Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
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作者非常感谢感染与免疫学院内的Flow核心设施和格拉斯哥成像设施（GIF）对这项工作的支持和协助。

从苏格兰国家输血服务局（爱丁堡）获得的白细胞外套和从NHS血液和移植（纽卡斯尔）获得的白细胞锥以完全匿名（不可识别）的形式提供给格拉斯哥大学的研究人员，来自完全同意的NHS献血者。血沉棕黄层和白细胞锥形血液成分由苏格兰或英格兰的NHS献血中心提供的NHS标准献血产生。献血者在献血时对标准NHS临床实践中未使用的剩余血液给予知情同意，以用于批准的医学研究。NHS研究伦理委员会的伦理批准和签署的使用这些献血的捐赠者同意书由NHS献血服务机构持有。使用国家输血服务（苏格兰）和NHS血液和运输（英格兰）的标准内部申请和审查流程，寻求并获得了在批准的医学研究中访问和使用这些同意的献血的批准。不需要进一步的NHS REC批准或格拉斯哥大学内部伦理委员会的批准即可将血液成分用于批准的医学研究。
1. 开始前的一般注意事项
<ol><li>谨慎地进行所有血液工作。考虑样品中可能存在的各种传染因子的潜在危害。</li>
	<li>在无菌条件下，在生物安全实验室中谨慎地进行所有工作，同时戴上手套和实验室外套。</li>
	<li>根据当地指南进行生物安全处置。</li>
	<li>根据地方当局的规定，在采集样本之前获得适当的同意和道德批准。</li>
	<li>一般来说，1mL新鲜血液会产生100万个PBMC，CD14+单核细胞约占PBMC的10%-30%。相比之下，10 mL 的白细胞锥体可以包含 5 x 10 8-15 x 108 PBMC。有关 PBMC 隔离的更多详细信息，请参阅之前的协议37。</li>
</ol>2. 从全血中分离外周血单核细胞（PBMC）
<ol><li>从健康供体收集所需体积的新鲜血液到锂肝素收集管中。 注意：也可以使用其他带有适当抗凝剂的收集管（例如，肝素钠管）。对于更高的细胞计数，可以使用白细胞锥或血沉棕黄层。</li>
	<li>要分离 PBMC，请将血液转移到新的 50 mL 管中，并分别用无菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 以 1：1 或 1：3 的比例稀释新鲜血液或白细胞锥体/血沉棕黄层。</li>
	<li>通过倒置轻轻混合细胞几次。</li>
	<li>准备含有 3 mL 密度梯度培养基的 15 mL 管。将8-10mL稀释的血液缓慢地分层在密度梯度培养基的顶部，并在室温（RT）下以400× g 离心30分钟，无需制动。 注意：将血液小心地涂抹在密度梯度介质的顶部，以防止混合。混合可能会导致PBMC的损失。</li>
	<li>用巴斯德移液管小心地丢弃顶层（含有血浆），收集含有PBMC（白色环状结构）的下层界面层，并将该层转移到新的50 mL管中。</li>
	<li>用无菌 1x PBS 悬浮细胞高达 50 mL，并通过在室温下以 300 x g 离心 10 分钟并完全制动来洗去残留的密度梯度培养基。</li>
	<li>为了去除残留的血小板，在没有制动器的情况下，在室温下以200× g 的额外较慢旋转10分钟重复该过程。</li>
	<li>可选：要去除红细胞残留物，请在蒸馏水中以 1：10 的比例稀释红细胞裂解缓冲液（10x， 材料表），然后将 3 mL 稀释的缓冲液涂在沉淀上。混合，孵育3分钟。在多达 50 mL 的 1x PBS 中洗涤沉淀，并在室温下以 300 x g 离心 10 分钟，并带全制动器。</li>
