Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

يعترف المؤلفون بامتنان بمرفق Flow Core ومرفق التصوير في غلاسكو (GIF) داخل كلية العدوى والمناعة لدعمهم ومساعدتهم في هذا العمل.

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

تعد الثقافة السهلة وعزل أعداد كبيرة من OCs الوظيفية في المختبر مهمة لتعزيز فهم بيولوجيا العظام والأمراض بوساطة OC. كلاسيكيا ، تم إنشاء OCs في الثقافات المشتركة مع بانيات العظم أو الخلايا اللحمية والخلايا المكونة للدم من الطحال أو نخاع العظام38,39. كان الاختراق الكبير في فهم تكوين العظم هو تحديد RANKL باعتباره المنظم الرئيسي لتشكيل OC والتمايز والبقاء على قيد الحياة40. استخدمت البروتوكولات المبكرة لأنظمة الاستزراع المعتمدة على RANKL PBMCs لتوليد OC21،41،42. ومع ذلك ، فإن هذه الثقافات المختلطة طويلة وتقدم العديد من العوامل المربكة التي تحد من القدرة على اختبار التأثيرات المباشرة على تمايز OC ووظيفته. يصف هذا البروتوكول نموذجا فعالا وموثوقا به في المختبر لتكوين العظم الكلاستي من الخلايا الوحيدة CD14 + المحيطية البشرية حيث يمكن الحصول على تكوين العظم الأمثل في غضون 7 أيام (الشكل 1 والشكل 2) ، وهو أسرع بكثير عند مقارنته ببعض البروتوكولات الأخرى43،44،45،46. السمات المميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي (1) استخدام وحيدات CD14 + المنقاة ، (2) فتيلة الوحيدات مع M-CSF قبل التعرض ل RANKL ، (3) طول المزرعة (<7 أيام) ، و (4) الكشف الموثوق عن تثبيط تكوين OC (تلطيخ TRAP) والوظيفة (الارتشاف ، إنتاج ATP ، إعادة تنظيم حلقة الأكتين) مع مثبطات. 
أثناء تحسين المنهجية ، تم تحديد العديد من النقاط الحرجة. وقد لوحظ أن التمايز في المختبر من OCs يعتمد إلى حد كبير على كثافة البذر من وحيدات CD14 +. وبالتالي ، في هذا البروتوكول ، يتم زرع الخلايا بكثافة عالية (1 × 105 خلايا / بئر من صفيحة 96 بئرا ، في 100 ميكرولتر من الوسط) ، حيث أنه من الضروري أن تكون الخلايا قادرة على التفاعل مع بعضها البعض وأن تكون على مقربة من الاندماج وتصبح OCs ناضجة. وبالمثل ، فإن بذر الخلايا بكثافة عالية جدا يحد من تمايزها ونموها بسبب القيود المتوسطة ونقص المساحة المطلوبة. علاوة على ذلك ، لتحقيق أقصى قدر من النجاح مع هذا البروتوكول ، من المهم إجراء فصل تدرج الكثافة بعناية والتأكد من أن السكان المخصبين لخلايا CD14 + نقية قدر الإمكان. على سبيل المثال ، تؤدي خطوات الغسيل غير الكافية إلى عدم إزالة الصفائح الدموية ، مما يمنع بالتالي تمايز OC47,48. وبالمثل ، فإن وجود تلوث طفيف للخلايا التائية في مستحضرات CD14 + المعزولة المحفزة باستخدام M-CSF وحده يمكن أن يؤدي إلى تمايز OC ، ربما عن طريق إفراز RANKL بواسطة الخلايا التائية49. لذلك ، من المهم تضمين عنصر تحكم M-CSF لكل تجربة. يوصى أيضا بإجراء فحص روتيني للنقاء ، خاصة عند استخدام مجموعة عزل جديدة ، لضمان نقاء العينة.
يتم تحقيق أرقام OC المثلى (النطاق: ~ 200-1600 OCs / well) باستخدام وسط α-MEM المخصب بالنيوكليوسيدات و L-glutamine. تؤثر وسائط الاستزراع التقليدية الأخرى ، بما في ذلك وسيط النسر المعدل في Dulbecco (DMEM) ووسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 ، على عائد OC. يمكن أن يؤثر مصدر FBS أيضا على تكوين العظم. يمكن أن تؤدي الدفعات المختلفة من FBS إلى تقليل تكوين العظم المشتق من RANK-L ، بالإضافة إلى ظهور أعداد منخفضة من الخلايا متعددة النوى TRAP + في عناصر التحكم M-CSF (الشكل التكميلي 3). لذلك، لتحقيق نتائج متسقة، ينصح باختبار دفعات FBS جديدة قبل الاستخدام والاستمرار في نفس الدفعة طوال التجارب لتقليل الاختلافات في عملية التمايز. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التباين من جهة مانحة إلى مانحة ، من حيث العدد الإجمالي ل OCs المتمايزة التي تم الحصول عليها في نقطة زمنية نهائية ، يشكل قيدا عند استخدام هذا البروتوكول لمقارنة ، على سبيل المثال ، المتبرعين الأصحاء بالمرضى. في هذه الحالات ، من الضروري استخدام نفس الظروف بالضبط ونفس الكمية من الكواشف المتوسطة و FBS والكواشف الأخرى.
