Name: studying habituation in stentor coeruleus
Uploaded: 2023-01-06T13:45:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

Tatyana Makushok'a Stentor öğrenimi hakkında sayısız tartışma için teşekkür ederiz. Bu çalışma, NSF hibesi MCB-2012647 ve NIH hibesi R35 GM130327 tarafından ve ayrıca Fourmentin-Guilbert Vakfı'ndan I2CELL ödülü ile finanse edildi.

NOT: Alışkanlık deneyi iş akışının bir özeti Şekil 2'de gösterilmiştir.
1. Alışkanlık cihazının montajı
<ol><li>Motor sürücüsünü motora bağlayın (bkz. Şekil 3).<ol><li>Sürücü kartından A etiketli iki kabloyu motordaki mavi ve kırmızı tellere bağlayın. B etiketli iki kabloyu sürücü kartından motordaki yeşil ve siyah tellere bağlayın. NOT: Motor kabloları üstte olacak şekilde sürücü kartına yukarıdan bakıldığında, dört giriş kablosu motor kablolarına şu sırayla bağlanmalıdır: mavi, kırmızı, siyah ve yeşil.</li>
	</ol></li>
	<li>LED'leri doğru polaritede bağlamak için özel bir dikkatle Şekil 4'te gösterilen breadboard devresini oluşturun.</li>
	<li>Vcc'yi (+5 V) sürücü kartından beyaz breadboard'un üst rayına ve Gnd'yi sürücü kartonundan breadboard'un alt rayına bağlayın.</li>
	<li>Breadboard'un zeminini mikrodenetleyici kartının toprak pimine bağlayın. Yeşil LED'i, kırmızı LED'i, anahtarı ve düğme tellerini sırasıyla mikrodenetleyici kartı dijital pimleri 8, 9, 10 ve 11'e bağlayın.</li>
	<li>Mikrodenetleyici kartı dijital pimleri 2 ve 3'ü sürücü kartı kablolarına bağlayın Step ve Dir.</li>
	<li>Mikrodenetleyici kartı dijital pimleri 4, 5, 6 ve 7'yi sürücü kartı kablolarına bağlayın.<ol><li>Pin 4'ü MS1'e, Pin 5'i MS2'ye, Pin 6'yı MS3'e bağlayın ve Pin 7'yi Enable'a bağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sürücü kartını 12 V güç kaynağıyla çalıştırın. 12 V beslemeyi, motor sürücü kartına iki kırmızı telle tutturulmuş siyah/yeşil adaptör fişine takın. NOT: 12 V beslemeyi mikrodenetleyici kartı fişine takmayın.</li>
	<li>Kontrol programını (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) mikrodenetleyici kartına indirin.</li>
	<li>Mikrodenetleyici kartını bir bilgisayara bağlamak için bir USB kablosu kullanın, bu da mikrodenetleyici kartı için güç kaynağı görevi görür.</li>
	<li>Kullanıcı denetimlerinin çalışıp çalışmadığını kontrol edin.<ol><li>Slayt düğmesinin otomatik modu açıp kapattığını onaylayın. Otomatik modda, sistem kullanıcı tarafından belirtilen düzenli aralıklarla bir adım atacaktır (aşağıya bakınız).</li>
		<li>Otomatik mod açıkken yeşil LED'in yandığından emin olun.</li>
		<li>Motor darbe uygulamadan önce kırmızı LED'in 1 s yanıp söndüğünü kontrol edin. Kırmızı LED, sistemin ne zaman mekanik bir darbe vermek üzere olduğunu gösteren bir uyarı ışığıdır.</li>
		<li>Sistemin otomatik modda olup olmadığına bakılmaksızın, düğmeye her basıldığında 1/16 mikro adımı tetikleyen kırmızı düğmeyi test edin.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig03.jpg"> Şekil 3: Alışkanlık cihazının bileşenleri. Makineyi monte etmek için etiketli tüm elektronikler gereklidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig04.jpg"> Şekil 4: Elektronik şematik. Bu, breadboard üzerindeki devredir. Mikrodenetleyici kartına bağlanan teller protokolde açıklandığı gibi numaralandırılır. D1 ve D2 sırasıyla kırmızı ve yeşil LED'lerdir ve 330 Ω direnç aracılığıyla toprağa bağlanır. İki anahtar 10 KΩ dirençle yukarı çekilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
2. Alışkanlık deneyinin kurulması
<ol><li>Stentor'u edinin.</li>
	<li>% 0.01 poli-ornitin çözeltisi ile 35 mm'lik bir plaka kaplayın.<ol><li>Plakaya% 0.01 poli-ornitin çözeltisinden 3 mL ekleyin ve gece boyunca bırakın.</li>
		<li>Tabağı iki kez ultra saf suyla ve bir kez pastörize kaynak suyuyla (PSW) yıkayın (Malzeme Tablosu).</li>
	</ol></li>
	<li>35 mm'lik plakaya 3,5 mL PSW ekleyin.</li>
	<li>Stentoru 6 delikli bir plakada yıkayın (Malzeme Tablosu).<ol><li>Birinci kuyuya 3 mL PSW ve ikinci ve üçüncü kuyulara 5 mL PSW ekleyin. Bir kültür kabından 6 delikli plakanın ilk kuyucuğuna 2 mL Stentor eklemek için bir P1.000 pipet kullanın.</li>
		<li>Bir stereo mikroskopla (Malzeme Tablosu) tek tek Stentor'u tanımlayın ve ardından 100 Stentor'u birinci kuyudan ikinci kuyucuğa aktarmak için bir P20 pipet kullanın.</li>
		<li>Stereo mikroskopla tek tek Stentor'u tanımlayın ve ardından 100 Stentor'u ikinci kuyudan üçüncü kuyucuğa aktarmak için bir P20 pipet kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>6 delikli plakanın üçüncü kuyucuğundan 35 mm plakaya toplam 500 μL hacimde 100 Stentor'u aktarmak için bir P200 pipet kullanın, böylece 35 mm plakadaki son hacim 4 mL'dir.</li>
	<li>Alışkanlık cihazındaki metal cetvele bir parça (7 cm x 7 cm) beyaz kağıt bantlayın. Kağıdın sol kenarının, armatüre en yakın cetvelin ucundan 2 cm uzakta olduğundan emin olun.</li>
	<li>35 mm'lik plakanın alt kısmını, alışkanlık cihazındaki cetvelin üstündeki kağıttaki 2 inç x 2'nin ortasına yapıştırmak için çift taraflı bant kullanın.</li>
