm), dess kvantifierbara tillvänjningssvar3, enkel injektion och mikromanipulering7, det helt sekvenserade genomet8 och tillgängligheten av RNA-interferens (RNAi) verktyg9. Att använda denna modellorganism för att utforska cellinlärning utan hjärna eller nervsystem kräver en reproducerbar procedur för att stimulera Stantor-celler och mäta svaret.
Här introducerar vi en metod för att kvantifiera Stentor-tillvänjning med hjälp av en mikrokontroller-kortlänkad apparat som kan leverera mekaniska pulser vid en viss kraft och frekvens, inklusive metoder för att bygga apparaten och ställa in experimentet på ett sätt som minimerar yttre störningar (figur 1). Att förstå tillvänjning på nivå med en enda cell hjälper till att karakterisera inlärningsparadigmer som är oberoende av komplexa kretsar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig01.jpg"> Bild 1: Inställning av tillvänjningsexperiment. Petriplattan som innehåller Stentor placeras ovanpå den flexibla metalllinjalen på tillvänjningsanordningen. Ankaret på tillvänjningsanordningen träffar sedan metalllinjalen vid en viss kraft och frekvens, vilket ger en stimulansvåg över cellfältet. USB-mikroskopkameran registrerar Stentors svar på stimuleringen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig02.jpg"> Bild 2: Sammanfattning av arbetsflödet för tillvänjningsexperimentet. Figuren visar de grundläggande stegen som är involverade i att studera Stentor med hjälp av tillvänjningsanordningen. Figuren skapades med BioRender.com. Anpassad från "Process Flowchart", av BioRender.com (2022). Hämtad från https://app.biorender.com/biorender-templates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% Poly-ornithine&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Used to coat Petri plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Petri plate</td>
			<td>Benz Microscope Optics Center Inc.</td>
			<td>L331</td>
			<td>Contains Stentor during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>38016</td>
			<td>Used to wash Stentor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard, 4&#34; x 24&#34; x 1/2&#34; (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB424</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big easy driver stepper motor driver board (x1)</td>
			<td>Sparkfun</td>
			<td>ROB-12859</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Construction rail, 1&#34; x 5&#39;&#39; (x2)</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport CR-1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://www.apple.com/macbook-air-m1/</td>
			<td>Connect laptop to USB microscope to visualize experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large right-angle bracket (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90RL</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>A000066</td>
			<td>Used to control habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A&#160;84oz.in&#160;48mm 4-Lead&#160;</td>
			<td>Stepperonline.com</td>
			<td>5-17HS19-2004S1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized spring water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td>Media for Stentor experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize Stentor during wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>131598</td>
			<td>These are the cells used for habituation experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB microscope</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>44308</td>
			<td>Used to visualize and record experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcam recorder</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12</td>
			<td>Install this application to take videos of experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying habituation in stentor coeruleus

Lärande är vanligtvis förknippat med ett komplext nervsystem, men det finns ökande bevis för att livet på alla nivåer, ner till enskilda celler, kan visa intelligenta beteenden. I både naturliga och artificiella system är lärande den adaptiva uppdateringen av systemparametrar baserat på ny information, och intelligens är ett mått på beräkningsprocessen som underlättar lärandet. Stentor coeruleus är en encellig dammboende organism som uppvisar tillvänjning, en form av inlärning där ett beteendemässigt svar minskar efter en upprepad stimulans. Stentor kontraherar som svar på mekanisk stimulering, vilket är ett uppenbart flyktsvar från vattenlevande rovdjur. Upprepade störningar med låg kraft inducerar emellertid tillvänjning, vilket demonstreras av en progressiv minskning av kontraktionssannolikheten. Här introducerar vi en metod för att kvantifiera Stentor-tillvänjning med hjälp av en mikrokontroller-kortlänkad apparat som kan leverera mekaniska pulser vid en viss kraft och frekvens, inklusive metoder för att bygga apparaten och ställa in experimentet på ett sätt som minimerar yttre störningar. I motsats till de tidigare beskrivna tillvägagångssätten för mekaniskt stimulerande Stentor, tillåter denna anordning att stimuleringskraften varieras under datorkontroll under ett enda experiment, vilket kraftigt ökar de olika ingångssekvenserna som kan appliceras. Att förstå tillvänjning på nivå med en enda cell hjälper till att karakterisera inlärningsparadigmer som är oberoende av komplexa kretsar.