خطوة أخرى ضرورية لتمايز OC الأمثل والنضج هي تحضير الخلايا الوحيدة باستخدام M-CSF قبل إضافة RANKL. يؤدي تعرض الخلايا ل M-CSF 18-24 h قبل RANKL إلى تهيئة الخلايا الوحيدة لتنظيم تعبير RANK15,26. تضمن إضافة RANKL في هذه المرحلة الزمنية التمايز الأمثل OC بطريقة تعتمد على الجرعة. تختلف درجة تمايز OC من مانح إلى آخر. ومع ذلك ، فإن 25 نانوغرام / مل RANKL عادة ما تكون كافية للتمييز بين عدد كبير من OCs في معظم الجهات المانحة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام 25 نانوغرام / مل RANKL في المقايسات للفحص الأولي للمركبات ، لأنه يسهل تقييم كل من التأثيرات المعززة والمثبطة لمركبات الاختبار. استخدمت أنظمة الاستزراع الأخرى أوقات أطول قبل حضانة M-CSF قبل إضافة RANKL ، ولكن هذا يؤدي إلى وقت زراعة أطول لتكوين العظم50. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ترك الخلايا الوحيدة المهيأة لاحتضانها بين عشية وضحاها يسمح لها بالالتصاق باللوحة ، وإن لم تكن في حالة ملتصقة تماما. لذلك ، عند تقديم RANKL لأول مرة ، يجب تغيير الوسط نصف بعناية فائقة بدلا من تغييره بالكامل لمنع انفصال وفقدان الخلايا الوحيدة المجهزة. يحتاج الوسيط أيضا إلى التحديث كل 3-4 أيام لتجنب النضوب المتوسط ومنع موت الخلايا. علاوة على ذلك ، نظرا للحجم المنخفض المستخدم في هذا الفحص (100 ميكرولتر / بئر في صفيحة 96 بئرا) ، من الأهمية بمكان وجود إطار من الآبار الفارغة المملوءة بمحلول مائي (أي H2O أو PBS المقطر المعقم) حول آبار الفحص. هذا يمنع التبخر المتوسط وتأثيرات الحافة.
أخيرا ، بالنسبة للمقايسات الأيضية (على سبيل المثال ، مقايسات ATP) ، من الضروري أن تكون الخلايا قابلة للحياة لتجنب الانحراف المعياري الهائل بين النسخ المتماثلة (الشكل 5). تعد الصلاحية العالية للخلايا مهمة أيضا لفرز الخلايا ولمزيد من زراعة OCs المصنفة (الشكل 4). هذه الطريقة ، ومع ذلك ، لديها العديد من القيود. OCs الناضجة تماما ملتصقة للغاية ويصعب فصلها عن اللوحات. غالبا ما يكون من المستحيل فصل OCs الأكبر ، مما قد يؤدي إلى انخفاض إنتاجية الخلايا. لذلك ، يجب حساب الخلايا بعد الفرز وقبل الطلاء بالتركيز المطلوب. علاوة على ذلك ، في البروتوكول الحالي ، يتم استخدام طريقة غير إنزيمية (accutase) لفصل OCs لمنع تغيرات الغشاء في تلطيخ سطح المصب لقياس التدفق الخلوي. كما تم اختبار استخدام كاشطات الخلايا (ذات النهايات الناعمة أو الصلبة) وأدى إلى موت الخلايا المرتفع. يمكن استخدام الانفصال الأنزيمي باستخدام محاليل Trypsin / EDTA بنسبة 0.05٪ للحصول على إنتاجية أعلى من OCs المنفصلة عندما لا تكون سلامة الغشاء مطلوبة للتطبيقات النهائية. بالإضافة إلى ذلك ، لمنع OCs من التكتل معا ، يوصى بشدة باستخدام تركيز عال من EDTA في جميع المخازن المؤقتة بعد انفصال الخلايا ، وكذلك الترشيح المناسب قبل اكتساب قياس التدفق الخلوي. من المهم ملاحظة أن ثقافات OC هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا تتكون من OCs الناضجة وسلائف OC والبلاعم. يمكن تمييز البلاعم بسهولة عن OCs ، على الرغم من أن كلا من OCs أحادية النواة و OCs متعددة النواة تعبر عن OSCAR ولا يمكن تمييزها بالطريقة الحالية (الشكل 4). والواقع أن هذه المسألة الأخيرة تشكل القيد الرئيسي لهذه الطريقة. بالإضافة إلى ذلك ، يوجد تعبير منخفض عن OSCAR أيضا في ثقافات M-CSF (الشكل 4B) وقد يشير إلى البلاعم التي يتم إعدادها للالتزام بنسب OC. من المهم ضبط بوابة خلايا OSCAR + بناء على إشارة تلطيخ FMO ، كما هو موضح في الشكل 4B.
باختصار ، يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة وقوية للإنتاج الفعال ل OCs النشطة والناضجة وظيفيا من الخلايا الوحيدة البشرية الأولية المتداولة. تكمن قوة هذا البروتوكول في قدرته على توليد OCs في فترة زمنية قصيرة وإنتاج أعداد كبيرة من OCs المتباينة. تفتح هذه الطريقة الطريق للتحقيق في الآليات الأساسية الكامنة وراء تمايز OC ووظيفته.