	<li>35 mm'lik plakayı, kapak kapalıyken alışkanlık cihazında en az 2 saat (bu gece boyunca uzatılabilir) bırakın. Bu iklimlendirme süresi boyunca, plakayı deneysel ışık koşullarına uyan ortam ışığı koşullarında tutun (yani, hücreleri açık / karanlık dalgalanmalarına maruz bırakmayın). Ayrıca, plakanın kazara sarsıntıdan kaynaklanan herhangi bir mekanik bozulma yaşamadığından emin olun.</li>
	<li>USB mikroskop kamerasını (Malzeme Tablosu) doğrudan 35 mm'lik Stentor plakasının üzerine ortalayın. Gerekirse, yüksekliği ayarlamak için evrensel seri yol (USB) mikroskop kamerasının altına pipet ucu kutusu gibi bir pervane yerleştirin. Alternatif olarak, yüksekliği ayarlamak için bir halka standı kullanılabilir.</li>
	<li>Web kamerası kaydedici uygulamasını bir dizüstü bilgisayara (Malzeme Tablosu) yükleyin ve mikroskop girişi yoluyla hücreleri görselleştirmek için kullanın.<ol><li>Web kamerası kaydedici uygulamasını açın ve açılır menüden USB mikroskobu seçin. USB mikroskop kamerasındaki odağı, hücreler net bir şekilde görünecek şekilde ayarlayın.</li>
		<li>Görüş alanındaki hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için USB mikroskop kamerasının konumunu ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Mikrodenetleyici kartı seri monitörünü açın: Satır Sonu Yok'u seçin ve 9.600 baud'a ayarlayın.</li>
	<li>Armatürü cetvele zar zor dokunana kadar indirmek için mikrodenetleyici kart programındaki l komutunu kullanın. Tam konumu ayarlamak üzere gerekirse kolu kaldırmak için r komutunu kullanın. NOT: Armatür cetvelden önemli bir mesafedeyse, kolun cetvele doğru manuel olarak hareket ettirilebilmesi için motor bobini akımını devre dışı bırakmak üzere d komutunu yazın. Kolu manuel olarak hareket ettirdikten sonra, motor bobini akımını etkinleştirmek ve kolu yerinde kilitli tutmak için e komutunu kullanın. Bir deneyin başlamasından önce uygun şekilde alçaltıldığında, armatürün alt ucu cetvelin sol kenarından 1 cm uzakta olmalıdır. Armatür, cetvele çarparak mekanik darbeyi verecektir.</li>
	<li>Alışkanlık cihazında otomatik modu başlatmak için i komutunu kullanın.</li>
	<li>Adım boyutunu komut satırına girin. Düzey 5 en küçük adımdır ve Düzey 1 en büyük adımdır. Düzey 4, temel alışkanlık deneyleri için kullanılan adım boyutudur. NOT: Seviye 5 uyaranı, cetvelin ~ 0,5 mm aşağı doğru yer değiştirmesiyle sonuçlanır; Seviye 4, ~ 1 mm aşağı doğru yer değiştirmeyle sonuçlanır; Seviye 3, ~2 mm aşağı doğru yer değiştirmeyle sonuçlanır; Seviye 2, ~ 3-4 mm aşağı doğru yer değiştirmeyle sonuçlanır; ve Seviye 1, ~8 mm aşağı doğru yer değiştirmeyle sonuçlanır. Bir Seviye 5 uyaranı, armatürün ~ 0.122 N'lik cetvele karşı aşağı doğru bir tepe kuvveti ile sonuçlanır; Seviye 4, ~ 0.288 N'lik aşağı doğru bir tepe kuvveti ile sonuçlanır; ve Seviye 3, ~ 0.557 N'lik aşağı doğru bir tepe kuvveti ile sonuçlanır. Seviye 1 ve Seviye 2 tarafından üretilen aşağı doğru kuvvetlerin, armatür temas ettikten sonra meydana gelen önemli cetvel salınımları nedeniyle bir dinamometre ile ampirik olarak ölçülmesi daha zordur.</li>
	<li>Darbeler arasındaki süreyi dakika cinsinden girin. Temel alışkanlık deneyleri için kullanılan aralık 1 dakikadır.</li>
	<li>Kırmızı kayıt düğmesine basarak Web kamerası kaydedici uygulamasını kullanarak video çekmeye başlayın. Ardından, ilk otomatik mekanik darbe dağıtımı ile deneye başlamak için alışkanlık aparatındaki anahtarı çevirin.</li>
</ol>3. Deney videosunun analizi
<ol><li>Videoda ilk mekanik darbe görünmeden hemen önce, her ikisi de 35 mm'lik plakanın altına tutturulmuş ve uzatılmış, trompet benzeri bir şekilde uzatılan Stentor sayısını duraklatın ve sayın (Şekil 5A, Video 1).</li>
	<li>İlk darbeden hemen sonra, hem plakanın dibine tutturulmuş hem de top benzeri bir şekle büzülmüş Stentor sayısını sayın (Şekil 5B, Video 1). NOT: Kasılan hücreler uzatılmış hücrelerden kolayca ayırt edilebilir, çünkü Stentor bir kasılma olayı3 sırasında vücut uzunluklarını 10 ms içinde% 50'den fazla kısaltır.</li>
	<li>Mekanik uyarana yanıt olarak büzülen Stentor fraksiyonunu belirlemek için ikinci sayımı ilk sayıma bölün.</li>
	<li>Deney videosundaki tüm mekanik darbeler için 3.1-3.3 arasındaki adımları tekrarlayın.</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig05.jpg"> Şekil 5: Mekanik bir uyaran aldıktan sonra Stentor büzülüyor . (A) Stentor uzatılmış durumdadır ve Petri plakasının dibine sabitlenmiştir. (B) Stentor, alışkanlık cihazından Seviye 4 mekanik stimülasyon aldıktan sonra büzülmüştür. Görüntüler USB mikroskopla çekildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 1: Stentor sözleşme videosu. Stentor, alışkanlık cihazından her dakika Seviye 4 mekanik uyaran alır. Bu hücreler henüz alışmamıştır, bu yüzden nabzı aldıktan sonra büzülürler. Hücreler, alışkanlık cihazının üzerine yerleştirilmiş Petri plakasındadır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_1_JoVE.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