	<li>将分离和纯化的PBMC重悬于20 mL的1x PBS中，并使用血细胞计数器或遵循其他标准方法进行计数。 注意：细胞稀释和细胞计数方法必须根据所使用的细胞密度和计数设备进行相应的调整。</li>
</ol>3. 富集来自PBMC的CD14+ 单核细胞
<ol><li>根据制造商的方案（材料表），使用人CD14 +选择试剂盒从PBMC中分离CD14 +单核细胞。 注意：经典CD14 + CD16− 单核细胞是OC前体35的主要来源;可以考虑其他纯化方法。</li>
	<li>将 1 x 107 PBMC 转移到合适的聚苯乙烯圆底管（即适合选择套件磁铁）中，并以 300 x g 将细胞沉淀 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于细胞分离缓冲液（PBS、2% 胎牛血清 [FBS]、1 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA]）中至终浓度为 1 x 108 个细胞/mL，并在盖上盖子的情况下与每 100 μL 10 μL 抗体混合物孵育 10 分钟。 注意：细胞以 1 x 108 个细胞/mL 重悬;相应地调整音量。</li>
	<li>孵育后，每 100 μL 加入 10 μL 磁性纳米颗粒珠，并在盖上盖子的情况下孵育 3 分钟。 注意：调整抗体混合物和磁珠的体积以获得 10 μL/mL 的浓度。</li>
	<li>用细胞分离缓冲液将体积加满至2.5 mL，将试管放入磁铁（不带盖子）中，孵育3分钟。当管仍在磁铁中时，通过反转连续移动丢弃阴细胞群。 注意：如果使用 >2 x 108 PBMC 和更大的磁体，请按照制造商的说明使用细胞分离缓冲液加满 5 mL 或 10 mL。</li>
	<li>从磁铁上取下试管，并通过将它们重悬于2.5mL细胞分离缓冲液中来洗涤附着在磁珠上的富集CD14 + 单核细胞。像以前一样在磁铁内孵育3分钟，丢弃负部分，然后再次重复一次。</li>
	<li>将所有收集的细胞以 300 x g 离心 5 分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 5 mL α 最小必需培养基 （α-MEM; 目录）补充 1% L-谷氨酰胺、1% 青霉素/链霉素（完全 α-MEM）和 10% FBS。 注意：建议通过流式细胞术 进行 富集后纯度检查，预期纯度应为≥96%。额外的洗涤步骤（步骤3.6）可以提高纯度。</li>
</ol>4. 体外OC分化
<ol><li>使用血细胞计数器计数富集的CD14 + 单核细胞。</li>
	<li>以 300 x g 沉淀细胞 5 分钟，并在补充有 10% FBS 的完整 α-MEM 中以 1 x 106 个细胞 /mL 重悬。</li>
	<li>为了区分OC，将终浓度为25ng / mL的M-CSF添加到细胞悬液中。 注意：对于 1 mL 细胞悬液，从 100 μg/mL 的储备浓度中加入 0.25 μL M-CSF。</li>
	<li>通过彻底移液混合以均质化细胞悬液，并在平底 96 孔板中板 100 μL/孔，最终细胞密度为 1 x 105 个细胞/孔。</li>
	<li>将 200 μL/孔无菌蒸馏水添加到铺板细胞周围的孔中，以防止培养基蒸发和培养系统中的边缘效应。</li>
	<li>将细胞在37°C下用5%CO2孵育过夜约18-20小时。</li>
	<li>孵育过夜后，使用 P200 移液管通过抽吸小心地去除一半的培养基（50 μL/孔），避免接触孔底部，并用含有 10% FBS、25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL RANKL 的新鲜温热的完整 α-MEM 替换，最终浓度为 25 ng/mL 注意：对于 1 mL 培养基，从 100 μg/mL 的储备浓度中加入 0.25 μL M-CSF 和 0.5 μL RANKL。</li>