الخلايا العظمية (OCs) هي خلايا عملاقة متعددة النوى من سلالة المكونة للدم مع قدرة فريدة على امتصاص العظام. هم مسؤولون عن التطوير وإعادة البناء المستمر للهيكل العظمي 1,2. في مراحل الهيكل العظمي للتطور ، يتم اشتقاق OCs والبلاعم المقيمة في الأنسجة من أسلاف الكريات الحمر النخاعي واستعمار مكانة العظام وأنسجة الأعضاء. في الظروف الفسيولوجية ، هناك حاجة إلى أسلاف الكريات الحمر النخاعية لنمو العظام الطبيعي وثوران الأسنان ، في حين أن تدفق وحيدات الدم المتداولة في مكانة العظام يوفر صيانة ما بعد الولادة ل OCs ، كتلة العظام ، وتجويف نخاع العظم3. في ظل الظروف المرضية ، يتم تجنيد الخلايا الوحيدة إلى مواقع الالتهاب النشط ويمكن أن تسهم في تدمير العظام المرضي 4,5.
يعاني المرضى الذين يعانون من عدة أشكال من التهاب المفاصل من التهاب المفاصل ، مما يؤدي إلى تدمير المفاصل التدريجي الناجم عن OCs6. على سبيل المثال ، في التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) ، تكون OCs المفرطة النشاط مسؤولة عن تآكل العظام المرضي وتدمير المفاصل 7,8 ، وغالبا ما لا تحسن العلاجات الحالية أو توقف تلف العظام9،10،11. تم الإبلاغ عن تغيرات في الخلايا الوحيدة المتداولة من حيث توزيع السكان والتوقيعات النسخية واللاجينية في مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي12،13،14. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ عن أن استجابات الخلايا الوحيدة المتغيرة للتحفيز الالتهابي تؤثر على تكوين العظم في مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي المصابين بمرض نشط15،16،17.
تمايز OCs هو عملية معقدة متعددة الخطوات تشمل التزام خلايا السلائف النخاعية بالتمايز إلى سلائف OC. أثناء تكوين العظم ، تصبح OCs عملاقة ومتعددة النوى من خلال اندماج الخلايا الخلوية ، والتحلل الخلوي غير المكتمل ، وعملية إعادة التدوير النووي الموصوفة بالانشطار والاندماج18،19،20. سمحت القدرة على التمييز بين OCs في المختبر بإحراز تقدم كبير في فهم بيولوجيا العظام21. تتمايز OCs عن السلائف عند التعرض لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ومنشط مستقبلات العامل النووي kappa-B ligand (RANKL). هذا الأخير ضروري للتطور الطبيعي ووظيفة OCs في المختبر وفي الجسم الحي ، حتى في ظل الظروف الالتهابية6،22،23. يتم تقديم RANKL بواسطة بانيات العظم والخلايا العظمية ، وكذلك عن طريق الخلايا التائية المنشطة والخلايا الليفية في الغشاء الزليلي RA الملتهب2،24،25. أثناء عملية تمايز OC ، تقوم الخلايا الوحيدة المعرضة ل M-CSF بتنظيم منشط مستقبلات العامل النووي kappa-B (RANK) على غشاء الخلية ، وتحت التحفيز اللاحق باستخدام RANKL ، تتمايز إلى فوسفاتيز حمض أحادي النواة مقاوم للطرطرات (TRAP) قبل OCs ثم إلى OCs متعددة النوى15,26. تنتج OCs العديد من الإنزيمات ، وأهمها TRAP ، الذي يتيح تحلل البروتينات الفوسفاتية داخل العظام27. منظم وعلامة تمايز OC هو المستقبل المرتبط ب OC (OSCAR). يتم تنظيمه مبكرا في خلايا السلائف التي تلتزم بسلالة OC28. يمكن ل OCs العملاقة الناضجة متعددة النوى أن تتحلل (تمتص) المصفوفة الهيكلية عن طريق إنشاء منطقة مانعة للتسرب كبيرة ، وهي مصنوعة من حلقة أكتين تحيط بحدود مكشكشة21،29،30. تتطلب قدرة ارتشاف العظام ل OCs إعادة تنظيم الهيكل الخلوي وما يترتب على ذلك من استقطاب وتشكيل غشاء ملتوي ، وهو ما يسمى بالحدود المكشكشة. يحيط بالحدود المكشكشة شريط دائري كبير من هيكل غني ب F-actin ، وهو حلقة الأكتين أو منطقة الختم. تعد سلامة حلقة الأكتين ضرورية ل OCs لإعادة امتصاص العظام في كل من المختبر والجسم الحي ، ويرتبط تكوين الحدود المكشكشة المعيب بتعبير ثلاثي فوسفاتاز الأدينوزين الفراغي السفلي (V-ATPase)31،32،33. علاوة على ذلك ، فإن OCs عبارة عن خلايا غنية بالميتوكوندريا ، ويرتبط أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) بهياكل شبيهة بالميتوكوندريا في OCs المترجمة عند الحدودالمكشكشة 31،32،33. يعمل روتينون كمثبط قوي لمركب الميتوكوندريا I ويؤثر على إنتاج ATP. كما ثبت أن روتينون يمنع تمايز OC والوظيفة34.
يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة ومحسنة لتكوين العظم في المختبر من عينات الدم المحيطية البشرية. في الدم المحيطي البشري ، تعد الخلايا الوحيدة CD14 + المصدر الرئيسي ل OCs15،35،36. في هذا البروتوكول ، تم تعديل حركية التعرض وتركيزات M-CSF و RANKL من أجل تكوين عظمي عظمي مثالي. يتم فصل الخلايا أحادية النواة أولا عن كريات الدم الحمراء والمحببة الموجودة في الدم الكامل عن طريق تدرج الكثافة. ثم يتم تخصيبها لوحيدات CD14 + باستخدام الانتقاء الإيجابي بواسطة الخرز المغناطيسي. ثم يتم تحضين الخلايا الوحيدة CD14 + المعزولة بين عشية وضحاها باستخدام M-CSF. هذا يهيئ الوحيدات لتنظيم التعبير عن الرتبة15,26. تؤدي الإضافة اللاحقة ل RANKL إلى تكوين العظم وتعدد النوى بطريقة تعتمد على الوقت. تظهر OCs النشطة المعاد امتصاصها التوزيع المميز لحلقات F-actin على حافة غشاء الخلية30,32 وتلطيخ TRAP. يتم تحليل OCs الناضجة عن طريق تحديد خلايا TRAP + متعددة النوى (أكثر من ثلاث نوى). يمكن تقييم القدرة الوظيفية ل OCs الناضجة من خلال ارتشافها وسلامة حلقة الأكتين وإنتاج ATP. علاوة على ذلك ، يمكن إثراء CD14− OSCAR + OCs المتمايزة واستخدامها لتقييم تأثيرات بعض المركبات على وظائف OC عن طريق ارتشاف المعادن (أو العاج) وتنظيم F-actin. بالإضافة إلى ذلك ، في هذا العمل ، يتم استخدام مثبط OC المعروف ، rotenone ، كنموذج لمركب يؤثر على وظائف OCs. يرتبط انخفاض نشاط ارتشاف OC تحت روتينون بانخفاض إنتاج ATP وتجزئة حلقة الأكتين. في الختام ، ينشئ هذا البروتوكول مقايسة قوية يمكن استخدامها كطريقة مرجعية لدراسة العديد من الجوانب البيولوجية لتمايز OC ووظيفته في المختبر. 
يمكن استخدام هذه المنهجية لتقييم (1) إمكانات الخلايا الوحيدة المنتشرة للتمييز إلى OCs في الصحة والأمراض ، وكذلك (2) تأثير المرشحين العلاجيين على تمايز OC ووظيفته. يتيح بروتوكول تكوين العظم القوي هذا تحديد فعالية وآليات العلاجات المستهدفة للعظام على كل من تمايز OC من خلايا السلائف ووظيفة OCs الناضجة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