<ol>
	<li>Dussutour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+in+single+cell+organisms.">Learning in single cell organisms.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 564, 92-102 (2021).</li><li>Sternberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intelligence.">Intelligence.</a> Dialogues in Clinical Neuroscience. 14 (1), 19-27 (2012).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parametric+studies+of+the+response+decrement+produced+by+mechanical+stimuli+in+the+protozoan,+Stentor+coeruleus.">Parametric studies of the response decrement produced by mechanical stimuli in the protozoan, Stentor coeruleus.</a> Journal of Neurobiology. 1 (3), 345-360 (1969).</li><li>Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+learning.">Cell learning.</a> Current Biology. 28 (20), 1180-1184 (2018).</li><li>Wood, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus+specific+habituation+in+a+protozoan.">Stimulus specific habituation in a protozoan.</a> Physiology and Behavior. 11 (3), 349-354 (1973).</li><li>Thompson, R. F., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation:+A+model+phenomenon+for+the+study+of+neuronal+substrates+of+behavior.">Habituation: A model phenomenon for the study of neuronal substrates of behavior.</a> Psychological Review. 73 (1), 16-43 (1966).</li><li>Slabodnick, M. M., Marshall, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stentor+coeruleus.">Stentor coeruleus.</a> Current Biology. 24 (17), 783-784 (2014).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macronuclear+genome+of+Stentor+coeruleus+reveals+tiny+introns+in+a+giant+cell.">The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell.</a> Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).</li><li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis.">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLoS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).</li><li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor.">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57759 (2018).</li><li>McDiarmid, T. A., Bernardos, A. C., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Habituation+is+altered+in+neuropsychiatric+disorders-A+comprehensive+review+with+recommendations+for+experimental+design+and+analysis.">Habituation is altered in neuropsychiatric disorders-A comprehensive review with recommendations for experimental design and analysis.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 80, 286-305 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Protokoldeki en kritik adımlar, Stentor'un kasılmaların gerçekleşmesi için en uygun koşullarda kalmasını sağlamakla ilgilidir. Alışkanlık tahlilindeki kasılma tepkisi, Stentorların yapışkan tutuşlarını kullanarak bir yüzeye sabitlenmelerini gerektirir, çünkü serbestçe yüzerken nadiren büzülürler. Bununla birlikte, alışkanlık deneyleri için kullanılan 35 mm'lik Petri plakasının alt yüzeyi, poli-ornitin ile kaplanmadığı sürece tipik olarak ankraj için elverişli değildir. Ayrıca, Stentor alışkanlık deneyinin başlamasından en az 2 saat önce herhangi bir mekanik bozulmaya maruz bırakılamaz, çünkü Stentor unutma zaman çizelgesi 2-6 saat3'tür. Stentor, alışkanlık deneyi başlangıç zamanından sonraki 2 saat içinde mekanik stimülasyon alırsa, bu önceki stimülasyonun deneyden önce hafif bir alışkanlık seviyesine neden olma olasılığı vardır, böylece alışkanlık cihazı ilk mekanik darbeyi verdikten sonra büzülme olasılığını azaltır. Son olarak, analiz aşamasında, mekanik stimülasyona yanıt olarak büzülen hücrelerin fraksiyonunun doğru bir şekilde okunmasını sağlamak için nabız doğumundan önce meydana gelen tesadüfi spontan kasılmalardan ziyade, sadece bir nabızdan sonra büzülen Stentor sayısını saymak önemlidir.
Protokol, alışkanlık cihazı tarafından verilen mekanik darbelerin kuvvetini ve frekansını değiştirerek farklı alışkanlık dinamiklerini incelemek için kolayca değiştirilebilir. Bu aynı zamanda Stentor'da meydana gelebilecek duyarlılaştırma gibi diğer öğrenme türlerini keşfetme fırsatı da sağlar. Mikrodenetleyici kartı program kodunun kendisi, Stentor'a farklı mekanik musluk desenleri iletmek için de ayarlanabilir.
Bu protokolle giderilecek potansiyel bir sorun, alışkanlık deneyinde gözlemlenebilecek Stentor sayısını sınırlayabilecek düşük Stentor ankraj sıklığıdır. Yakın zamanda beslenmemiş veya kontamine olmuş Stentor kültürlerinde ankraj sıklığı bazen azalır. Bu sorunu çözmek için, yeni bir kültür başlatmak için taze bir Stentor partisi yıkanmalı ve Lin ve ark.10'da açıklanan protokole göre düzenli olarak beslenmelidir.
Bu protokol, bir seferde yalnızca tek bir Stentor plakasının test edilebilmesi ve nispeten düşük verimli ölçümlerle sonuçlanması nedeniyle sınırlıdır. Ayrıca, mevcut yazılım tek hücreli görüntü analizinin otomasyonuna izin vermemektedir. Bu nedenle, elde edilen verilerin çoğu nüfus düzeyinde. Alışkanlık cihazının ve görüntü analiz araçlarının gelecekteki modelleri, yüksek verimli tek hücreli deneyleri kolaylaştırabilir.
Stentor'daki alışkanlık daha önce Wood3 tarafından açıklanan yöntemler kullanılarak incelenmişti, ancak bu yeni protokol deneylerin otomatikleştirilmesine izin veriyor. Otomasyon, araştırmacının yalnızca belirli bir kuvvet ve frekanstaki mekanik darbeleri yeniden üretilebilir bir şekilde teslim etmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda cihaz günlerce gözetimsiz olarak çalışır durumda bırakılabildiğinden, uzun vadeli alışkanlık deneylerini de kolaylaştırır. Ayrıca, Wood'un deneylerinde kullanılan solenoid yerine bir step motor kullanmak3, zamanla manyetiksizleşme riskini azaltır ve ayrıca uyaranın gücünün tek bir deney sırasında değiştirilmesine izin verir.
Hücresel alışkanlığın incelenmesi, dikkat eksikliği / hiperaktivite bozukluğu (DEHB) ve alışkanlığın bozulduğu Tourette sendromu gibi durumlar için klinik içgörüleri ortaya çıkarabilir11. Stentor alışkanlık mekanizmaları, karmaşık hücresel devreden bağımsız yeni sinaptik olmayan öğrenme paradigmalarını da ortaya çıkarabilir. Son olarak, tek hücreli öğrenme hakkındaki bilgiler, çok hücreli dokulardaki hücreleri yeniden programlamak için yöntemlere ilham verebilir - hastalıklarla savaşmak için başka bir potansiyel yol.