	<li>每3天更换一次培养基，并将细胞分化为OC7-14天（图1）。 注意：在整个培养过程中保持M-CSF和RANKL浓度一致。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig01.jpg"> 图 1：OC 差异化工作流程。 从PBMC中分离CD14 + 单核细胞并在M-CSF和RANKL存在下分化为成熟OC的示意图概述7-14天。RT = 室温。使用 BioRender.com 创建的图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
5. 破骨细胞的陷阱染色
<ol><li>小心地除去培养基，用100μL/孔的先前制备的固定溶液固定分化的贴壁OC，并孵育1分钟。不要触摸孔的底部，以免划伤贴壁细胞。 注意：固定剂溶液的制备方法如下：12.5 mL 柠檬酸盐溶液（包含在 TRAP 染色试剂盒中）、32.5 mL 丙酮和 5 mL 37% 甲醛。</li>
	<li>用 300 μL 无菌蒸馏水洗涤孔三次。清洗后将盘子拍干。</li>
	<li>根据制造商的说明（材料表）制备染色溶液;加入 5 μL 快速石榴石和 5 μL 亚硝酸钠制成快速石榴石溶液;倒置混合，并在室温下孵育 3 分钟。 通过混合 900 μL 无菌蒸馏水、10 μL 萘酚、40 μL 乙酸盐溶液、50 μL 酒石酸盐溶液和 10 μL 快速石榴石溶液制备 1 mL 染色溶液。</li>
	<li>加入100μL /孔新鲜制备的染色溶液，并将板在37°C下在黑暗中孵育20分钟。</li>
	<li>孵育后，倒置除去染色溶液，并用300μL/孔蒸馏水洗涤板三次。</li>
	<li>通过在纸巾上敲击盘子来去除多余的水。将板打开并避光干燥过夜。 注意：干燥板最多可以保存 6 个月。有时，残留的缓冲液可以促进霉菌的发展，在显微镜下可见;这可以通过用蒸馏水清洗受影响的井并让它们再次风干来随时去除。</li>
	<li>使用带有平铺选项的明场显微镜以 10x 或 20x 拍摄图像，以捕获整个孔表面。</li>
	<li>使用带有细胞计数器插件的图像分析软件手动计数具有三个以上细胞核的 TRAP+ 紫色染色细胞的 OC。 注意：每孔的TRAP+ OC数量取决于供体，可能在~200-1，600 OC /孔之间变化，平均约为1，000 OC /孔。此外，为了分析数据，应在三个不同的孔中确定OC数（技术重复），并应计算每个条件和每个生物重复的平均值。</li>
</ol>6. 骨吸收试验
<ol><li>将新鲜富集的CD14 +单核细胞铺在涂有磷酸钙的96孔骨测定板上，以1 x 105 个细胞/孔，并分化OC7-14天，如步骤4.1-4.8所示，并每3天更换一次培养基。 注意：牙本质/象牙或牛皮质骨切片可用于代替骨测定板。如果是这样，由于要再吸收更复杂的底物，培养的总时间应延长至14-21天。</li>
	<li>在结束时间点，小心地除去培养基，避免接触孔底，并用10%次氯酸钠溶液裂解细胞。用蒸馏水清洗孔三次。</li>
	<li>使用明场显微镜扫描干燥板，并使用图像分析软件分析/量化吸收坑的采集图像。</li>
</ol>7.肌动蛋白环荧光染色
<ol><li>在 18 孔室载玻片中以 1 x 105 个细胞 /孔的细胞密度将 100 μL/孔的分离的 CD14+ 单核细胞板 100 μL/孔。如前所述（步骤4.1-4.8），在存在M-CSF和RANKL的情况下区分OC，包括每3天更换一次培养基。</li>
	<li>在结束时间点，轻轻除去培养基，并用 200 μL/孔预热的 PBS（pH 7.4）洗涤每个孔两次。不要让井在任何步骤之间干涸。</li>