الخلايا الآكلة للعظم (OCs) هي خلايا تمتص العظام وتلعب دورا محوريا في نمو الهيكل العظمي وإعادة تشكيل عظام البالغين. تحدث العديد من اضطرابات العظام بسبب زيادة تمايز وتفعيل OCs ، وبالتالي فإن تثبيط هذه البيولوجيا المرضية هو مبدأ علاجي رئيسي. هناك عاملان رئيسيان يقودان تمايز OCs عن السلائف النخاعية: عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) ومنشط مستقبلات العامل النووي kappa-B ligand (RANKL). من المعروف منذ فترة طويلة أن الخلايا الوحيدة CD14 + المنتشرة البشرية تتمايز إلى OCs في المختبر. ومع ذلك ، فإن وقت التعرض وتركيز RANKL يؤثران على كفاءة التمايز. في الواقع ، تم وصف بروتوكولات لتوليد OCs البشرية في المختبر ، لكنها غالبا ما تؤدي إلى عملية تمايز سيئة وطويلة. هنا ، يتم توفير بروتوكول قوي وموحد لتوليد OCs بشرية ناضجة نشطة وظيفيا في الوقت المناسب. يتم إثراء الخلايا الوحيدة CD14 + من خلايا الدم أحادية النواة المحيطية البشرية (PBMCs) ويتم تجهيزها ب M-CSF لتنظيم RANK. يؤدي التعرض اللاحق ل RANKL إلى توليد OCs بطريقة تعتمد على الجرعة والوقت. يتم تحديد OCs وقياسها عن طريق تلطيخ الفوسفاتيز المقاوم لحمض طرطرات (TRAP) وتحليل المجهر الضوئي. يستخدم تلطيخ التألق المناعي للنوى و F-actin لتحديد OCs النشطة وظيفيا. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إثراء OSCAR + CD14− OCs الناضجة بشكل أكبر عن طريق فرز خلايا قياس التدفق الخلوي ، ووظيفة OC المحددة كميا بواسطة مقايسات ارتشاف المعادن (أو العاج / العظام) وتشكيل حلقة الأكتين. أخيرا ، يتم استخدام مثبط OC معروف ، روتينون ، على OCs الناضجة ، مما يدل على أن إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ضروري لسلامة حلقة الأكتين ووظيفة OC. في الختام ، تم إنشاء اختبار قوي للتمييز بين أعداد كبيرة من OCs في هذا العمل ، والذي بالاقتران مع تلطيخ حلقة الأكتين ومقايسة ATP يوفر نموذجا مفيدا في المختبر لتقييم وظيفة OC وفحص المركبات العلاجية الجديدة التي يمكن أن تعدل عملية التمايز.