Öğrenme genellikle karmaşık bir sinir sistemi ile ilişkilidir, ancak tek hücrelere kadar her seviyedeki yaşamın akıllı davranışlar sergileyebileceğine dair kanıtlar artmaktadır. Hem doğal hem de yapay sistemlerde öğrenme, yeni bilgilere dayanan sistem parametrelerinin uyarlanabilir güncellenmesidir1 ve zeka, öğrenmeyi kolaylaştıran hesaplama sürecinin bir ölçüsüdür2.
Stentor coeruleus , tekrarlanan bir uyaranın ardından davranışsal bir tepkinin azaldığı bir öğrenme şekli olan alışkanlık sergileyen tek hücreli bir gölette yaşayan organizmadır3. Stentor , sucul avcılardan belirgin bir kaçış tepkisi olan mekanik stimülasyon3'e yanıt olarak büzülür. Bununla birlikte, tekrarlanan düşük kuvvet pertürbasyonları, kasılma olasılığında ilerleyici bir azalma ile gösterilen alışkanlığı indükler3. Alışılmış Stentor, yüksek kuvvetli mekanik stimülasyon4 veya fotik stimülasyon 5 aldıktan sonra halabüzülür. Thompson ve Spencer'ın hayvanlarda alışkanlık için klasik kriterleri6 ile uyumlu olan bu gözlemler, orijinal kasılma yanıtı azalmasının yorgunluk veya ATP tükenmesinden ziyade öğrenmeden kaynaklandığını kuvvetle göstermektedir. Serbest yaşayan bir hücre olarak Stentor , çok hücreli bir dokuda olduğu gibi, çevredeki hücrelerden çok fazla müdahale olmadan incelenebilir. Birkaç ek özellik, Stentor'u öğrenmeyi incelemek için izlenebilir bir sistem haline getirir: büyük boyutu (1 mm), ölçülebilir alışkanlık yanıtı3, enjeksiyon ve mikromanipülasyon kolaylığı7, tam sıralı genom8 ve RNA girişim (RNAi) araçlarının mevcudiyeti9. Bu model organizmayı beyin veya sinir sistemi olmadan hücre öğrenimini keşfetmek için kullanmak, Stentor hücrelerini uyarmak ve yanıtı ölçmek için tekrarlanabilir bir prosedür gerektirir.
Burada, belirli bir kuvvet ve frekansta mekanik darbeler verebilen mikrodenetleyici kartına bağlı bir cihaz kullanarak Stentor alışkanlığını ölçmek için, aparatı oluşturma ve deneyi dış karışıklıkları en aza indirecek şekilde kurma yöntemleri de dahil olmak üzere bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1). Alışkanlığı tek bir hücre düzeyinde anlamak, karmaşık devrelerden bağımsız öğrenme paradigmalarını karakterize etmeye yardımcı olacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig01.jpg"> Şekil 1: Alışkanlık deneyi kurulumu. Stentor içeren Petri plakası, alışkanlık cihazının esnek metal cetvelinin üzerine yerleştirilir. Alışkanlık cihazının armatürü daha sonra metal cetveli belirli bir kuvvet ve frekansta vurur ve hücre alanı boyunca bir uyaran dalgası üretir. USB mikroskop kamerası, Stentor'un stimülasyona verdiği tepkileri kaydeder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig02.jpg"> Şekil 2: Alışkanlık denemesi iş akışının özeti. Şekil, alışkanlık cihazını kullanarak Stentor'u incelemede yer alan temel adımları göstermektedir. Figür BioRender.com ile yaratıldı. BioRender.com (2022) tarafından "Süreç Akış Şeması" ndan uyarlanmıştır. https://app.biorender.com/biorender-templates'dan alındı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01% Poly-ornithine&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4957</td>
			<td>Used to coat Petri plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm Petri plate</td>
			<td>Benz Microscope Optics Center Inc.</td>
			<td>L331</td>
			<td>Contains Stentor during experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>38016</td>
			<td>Used to wash Stentor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum breadboard, 4&#34; x 24&#34; x 1/2&#34; (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB424</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big easy driver stepper motor driver board (x1)</td>
			<td>Sparkfun</td>
			<td>ROB-12859</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Construction rail, 1&#34; x 5&#39;&#39; (x2)</td>
			<td>Newport</td>
			<td>Newport CR-1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laptop</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://www.apple.com/macbook-air-m1/</td>
			<td>Connect laptop to USB microscope to visualize experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large right-angle bracket (x1)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90RL</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcontroller board</td>
			<td>Arduino</td>
			<td>A000066</td>
			<td>Used to control habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nema 17 Stepper Motor Bipolar 59Ncm 2A&#160;84oz.in&#160;48mm 4-Lead&#160;</td>
			<td>Stepperonline.com</td>
			<td>5-17HS19-2004S1</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteurized spring water</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>132458</td>
			<td>Media for Stentor experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle bracket (x3)</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AP90</td>
			<td>Used to construct habituation device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 2000 stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Used to visualize Stentor during wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stentor coeruleus</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>131598</td>
			<td>These are the cells used for habituation experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB microscope</td>
			<td>Celestron</td>
			<td>44308</td>
			<td>Used to visualize and record experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Webcam recorder</td>
			<td>Apple Store</td>
			<td>https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12</td>
			<td>Install this application to take videos of experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying habituation in stentor coeruleus