	<li>用 100 μL/孔的 4% 甲醛溶液在 PBS 中固定样品，并在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动孵育 10 分钟。 注意：甲醇会在固定过程中破坏肌动蛋白。因此，最好避免使用任何含甲醇的固定剂。优选的固定剂是无甲醇甲醛。协议这一步中使用的轨道振动台的功率设置为10分中的3分。</li>
	<li>用 200 μL/孔的 PBS 洗涤两次，用 100 μL/孔的 0.1% Triton X-100 溶液在 PBS 中稀释透化细胞，并在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动孵育 10 分钟。</li>
	<li>用 200 μL/孔的 PBS 洗涤两次。要阻断非特异性结合并增加信号，请加入 100 μL/孔由 2% 牛血清白蛋白 （BSA）/PBS 溶液制成的封闭溶液。在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动孵育20分钟。</li>
	<li>取出封闭溶液，加入 100 μL/孔的荧光共轭鬼笔环肽溶液，稀释在 2% BSA/PBS 溶液中。在室温下在轨道摇床上孵育20分钟，轻轻摇动并避光。 注意：根据制造商的建议调整鬼笔环肽染料的浓度。</li>
	<li>用 200 μL/孔的 PBS 洗涤两次，用 100 μL/孔的含有 300 nM DAPI 的 PBS 溶液染色细胞核，并在室温下在轨道振荡器上温育 10-15 分钟，轻轻摇动并避光。 注意：将DAPI在蒸馏水中稀释，制成14.3 mM（5 mg / mL）DAPI储备溶液。将储备溶液进一步稀释至终浓度300μM。最后，将300μM DAPI溶液在PBS中再次稀释一次至终浓度为300nM。</li>
	<li>10-15分钟后，取出DAPI溶液，并用100μL/孔PBS替换。 注意：根据所选的腔室载玻片，使用适当体积的PBS（18孔腔室载玻片为100μL/孔）储存，或使用盖玻片和适当的安装介质安装载玻片。腔室载玻片可以在冰箱中存放长达 1 周。对于 18 孔室载玻片，使用 50-100 μL 染色体积和 200-300 μL 进行洗涤。相应地放大到其他腔室载玻片尺寸。为避免蒸发，在孵育期间将盖玻片放在有盖的容器内。建议使用轨道振动台，但不是必需的。</li>
	<li>使用适当的免疫荧光或共聚焦显微镜和4倍至40倍的放大倍数可视化染色。</li>
</ol>8. 通过流式细胞术分选 富 集成熟OC和OC前体
<ol><li>将新鲜富集的CD14 + 单核细胞重悬于1 x 106 个细胞/mL，并在M-CSF和RANKL存在下以与上述相同的方式将它们分化为成熟的OC（步骤4.1-4.8）。 注意：从96孔板放大到更大的板尺寸时，请遵循 表1;这些体积从 1 x 106 个细胞/mL 溶液开始计算，并为细胞间融合提供最佳密度。</li>
	<li>在第 7 天，用温热的 PBS 洗涤孔一次，并向 1 mL（体积由所用板尺寸决定）的 accutase 中加入 50 μL。将细胞在37°C下用5%CO2 孵育20分钟。</li>
	<li>孵育后，在光学显微镜下检查平板，看看细胞是否已分离。此外，通过敲击所有侧面的板并上下移液来分离细胞。</li>
	<li>将细胞悬液收集在 15 mL 锥形管中。用温热的PBS（无钙2+，无镁2+）洗涤孔，并将它们与细胞悬液结合。重复步骤8.2-8.3一次或两次，直到大多数细胞分离。 注意：Accutase是流式细胞术分析表面染色前的推荐方法，不会分离非常大的OC。回收率为~50%-70%。</li>
	<li>将细胞以 300 x g 离心 5 分钟，将细胞沉淀重悬于 1 mL PBS 中，并通过台盼蓝排除对细胞进行计数。</li>