جيل OC من الخلايا الوحيدة CD14 + تهدف هذه الطريقة إلى التمييز بسهولة بين عدد كبير من OCs من الخلايا الوحيدة CD14 + في الدم المحيطي البشري في المختبر ، عادة في أسبوع واحد. أولا ، تم إثراء الخلايا الوحيدة CD14 + من PBMCs وتجهيزها ب M-CSF بين عشية وضحاها لتنظيم RANK ، كما ورد سابقا15. بعد تحضير الخلية الأحادية ، لتحديد التركيز الأمثل ل RANKL لتمايز OC ونضجه ، تم استخدام تركيزات RANKL البالغة 1 نانوغرام / مل ، و 25 نانوغرام / مل ، و 50 نانوغرام / مل ، و 100 نانوغرام / مل ، جنبا إلى جنب مع 25 نانوغرام / مل m-CSF. أنتجت إضافة RANKL أعدادا متزايدة من OCs الكبيرة متعددة النوى إيجابية TRAP بطريقة تعتمد على الجرعة ، وتم تقييم ذلك باستخدام تلطيخ TRAP. يتم تعريف OCs الناضجة على أنها خلايا إيجابية TRAP ذات نوى متعددة (عادة أكثر من ثلاثة. الشكل 2 ألف ، ب والشكل التكميلي 1). علاوة على ذلك ، تم فحص حركية تمايز OC من الخلايا الوحيدة باستخدام تلطيخ TRAP والفحص المجهري الضوئي على مدار فترة استزراع مدتها 2-14 يوما. في هذه الحالة ، تم اختيار تمايز OC باستخدام تركيز متوسط قدره 50 نانوغرام / مل RANKL لتقييم مدى سرعة تمايز OCs في الثقافة. في ظروف الاستزراع هذه ، كانت OCs متعددة النوى مرئية من اليوم 5 فصاعدا ، وتم الوصول إلى التمايز الأمثل في اليوم 7 (الشكل 2C). أدت الحضانة المطولة للمزارع بعد 10 أيام على البلاستيك إلى خلايا مدمجة عملاقة بشكل غير طبيعي. في هذا البروتوكول ، عادة ما يتم استخدام الأيام 6-8 كنقطة نهاية مثالية لتوليد OC. يمكن تحديد OCs أو استخدامها في المقايسات النهائية.
التقييم الوظيفي ل OCs المتمايزة لتحديد النشاط الوظيفي ل OCs المتولدة ، قمنا بفحص نشاطها الارتشاف عن طريق التمييز بين OCs على سطح معدني. نظرا لأن OCs الكبيرة لا يتم إنشاؤها إلا بعد فترة استزراع مدتها 7 أيام ، ولإتاحة الوقت الكافي لامتصاص الركيزة المعدنية ، فقد تم الحفاظ على الثقافات حتى اليوم 10. لوحظ تكوين ثقوب مستديرة ، أو حفر ارتشاف ، فقط على الأسطح المعدنية للآبار التي تحتوي على خلايا تمت معالجتها بكل من M-CSF و RANKL (الشكل 3). وبالتالي ، فإن النسبة المئوية للسطح المعدني المذاب (حفر الارتشاف) تسمح بتحديد قدرة امتصاص OC. بالإضافة إلى ذلك ، فإن OCs المتباينة باتباع هذا البروتوكول حتى اليوم 7 ، على كل من شرائح الغرفة البلاستيكية والزجاجية ، أظهرت بنية حلقة أكتين جيدة التنظيم يمكن تصورها عن طريق تلطيخ الفلورسنت المناعي (الشكل التكميلي 2).
تأثير مثبط على وظيفة OC الناضجة تم استخدام ظروف الاستزراع المذكورة أعلاه لتحديد القدرة الوظيفية ل OCs المتولدة في المختبر في وجود مثبط OC المعروف ، rotenone34. تم تمييز OCs لمدة 6-8 أيام ، وتم إثراء CD14−OSCAR + OCs وسلائف OC عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 4). ثم تم طلاء الخلايا المخصبة عند 50000 خلية / لكل بئر على صفيحة 96 بئرا مغلفة بالمعادن في وسط مؤيد ل osteoclasts (25 نانوغرام / مل M-CSF و RANKL) لمدة 3 أيام. المعالجة بالروتينون (الشكل 5 أ ، ب) تمنع بشكل معتمد على الجرعة ارتشاف السطح المعدني مقارنة ببئر التحكم غير المعالج ، بما يتفق مع الدراسات السابقة34. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم وظائف OC من خلال إنتاج ATP وتشكيل حلقة الأكتين. ارتبط تثبيط ارتشاف OC المعتمد على الروتينون بتثبيط إنتاج ATP (الشكل 5C). إعادة امتصاص OCs هي خلايا شديدة الاستقطاب تنظم قدرتها على الارتشاف من خلال تعزيز تنظيم الهيكل الخلوي. تم استخدام القضيب المترافق Alexa fluor 647 لتسمية الهيكل الخلوي F-actin ل OCs الناضجة المستزرعة في وجود أو عدم وجود الروتينون. تسبب روتينون في تجزئة حلقة الأكتين المشتقة من RANKL من OCs الناضجة (الشكل 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> الشكل 2: OCs تتمايز بكفاءة عن سلائف الخلايا الوحيدة CD14 + . تم إثراء الخلايا الوحيدة CD14 + مغناطيسيا ، ومطلية في 1 × 105 خلايا / بئر في 96 لوحة بئر ، وتم حضنها طوال الليل ب 25 نانوغرام / مل M-CSF. (أ) تم تحفيز الخلايا الوحيدة المحضرة M-CSF بتركيزات متزايدة من RANKL (1 نانوغرام / مل ، 25 نانوغرام / مل ، 50 نانوغرام / مل ، و 100 نانوغرام / مل) ، ثابتة ، وملطخة ب TRAP في اليوم 7. تم الحصول على الصور ، وتم حساب الخلايا متعددة النوى TRAP + (MNCs). تظهر الصور التمثيلية لتلطيخ TRAP في الشكل التكميلي 1. تظهر أشرطة الخطأ متوسط ± SD (n = 3). تم تحليل البيانات باستخدام اختبار مقارنات متعددة أحادي الاتجاه ANOVA و Holm-Sidak للبيانات المقترنة. * P ≤ 0.05 و ** P ≤ 0.005. (ب) صورة تمثيلية لبئر ملطخة ب TRAP لصفيحة 96 بئرا توضح الكمية النموذجية من OCs / البئر المتوقعة ومورفولوجيتها تحت 25 نانوغرام / مل RANK-L مقارنة بالبلاعم المشتقة من M-CSF في اليوم 7. قضبان المقياس: 1000 ميكرومتر. (C) صور تمثيلية لتشكيل OC أقل من 50 نانوغرام / مل تم تقييم RANKL عبر تلطيخ TRAP من اليوم 2 إلى اليوم 14. OCs مرئية من اليوم 5 فصاعدا. توجد OCs العملاقة المنصهرة بشكل غير طبيعي بعد 10 أيام. قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> الشكل 3: OCs الامتصاصية متباينة عن الخلايا الوحيدة CD14 + . تم تمييز خلايا CD14 + المعزولة من PBMCs لمدة 10 أيام إلى OCs في وجود 25 نانوغرام / مل M-CSF (M) و RANKL (R) على ألواح فحص سطح المعادن (مقايسة العظام). (أ) صور للآبار التمثيلية التي أعيد بناؤها والتي تم التقاطها بتكبير 10x لتحليل الارتشاف في اليوم 10 (الركيزة المعدنية باللون الرمادي ؛ حفر الارتشاف باللون الأبيض). قضبان المقياس: 1000 ميكرومتر. (ب) التحديد الكمي للنسبة المئوية للمساحة المعاد امتصاصها. تم تحليل بيانات الارتشاف