Öğrenme genellikle karmaşık bir sinir sistemi ile ilişkilidir, ancak tek hücrelere kadar her seviyedeki yaşamın akıllı davranışlar sergileyebileceğine dair kanıtlar artmaktadır. Hem doğal hem de yapay sistemlerde öğrenme, yeni bilgilere dayanan sistem parametrelerinin uyarlanabilir güncellenmesidir ve zeka, öğrenmeyi kolaylaştıran hesaplama sürecinin bir ölçüsüdür. Stentor coeruleus , tekrarlanan bir uyaranın ardından davranışsal bir tepkinin azaldığı bir öğrenme şekli olan alışkanlık sergileyen tek hücreli bir gölette yaşayan organizmadır. Stentor , sucul avcılardan belirgin bir kaçış tepkisi olan mekanik stimülasyona yanıt olarak büzülür. Bununla birlikte, tekrarlanan düşük kuvvet pertürbasyonları, kasılma olasılığında ilerleyici bir azalma ile gösterilen alışkanlığı indükler. Burada, belirli bir kuvvet ve frekansta mekanik darbeler verebilen mikrodenetleyici kartına bağlı bir cihaz kullanarak Stentor alışkanlığını ölçmek için bir yöntem sunuyoruz, buna cihazı oluşturma ve deneyi dış karışıklıkları en aza indirecek şekilde kurma yöntemleri de dahil. Stentor'u mekanik olarak uyarmak için daha önce açıklanan yaklaşımların aksine, bu cihaz stimülasyon kuvvetinin tek bir deney sırasında bilgisayar kontrolü altında değiştirilmesine izin verir, böylece uygulanabilecek giriş dizilerinin çeşitliliğini büyük ölçüde arttırır. Alışkanlığı tek bir hücre düzeyinde anlamak, karmaşık devrelerden bağımsız öğrenme paradigmalarını karakterize etmeye yardımcı olacaktır.