Metoden som beskrivs ovan, med användning av den mekaniska pulsen på nivå 4 med en frekvens av 1 kran/min, bör resultera i en progressiv minskning av Stentors sammandragningssannolikhet inom 1 h. Detta är ett tecken på tillvänjning (se figur 6, video 2).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig06v2.jpg"> Figur 6: Baslinjetillvänjning. Kontraktionssannolikheten för Stentor minskar gradvis under 1 h efter att ha fått mekaniska pulser på nivå 4 med en frekvens av 1 kran/min (n = 22-27). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Videor 2. Video av van Stentor. Cellerna får en mekanisk stimulans på nivå 4 efter 1 h mottagande av mekaniska pulser med samma kraft med en frekvens av 1 kran / min. De flesta cellerna har vant sig vid stimuli under timmen och drar därmed inte ihop sig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_2_JoVE.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Att ändra kraften och/eller frekvensen för den mekaniska pulstillförseln kan förändra Stentors tillvänjningsdynamik. Om du till exempel använder pulsen på nivå 2 med en frekvens på 1 kran/min utesluter du tillvänjning under 1 timme (se figur 7). En nivå 5-puls bör framkalla sammandragningar hos få till noll Stentor.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig7v2.jpg"> Figur 7: Brist på tillvänjning inom 1 h för starkare krafter. Kontraktionssannolikheten för Stentor minskar inte märkbart under 1 timme efter att ha fått mekaniska pulser på nivå 2 med en frekvens av 1 kran/min (n = 7-33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig07largev2.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Vi introducerar en metod för att kvantifiera Stentor-tillvänjning med hjälp av en mikrokontroller-kortlänkad apparat som kan leverera mekaniska pulser vid en viss kraft och frekvens. Vi inkluderar också metoder för att montera apparaten och ställa in experimentet på ett sätt som minimerar yttre störningar.

Studera tillvänjning i Stentor coeruleus

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display ...