باستخدام تحليل Wilcoxon المزدوج. تظهر أشرطة الخطأ متوسط ± SD (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> الشكل 4: إثراء قياس التدفق الخلوي ل CD14−OSCAR + OCs. تم إثراء وحيدات CD14 + من PBMCs ، وتم تمييز OCs كما هو موضح سابقا. تم فصل ثقافات OC الملتصقة مع accutase وملطخة لقياس التدفق الخلوي. (أ-ج) تم فرز OCs في اليوم 8 بناء على تعبير CD14 و OSCAR. (أ) استراتيجية الفرز التمثيلي للبوابات. كانت الخلايا عبارة عن بوابات فردية ، سلبية للتلطيخ الميت ، وتم فرز المجموعات الفرعية CD14 + OSCAR + (الأحمر) و CD14 − OSCAR + (الأزرق). (ب) مخططات تمثيلية توضح تلطيخ OSCAR المتداخل ل OCs المشتقة من RANKL (سماوي) والتحكم في الضامة المشتقة من M-CSF (برتقالي). باللون الأحمر يوجد عنصر التحكم الملون بنمط نظائر OSCAR ل OCs المشتقة من RANKL. (ج) تم طلاء المجموعات التي تم فرزها على البلاستيك وسمح لها بالالتصاق لمدة 2 ساعة في وسط pro-OC (25 نانوغرام / مل mL M-CSF و 50 نانوغرام / مل RANKL) ، متبوعا بتلطيخ TRAP والتصور. تظهر الصور التمثيلية نقصا في خلايا TRAP + في المجموعة الفرعية CD14 + (الحمراء) و TRAP + أحادية ومتعددة النوى قبل OCs و OCs في المجموعة الفرعية CD14− (الأزرق). قضبان المقياس: 200 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> الشكل 5: فحوصات لتقييم وظيفة OCs الناضجة. لتقييم وظيفة OCs الناضجة ، تم استزراع خلايا CD14 + المعزولة من PBMCs إما باستخدام M-CSF (M) وحده أو مع RANKL (R) لمدة 7 أيام ، وتم إثراء OCs عن طريق قياس التدفق الخلوي ، ثم تمت معالجة OCs بالمثبط روتينون لمدة 24 ساعة. (أ) تم فرز OCs الناضجة عن طريق قياس التدفق الخلوي (CD14−OSCAR+ ) وتم استزراعها على سطح مقايسة معدنية في وجود أو عدم وجود روتينون لمدة 3 أيام ، وبعد ذلك تم تبييض الخلايا وتصويرها بمعدل 10x للكشف عن المنطقة المعاد امتصاصها (حفر الارتشاف باللون الأبيض). (أ) صور تمثيلية أعيد بناؤها للآبار. قضبان المقياس: 1000 ميكرومتر. (ب) التحديد الكمي للنسبة المئوية للمساحة المعاد امتصاصها. تم تحليل البيانات في (B) باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Dunn للمقارنات المتعددة (n = 7) ؛ * P ≤ 0.05 و ** P ≤ 0.01. تظهر أشرطة الخطأ متوسط ± SD. (C) إجمالي محتوى ATP داخل الخلايا ل OCs الناضجة غير المتمايزة واليوم 7 المتمايزة المتباينة مع RANKL والمعالجة إما بالمركبة أو الروتينون (10 نانومتر و 30 نانومتر). هنا ، تم استخدام 2DG و oligomycin كضوابط إيجابية للفحص وأضيفت قبل 30 دقيقة من تحلل الخلية وقياس ATP. تظهر أشرطة الخطأ متوسط ± SD (n = 4). تم تحليل البيانات باستخدام اختبار مقارنة متعدد الاتجاه ANOVA و Dunnett أحادي الاتجاه للبيانات المقترنة. ** P ≤ 0.01. (د) صورة تمثيلية بمعدل 20 ضعفا ل OCs الناضجة الملطخة بتكوين حلقة الأكتين (أحمر) ونوى (أزرق) ، توضح فقدان حلقة الأكتين مع المثبط. قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>شكل لوحة</td>
			<td>96 لوحة جيدة</td>
			<td>48 لوحة جيدة</td>
			<td>24 لوحة جيدة</td>
			<td>12 لوحة جيدة</td>
			<td>6 لوحة جيدة</td>
		</tr><tr><td>حجم</td>
			<td>100 ميكرولتر</td>
			<td>225–250 ميكرولتر</td>
			<td>450-500 ميكرولتر</td>
			<td>0.8-1 مل</td>
			<td>1.8-2 مل</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 1: حجم تعليق الخلية لتنسيقات الألواح المختلفة. يتم حساب الأحجام بدءا من محلول 1 × 106 خلايا / مل وتوفر كثافة مثالية لاندماج الخلايا الخلوية.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>فلوروفور ، استنساخ</td>
			<td>الحجم (ميكرولتر) لكل 106 خلايا</td>
		</tr><tr><td>سي دي 14</td>
			<td>PE / السيانين 7 ، HCD14</td>
			<td>5 ميكرولتر</td>
		</tr><tr><td>اوسكار</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 ميكرولتر</td>
		</tr><tr><td>المخزن المؤقت لفرز الخلايا</td>
			<td></td>
			<td>80 ميكرولتر</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: محلول مزيج الأجسام المضادة الرئيسي. 
الشكل التكميلي 1: تلطيخ TRAP لاستجابة جرعة RANKL. تم إثراء الخلايا الوحيدة CD14 + مغناطيسيا ، ومطلية عند 1 × 105 خلايا / بئر في 96 لوحة بئر ، وتم حضنها طوال الليل ب 25 نانوغرام / مل m-CSF ، كما في الشكل 2. تظهر الصور التمثيلية لتلطيخ TRAP الخلايا الوحيدة المحضرة MCSF محفزة بتركيزات متزايدة من RANKL (1 نانوغرام / مل ، 25 نانوغرام / مل ، 50 نانوغرام / مل ، و 100 نانوغرام / مل) ، ثابتة ، وملطخة ل TRAP في اليوم 7. قضبان المقياس: 400 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي 2: تلطيخ الحلقة العاملة في OCs متمايزة تماما. (أ) تكبير 10x ل OCs متباينة على بلاستيك TC وملطخة ب AF647 phalloidin (باللون الأحمر). شريط المقياس: 400 ميكرومتر. (B) تكبير 40x ل OCs متباينة على شرائح الغرفة الزجاجية وملطخة ب AF488 phalloidin (باللون الأصفر). شريط المقياس: 100 ميكرومتر ، النوى ملطخة ب DAPI ، كما هو موضح باللون الأزرق في (A) والسماوي في (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>
الشكل التكميلي 3: تأثير دفعات FBS المختلفة على كفاءة تمايز OC. تم تمييز OCs عن الخلايا الوحيدة CD14 + في وجود 25 نانوغرام / مل M-CSF و 50 نانوغرام / مل رانكل (MR) لمدة 7 أيام. كانت آبار التحكم تحتوي على M-CSF فقط (M). (أ) تكبير تمثيلي 10x (أشرطة المقياس: 400 ميكرومتر) و (ب) القياس الكمي ل OCs الملطخة ب TRAP متباينة عن متبرع واحد في دفعتين مختلفتين من FBS. تظهر أشرطة الخطأ متوسط ± SD لثلاث نسخ متماثلة تقنية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