Yukarıda açıklanan yöntem, Seviye 4 mekanik darbeyi 1 musluk / dak frekansında kullanarak, Stentor'un büzülme olasılığında 1 saat içinde ilerleyici bir azalmaya neden olmalıdır. Bu, alışkanlığın göstergesidir (bkz. Şekil 6, Video 2).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig06v2.jpg"> Şekil 6: Temel alışkanlık. Stentor'un büzülme olasılığı , 1 musluk / dak frekansında Seviye 4 mekanik darbeler aldıktan sonra 1 saat boyunca kademeli olarak azalır (n = 22-27). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 2. Alışılmış Stentor'un videosu. Hücreler, 1 musluk / dak frekansında aynı kuvvette mekanik darbeler aldıktan 1 saat sonra Seviye 4 mekanik uyaran alırlar. Hücrelerin çoğu saat boyunca uyaranlara alışmıştır ve bu nedenle büzülmezler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/Video_2_JoVE.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Mekanik darbe iletiminin kuvvetini ve / veya frekansını değiştirmek, Stentor alışkanlık dinamiklerini değiştirebilir. Örneğin, Seviye 2 darbesini 1 musluk/dk frekansında kullanmak, 1 saat boyunca alışkanlığı engeller (bkz. Şekil 7). Seviye 5 nabız, birkaç ila sıfır Stentor'da kasılmalara neden olmalıdır.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64692/64692fig7v2.jpg"> Şekil 7: Daha güçlü kuvvetler için 1 saat içinde alışkanlık eksikliği. Stentor'un büzülme olasılığı , 1 musluk / dak frekansında Seviye 2 mekanik darbeler aldıktan sonra 1 saat boyunca önemli ölçüde azalmaz (n = 7-33). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64692/64692fig07largev2.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Habituation in Stentor coeruleus at JoVE.com