Att studera tillvänjning på nivå med en enda cell hjälper till att karakterisera inlärningsparadigmer som är oberoende av komplexa neurala kretsar och därmed hjälpa oss att förstå intelligensens ursprung. Denna teknik gör att kraften och frekvensen av mekanisk stimulering som levereras till celler kan varieras under automatisk datorkontroll, vilket kraftigt ökar mångfalden av ingångssekvenser. Att använda dessa metoder för att studera cellulär tillvänjning hjälper oss att lära oss mer om tillstånd som ADHD och Tourettes syndrom där tillvänjning är nedsatt.För att börja, haka motordrivrutinen till motorn genom att ansluta de två ledningarna märkta A från förarkortet till de blå och röda ledningarna på motorn. Anslut sedan de två ledningarna märkta B från förarkortet till de gröna och svarta ledningarna på motorn. Efter att ha byggt brödbrädekretsen med särskild försiktighet för att ansluta lysdioderna i rätt polaritet, anslut VCC från förarkortet till den övre skenan på den vita brödbrädan.Och marken från förarbrädan till brödbrädans bottenskena. Anslut sedan brödbrädans mark till mikrokontrollerkortets jordstift. Anslut sedan den gröna lysdioden, den röda lysdioden, omkopplaren respektive knappkablarna till mikrokontrollerkortets digitala stift 8, 9, 10 och 11.Anslut mikrokontrollerkortets digitala stift två och tre till förarkortets ledningar, steg och riktning. Anslut sedan stift fyra till MS1, stift fem till MS2, PIN-kod sex till MS3 och stift sju för att aktivera. För att driva förarkortet, anslut 12 volts matningen till den svarta gröna adapterkontakten, fäst med två röda ledningar på motordrivkortet.Ladda ner kontrollprogrammet till mikrostyrenheten. Använd en USB-kabel för att ansluta mikrokontrollerkortet till en dator, som också fungerar som strömkälla för mikrokontrollerkortet. Efter att ha erhållit Stentor, täck en 35 millimeter platta genom att tillsätta tre milliliter av 0,01% polyornitinlösningen till plattan och lämna över natten.Tvätta plattan två gånger med ultrarent vatten och en gång med pastöriserat källvatten. Tillsätt sedan 3,5 ml pastöriserat källvatten till 35 millimeter plattan. Tillsätt tre milliliter pastöriserat källvatten till den första brunnen och fem milliliter till den andra och tredje brunnen.Använd en P1000-pipett och tillsätt två milliliter Stentor från en odlingsskål till den första brunnen på sexbrunnsplattan. Identifiera enskilda Stentor med ett stereomikroskop och använd sedan en P20-pipett för att överföra 100 Stentor från den första brunnen till den andra brunnen. På samma sätt, efter att ha identifierat enskilda Stentor med ett stereomikroskop som visats tidigare, överför 100 Stentor från den andra brunnen till den tredje brunnen med hjälp av en P20-pipett.Överför sedan 100 Stentor med en P200-pipett i en total volym på 500 mikroliter, från den tredje brunnen i den sex brunnsplattan till 35 millimeter-plattan så att den slutliga volymen är fyra milliliter. Tejpa en bit vitt papper på metalllinjalen på tillvänjningsanordningen, så att papperets vänstra kant är två centimeter från linjalens ände närmast ankaret. Använd dubbelsidig tejp och fäst botten på 35 millimeter-plattan i mitten av två med två tum papper ovanpå linjalen på tillvänjningsanordningen.Lämna 35 millimeter-plattan på tillvänjningsanordningen i minst två timmar med locket stängt. Centrera USB-mikroskopkameran direkt ovanför Stentors 35 millimeters platta. För att installera webbkamerainspelningsprogrammet, öppna webbkamerainspelningsappen och välj USB-mikroskopet från rullgardinsmenyn.Justera fokus på USB-mikroskopkameran så att cellerna är tydligt synliga och kamerapositionen för att maximera antalet celler i synfältet. När du har öppnat mikrokontrollerkortets seriella bildskärm, välj ingen radslut"och ställ in den på 9 600 baud. Använd L-kommandot på mikrokontrollerkortprogrammet för att sänka ankaret tills det knappt rör linjalen och R-kommandot för att höja armen om det behövs för att justera den exakta positionen.Använd kommandot I för att initiera det automatiska läget på tillvänjningsenheten. Ange stegstorlek och tid mellan pulser i minuter på kommandoraden. Börja ta en video med webbkamerainspelningsappen genom att trycka på den röda inspelningsknappen.Slå sedan på strömbrytaren på tillvänjningsapparaten för att börja experimentet med den första automatiserade mekaniska pulsleveransen. Omedelbart innan den första mekaniska pulsen visas på videon, pausa och räkna antalet Stentor som både är förankrade i botten av 35 millimeterplattan och förlängda i en långsträckt trumpetliknande form. På samma sätt, efter den första pulsen, räkna antalet Stentor som både är förankrade i botten av plattan och sammandragna i en bollliknande form.Dela den andra räkningen med den första räkningen för att bestämma fraktionen av Stentor som kontrakterade som svar på den mekaniska stimulansen, medan du upprepar proceduren för alla mekaniska pulser i experimentet. Stentors sammandragningssannolikhet övervakades och resultaten visade att den gradvis minskar under en timme. Efter att ha fått nivå fyra mekaniska pulser med en frekvens av en kran per minut, vilket indikerar tillvänjning.Att ändra kraften eller frekvensen för den mekaniska pulsleveransen kan ändra Stentors tillvänjningsdynamik. När du använder nivå två pulsuppsättningen med frekvens på ett tryck per minut, utesluter tillvänjning under en timme. Vi kan studera olika typer av tillvänjningsdynamik genom att ändra kraften och frekvensen av mekanisk stimulering.Detta är en möjlighet att utforska olika typer av lärande, såsom sensibilisering. Kvantitativa insikter om encellsinlärning, hämtade från våra metoder, kan inspirera andra vägar för omprogrammering av celler i flercelliga vävnader. Ett annat potentiellt sätt att bekämpa sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Studera Aggression i Drosophila (fruktflugor)

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Mikroinjektion Tekniker för att studera Mitos i Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Fönster på en mikrovärld: Enkel mikroflödessystem system för att studera mikrobiella transport i porösa material

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp och tekniker perfusion för att studera jonkanaler Uttryckt i Xenopus Oocyter

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Studera Proteolys av cyklin B på den inre cellnivå i hela cellpopulationer

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Studera DNA Looping med enda molekyl FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

En In Vitro -modell för att studera cellulära omvandling av Kaposis sarkom Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studera Mitokondriell struktur och funktion i<em&gt; Drosophila</em&gt; Äggstockar

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...