الخلايا الآكلة للعظم هي خلايا رئيسية لامتصاص العظام في الجسم. يصف هذا البروتوكول طريقة موثوقة للتمايز في المختبر بين الخلايا الآكلة للعظم من وحيدات الدم المحيطية البشرية. يمكن استخدام هذه الطريقة كأداة مهمة لزيادة فهم بيولوجيا ناقضة العظم في الاتزان الداخلي والأمراض.

تمايز الخلايا العظمية الوظيفية من الخلايا الوحيدة CD14 + للدم المحيطي البشري

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0. يصف بروتوكولنا طريقة محسنة وقابلة للتكرار لتوليد ناقضة العظم في المختبر والتي يمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الكامنة وراء عملية التمايز ووظائفها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي القدرة على توليد أعداد كبيرة من الخلايا الآكلة للعظم النشطة وظيفيا في غضون أسبوع واحد فقط. يتم تحقيق عائد تمايز عالي باستخدام الخلايا الوحيدة المنقاة وإضافة السيتوكينات في الوقت المحدد.الخلايا الآكلة للعظم هي المسؤولة عن تدمير العظام في جميع أشكال التهاب المفاصل ، وتوفر هذه الطريقة الأدوات اللازمة لفحص المركبات العلاجية الجديدة التي يمكن أن تعدل تمايزها و / أو وظائفها. سيكون إثبات الإجراء باتريشيا ريدلوفا ، طالبة دكتوراه من مختبرنا. للبدء ، اعزل PBMCs عن طريق نقل الدم إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر.تمييعه مع PBS معقمة في حجم متساو للدم الطازج ، أو نسبة 1: 3 لمخاريط الكريات البيض والمعاطف بافي. خلط الدم بلطف عن طريق الانقلاب. قم بإعداد أنابيب سعة 15 ملليلترا تحتوي على ثلاثة ملليلتر من وسط تدرج الكثافة ، وقم ببطء بطبقة من ثمانية إلى 10 ملليلتر من الدم المخفف على الجزء العلوي من وسط تدرج الكثافة ، وتجنب الخلط.جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بدون فرامل. ثم تخلص بعناية من الطبقة العليا باستخدام ماصة باستور. اجمع الطبقة السفلية البينية التي تحتوي على PBMCs ، وانقل هذه الطبقة إلى أنبوب جديد سعة 50 ملليلتر.قم بتعليق الخلايا حتى 50 ملليلتر باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، واغسل وسط تدرج الكثافة المتبقية عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الفرامل الكاملة. لإزالة الصفائح الدموية المتبقية ، كرر عملية الطرد المركزي كما هو موضح في المخطوطة ، وأعد تعليق PBMCs المعزولة والمنقاة في 20 ملليلتر من PBS ، وعدها باستخدام مقياس الدم باتباع الطريقة القياسية. لإثراء CD14 + monocytes ، انقل 1 × 10 إلى PBMCs السابعة إلى أنبوب بوليسترين مستدير القاع مناسب ، وقم بتجميع الخلايا عند 300 × جم لمدة خمس دقائق.بعد التخلص من المادة الطافية وتعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت لفصل الخلايا ، احتضن الخلايا ب 10 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لكل 100 ميكرولتر مع الغطاء لمدة 10 دقائق. في نهاية الحضانة ، أضف 10 ميكرولتر من حبات الجسيمات النانوية المغناطيسية لكل 100 ميكرولتر ، واحتضانها لمدة ثلاث دقائق مع الغطاء. قم بزيادة الحجم إلى 2.5 ملليلتر باستخدام المخزن المؤقت لفصل الخلايا.ضع الأنبوب في مغناطيس ، واحتضانه لمدة ثلاث دقائق مع إزالة الغطاء. الآن ، تجاهل مجتمع الخلايا السالبة بحركة واحدة مستمرة عن طريق الانقلاب بينما لا يزال الأنبوب في المغناطيس. قم بإزالة الأنبوب من المغناطيس ، واغسل الخلايا الوحيدة CD14 + المخصبة المتصلة بالخرز المغناطيسي عن طريق تعليقها في 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت لتعليق الخلية ، ثم ضع الأنبوب مرة أخرى في المغناطيس.عد الخلايا المعزولة كما هو موضح سابقا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا التي تم جمعها في 300 × غرام لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق الخلايا بمعدل 1 مليون خلية لكل مليلتر في الحد الأدنى من الوسط الأساسي ألفا الكامل مع 10٪ FBS.للتمييز بين ناقضة العظم ، أضف M-CSF بتركيز نهائي يبلغ 25 نانوجرام لكل ملليلتر إلى تعليق الخلية ، واخلطه عن طريق السحب جيدا لتجانس تعليق الخلية. لوحة 100 ميكرولتر من التعليق لكل بئر في لوحة مسطحة القاع 96 بئر. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم لكل بئر حول الخلايا المطلية لمنع التبخر المتوسط وتأثيرات الحافة في نظام الاستزراع.احتضان الخلايا طوال الليل لمدة 18 إلى 20 ساعة تقريبا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بإعداد وسائط جديدة مكملة ب M-CSF و RANK ligand. بعد الحضانة ، قم بإزالة نصف الوسط بعناية عن طريق الشفط باستخدام ماصة P200 ، واستبدله بوسط كامل طازج ودافئ مكمل ب M-CSF و RANK ligand بتركيز نهائي يبلغ 25 نانوجرام لكل ملليلتر.قم بتفريق الخلايا إلى ناقضات عظمية لمدة سبعة إلى 14 يوما مع استبدال كامل للوسط كل ثلاثة أيام. بعد إزالة الوسط ، قم بإصلاح الخلايا العظمية الملتصقة المتمايزة ب 100 ميكرولتر لكل بئر من المحلول المثبت المحضر ، واحتضانها لمدة دقيقة واحدة. لا تلمس قاع الآبار لتجنب خدش الخلايا الملتصقة.بمجرد غسل الآبار ثلاث مرات ب 300 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم ، جفف الألواح ، وأضف 100 ميكرولتر من محلول التلوين الطازج إلى كل بئر. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول التلوين عن طريق الانقلاب وغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر لكل بئر من الماء المقطر.