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Stentor alışkanlığını, belirli bir kuvvet ve frekansta mekanik darbeler verebilen mikrodenetleyici kartına bağlı bir cihaz kullanarak ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, aparatı monte etmek ve deneyi dış karışıklıkları en aza indirecek şekilde kurmak için yöntemler de ekliyoruz.

Stentor coeruleus'ta Alışkanlık Eğitimi

Learning is usually associated with a complex nervous system, but there is increasing evidence that life at all levels, down to single cells, can display ...

Alışkanlığı tek bir hücre düzeyinde incelemek, karmaşık nöral devrelerden bağımsız öğrenme paradigmalarını karakterize etmeye yardımcı olacak ve böylece zekanın kökenlerini anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu teknik, hücrelere verilen mekanik stimülasyonun kuvvetinin ve sıklığının otomatik bilgisayar kontrolü altında değiştirilmesini sağlar, böylece giriş dizilerinin çeşitliliğini büyük ölçüde arttırır. Hücresel alışkanlığı incelemek için bu yöntemleri kullanmak, alışkanlığın bozulduğu DEHB ve Tourette Sendromu gibi durumlar hakkında daha fazla bilgi edinmemize yardımcı olacaktır.Başlamak için, sürücü kartından A etiketli iki kabloyu motordaki mavi ve kırmızı tellere bağlayarak motor sürücüsünü motora bağlayın. Ardından, sürücü kartından B etiketli iki kabloyu motordaki yeşil ve siyah tellere bağlayın. LED'leri doğru polaritede bağlamak için breadboard devresini özel bir özenle inşa ettikten sonra, VCC'yi sürücü kartından beyaz breadboard'un üst rayına bağlayın.Ve sürücü panosundan breadboard'un alt rayına kadar zemin. Ardından, breadboard'un zeminini mikrodenetleyici kartının toprak pimine bağlayın. Ardından yeşil LED, kırmızı LED, anahtar ve düğme kablolarını sırasıyla mikrodenetleyici kartı dijital pimleri 8, 9, 10 ve 11'e bağlayın.Mikrodenetleyici kartı dijital pimlerini iki ve üç sürücü kartı kablolarına, adım ve yöne bağlayın. Ardından, etkinleştirmek için dört iğneyi MS1'e, beşi MS2'ye, PIN altıyı MS3'e ve yediyi sabitleyin. Sürücü kartına güç sağlamak için, 12 voltluk beslemeyi, motor sürücü kartına iki kırmızı telle tutturulmuş siyah yeşil adaptör fişine takın.Kontrol programını mikro denetleyici kartına indirin. Mikrodenetleyici kartını bir bilgisayara bağlamak için bir USB kablosu kullanın, bu da mikrodenetleyici kartı için güç kaynağı görevi görür. Stentor'u elde ettikten sonra, plakaya% 0.01 poliornitin çözeltisinin üç mililitresini ekleyerek 35 milimetrelik bir plakayı kaplayın ve gece boyunca bırakın.Tabağı iki kez ultra saf suyla ve bir kez pastörize kaynak suyuyla yıkayın. Daha sonra 35 milimetrelik plakaya 3,5 mililitre pastörize kaynak suyu ekleyin. Birinci kuyuya üç mililitre pastörize kaynak suyu, ikinci ve üçüncü kuyulara beş mililitre ekleyin.Bir P1000 pipet kullanarak, altı kuyucuklu plakanın ilk kuyucuğuna bir kültür kabından iki mililitre Stentor ekleyin. Stereo mikroskopla tek tek Stentor'u tanımlayın ve ardından 100 Stentor'u birinci kuyudan ikinci kuyucuğa aktarmak için bir P20 pipet kullanın. Benzer şekilde, daha önce gösterildiği gibi stereo mikroskopla bireysel Stentor'u tanımladıktan sonra, bir P20 pipet kullanarak 100 Stentor'u ikinci kuyudan üçüncü kuyucuğa aktarın.Daha sonra bir P200 pipet kullanarak, toplam 500 mikrolitre hacimde 100 Stentor'u, altı kuyucuk plakasının üçüncü kuyucuğundan 35 milimetrelik plakaya aktarın, böylece son hacim dört mililitre olur. Alışkanlık cihazındaki metal cetvele bir parça beyaz kağıt bantlayın, kağıdın sol kenarının armatüre en yakın cetvelin ucundan iki santimetre uzakta olmasını sağlayın. Çift taraflı bant kullanarak, 35 milimetrelik plakanın tabanını, alışkanlık