قم بإزالة الماء الزائد عن طريق النقر على الأطباق على مناشف ورقية ، واترك الأطباق مفتوحة ومحمية من الضوء إلى الهواء الجاف طوال الليل. باستخدام مجهر برايت فيلد مع خيار البلاط ، التقط صورا بمعدل 10 أضعاف أو 20 ضعفا لالتقاط سطح البئر بالكامل. عد يدويا الخلايا العظمية المحددة على أنها خلايا ملطخة أرجوانية TRAP + تحتوي على أكثر من ثلاث نوى باستخدام برنامج تحليل الصور مع مكون إضافي لعداد الخلايا.لوحة 100 ميكرولتر من CD14 + monocytes-per-well المعزولة في شريحة حجرة مكونة من 18 بئرا بكثافة خلية 1 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل بئر. قم بتمييز الخلايا الآكلة للعظم في وجود M-CSF و RANK ligand كما هو موضح سابقا مع تغيير كامل للوسط كل ثلاثة أيام. في نقطة وقت النهاية ، قم بإزالة الوسط برفق واغسل كل بئر مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تم تسخينه مسبقا عند درجة الحموضة 7.4.لا تدع الآبار تجف بين الخطوات. ثبت العينة بمحلول 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول الفورمالديهايد 4٪ في برنامج تلفزيوني ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري مع اهتزاز لطيف. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 200 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني.قم بتخلل الخلايا باستخدام 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول Triton x-100 المخفف بنسبة 0.1٪ في برنامج تلفزيوني ، واحتضانه لمدة 10 دقائق كما هو موضح سابقا. اغسل مرتين مع 200 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني. لمنع الارتباط غير المحدد وزيادة الإشارة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الحجب المصنوع من 2٪ ألبومين مصل البقر ومحلول PBS.احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري مع اهتزاز لطيف. بعد إزالة محلول الحجب ، أضف 100 ميكرولتر من محلول القضيب المترافق بالفلورسنت المخفف في محلول 2٪ BSA / PBS لكل بئر. اغسل مرتين مع 200 ميكرولتر لكل بئر من برنامج تلفزيوني.تلطيخ النوى ب 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول PBS يحتوي على 300 نانومول DAPI. بعد 10 إلى 15 دقيقة ، قم بإزالة محلول DAPI واستبدله ب 100 ميكرولتر لكل بئر PBS. تصور التلوين باستخدام المجاهر المناعية المناسبة أو المجاهر متحدة البؤر من أربعة إلى 40x.يتم تعريف الخلايا العظمية الناضجة على أنها TRAP + خلايا نواة متعددة. أنتجت إضافة ليجند RANK أعدادا متزايدة من الخلايا العظمية الكبيرة TRAP + متعددة النوى بطريقة تعتمد على الجرعة. تم التحقيق في حركية تمايز ناقضة العظم من الخلايا الوحيدة على مدى فترة استزراع من يومين إلى 14 يوما.كانت الخلايا العظمية متعددة النوى مرئية من اليوم الخامس فصاعدا ، وتم الوصول إلى التمايز الأمثل في اليوم السابع. يسمح تمايز الخلايا الآكلة للعظم على الأسطح المعدنية بتقييم نشاط ارتشافها من خلال تحليل تكوين ثقوب مستديرة أو حفر ارتشاف. تزداد نسبة الارتشاف بشكل كبير في وجود M-CSF و RANK ligand عند مقارنتها ب M-CSF وحدها.علاوة على ذلك ، فإن العلاج بجرعة الروتينون التي تعتمد على جرعة تمنع ارتشاف السطح المعدني مقارنة ببئر التحكم غير المعالج. ارتبط تثبيط الروتينون المعتمد على ارتشاف ناقضة العظم بتثبيط إنتاج ATP. لوحظ تجزئة حلقة الأكتين المشتقة من RANK ligand من OCS الناضجة في وجود الروتينون.من المهم التأكد من أن الخلايا الوحيدة المخصبة لا تحتوي على الصفائح الدموية ، وأن الخلايا مطلية بالكثافة المناسبة ، وأن الآبار المحيطة مملوءة بالماء لتجنب تأثير الحافة. هذا البروتوكول مفيد بشكل خاص للاستجواب الميكانيكي لكيفية تشكل الخلايا الآكلة للعظم ، وما الذي يؤثر على وظائفها في كل من العلوم الأساسية والانتقالية. على سبيل المثال ، باستخدام المركبات أو البروتينات التي يمكن أن تعدل هذه العمليات.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

التوسع في الدم المحيطي الإنسان خلايا T γδ باستخدام Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

الكمية التصوير من النسب المحددة اشارة مستقبلات بوساطة الرقم تشبه في وحيدات والخلايا الجذعية من عينات صغيرة من دم الإنسان

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

كشف الجليكوجين في خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى مع الدوري حمض شيف تلطيخ

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

توليد خلايا T الإنسان مستضد خيفي محددة من الدم المحيطي

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

عزل، التمايز، والكمي للالإنسان الأجسام المضادة إفراز خلايا B من الدم: ELISPOT باعتبارها قراءات الوظيفية للالخلطية الحصانة

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte التمايز وتكوين الصفائح الدموية من الإنسان الحبل CD34 المستمدة من الدم الخلايا+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

تقييم الواجهة متشابك لخلايا تي البشرية الأولية من الدم والأنسجة اللمفاوية

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

العزلة ، الانتقال ، وثقافة الخلايا البشرية الاوليه

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...