cihazındaki cetvelin üstündeki iki x iki inç kağıdın ortasına yapıştırın.35 milimetrelik plakayı, kapak kapalıyken alışkanlık cihazında en az iki saat bekletin. USB mikroskop kamerasını doğrudan 35 milimetrelik Stentor'un plakasının üzerine ortalayın. Web kamerası kaydedici uygulamasını yüklemek için, web kamerası kaydedici uygulamasını açın ve açılır menüden USB mikroskobu seçin.USB mikroskop kamerasındaki odağı, hücreler net bir şekilde görünecek şekilde ayarlayın ve görüş alanındaki hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için kamera konumu. Mikrodenetleyici kartı seri monitörünü açtıktan sonra, satır sonu yok" seçeneğini belirleyin ve 9.600 baud olarak ayarlayın. Armatürü cetvele zar zor dokunana kadar indirmek için mikrodenetleyici kartı programındaki L komutunu ve tam konumu ayarlamak için gerekirse kolu kaldırmak için R komutunu kullanın.Alışkanlık cihazında otomatik modu başlatmak için I komutunu kullanın. Adım boyutunu ve darbeler arasındaki süreyi dakika cinsinden komut satırına girin. Kırmızı kayıt düğmesine basarak web kamerası kaydedici uygulamasını kullanarak video çekmeye başlayın.Ardından, ilk otomatik mekanik darbe dağıtımı ile deneye başlamak için alışkanlık aparatındaki anahtarı çevirin. Videoda ilk mekanik darbe görünmeden hemen önce, her ikisi de 35 milimetrelik plakanın altına sabitlenmiş ve uzatılmış trompet benzeri bir şekilde uzatılan Stentor sayısını duraklatın ve sayın. Benzer şekilde, ilk darbeden sonra, hem plakanın dibine tutturulmuş hem de top benzeri bir şekle büzülmüş Stentor sayısını sayın.Deneydeki tüm mekanik darbeler için prosedürü tekrarlarken, mekanik uyarana yanıt olarak büzülen Stentor fraksiyonunu belirlemek için ikinci sayımı ilk sayıma bölün. Stentor'un büzülme olasılığı izlendi ve sonuçlar bir saat boyunca kademeli olarak azaldığını gösterdi. Seviye dört mekanik darbeyi aldıktan sonra, dakikada bir dokunuş frekansında, alışkanlığı gösterir.Mekanik darbe iletiminin kuvvetini veya frekansını değiştirmek, Stentor alışkanlık dinamiklerini değiştirebilir. Dakikada bir dokunuşun seviye iki darbe frekans setini kullanırken, bir saat boyunca alışkanlığı engeller. Mekanik stimülasyonun kuvvetini ve sıklığını değiştirerek farklı alışkanlık dinamiklerini inceleyebiliriz.Bu, duyarlılaştırma gibi farklı öğrenme türlerini keşfetmek için bir fırsattır. Yöntemlerimizden toplanan tek hücreli öğrenme hakkındaki nicel içgörüler, çok hücreli dokulardaki hücreleri yeniden programlamak için diğer yollara ilham verebilir. Hastalıklarla savaşmanın bir başka potansiyel yolu.

Research

JoVE Journal

Biology

Studying Habituation in Stentor coeruleus

Studying Aggression in Drosophila (fruit flies)

Studying Aggression in Drosophila fruit flies

Drosophila (meyve sineği) Saldırganlık incelenmesi

Aggression is an innate behavior that evolved in the framework of defending or obtaining resources.  This complex social behavior is influenced by ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media

Gözenekli Ortam Mikrobiyal Ulaştırma incelenmesi için basit mikroakışkan Sistemleri: Mikrodünya Pencere

Microbial growth and transport in porous media have important implications for the quality of groundwater and surface water, the recycling of nutrients in ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Tek hücreli Yara Şifa sırasında Sitoplazmik Akışı görselleştirme<em&gt; Stentor coeruleus</em

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Hücresel dönüştürme Kaposi sarkomu Herpesvirus tarafından eğitim için bir Vitro modeli

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurtalıklar

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...