	<li>以 1 x 106 个细胞/mL 重悬细胞，取出对应于 1 x 105 个细胞的 100 μL，并将这些细胞转移到新的聚丙烯试管中。加入 200 μL 细胞分选缓冲液，并将其放在冰上作为未染色的对照。</li>
	<li>用活/死染料在室温下以1：750稀释10分钟并避光染色其余细胞。 注意：活/死染色需要在没有FBS的情况下进行，以避免高背景染色。</li>
	<li>用温热的细胞分选缓冲液（1x PBS，无钙2+，无Mg2+，1%FBS和5mM EDTA）填充含有活/死染色细胞悬液的15 mL收集管，并以300 x g 离心5分钟以沉淀细胞。 注意：建议在分选缓冲液中使用高浓度的EDTA和低浓度的FBS，以防止细胞团块。</li>
	<li>取出对应于1 x 105 细胞的体积，并将它们转移到新的聚丙烯试管中进行OSCAR同种型对照。将所有剩余的细胞转移到另一个聚丙烯试管中进行染色和细胞分选。 注意：聚丙烯试管用于分选，因为细胞比聚苯乙烯管更不可能粘附在这些试管上。</li>
	<li>以400× g 离心管5分钟以沉淀细胞，并通过倒置丢弃多余的上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于 表2制备的抗体预混液中。用 CD14 抗体和 OSCAR 同种型对照对 OSCAR 同型对照管进行染色，以代替 OSCAR 抗体。</li>
	<li>将细胞在4°C避光孵育30分钟。</li>
	<li>30分钟后，通过加入五体积的细胞分选缓冲液洗涤细胞，并在4°C下以400× g 离心5分钟。</li>
	<li>将细胞重悬于300-1，000μL冷细胞分选缓冲液中，并使用装有100μM喷嘴的流式细胞术分选机采集细胞。 注意：OC是非常粘性的细胞，因此在分选之前通过无菌的70μm膜过滤它们很重要。</li>
	<li>将OC和前OC作为CD14−OSCAR+进行门控。根据OSCAR同种型对照管设置OSCAR+门。</li>
	<li>将分选的细胞收集在聚丙烯试管中，该试管含有完整的α-MEM，在8°C下补充有20%FBS。</li>
	<li>分选后，通过在室温下以300×g离心5分钟来沉淀细胞，对细胞进行计数，并重悬用于下游应用。 注意：通常，要获得~1 x 105 个分类的预OC / OC，请从第0天接种的~10 x 106 个细胞开始。低回收率受与Accutase分离期间的细胞损失以及染色和分选处理的影响。建议使用无菌缓冲液和试剂进行整个过程，并在无菌条件下工作。</li>
</ol>9. 线粒体活性的ATP测定
<ol><li>在M-CSF和RANKL存在下，以与前面描述相同的方式在96孔板中孵育富集的CD14 + 单核细胞（步骤4.1-4.8）。将四个额外条件一式三份板以用作对照。</li>
	<li>根据制造商手册使用发光ATP检测试剂盒进行ATP测定。简而言之，为了制备ATP溶液，将10mL的底物缓冲溶液添加到冻干的底物中，并将其在室温下孵育30分钟。 注意：可以使用不同的方法来测量细胞内ATP的产生。在这里，我们使用了通过发光检测ATP的产生。</li>
	<li>在孵育期间，准备对照品并将其直接添加到对照孔中，如下所示：10mM和100mM的2-脱氧-D-葡萄糖（2DG），1μM的寡霉素和100mM 2DG与1μM寡霉素的组合。在37°C下用5%CO2孵育30分钟。 注意：2DG阻断糖酵解，而寡霉素是氧化磷酸化的抑制剂。结合这两种抑制剂导致通过糖酵解和氧化磷酸化 完全 失去ATP的产生，因此这意味着它们可作为ATP测定的内部对照。对于 10 mM 和 100 mM 2DG 对照，每 100 μL 培养孔分别加入 0.5 μL 和 5 μL 2M 2DG 储备溶液。对于 1 μM 寡霉素，将 5 mM 储备溶液在培养基中以 1：100 稀释，并向专用对照孔中加入 2 μL/孔。对于最后一个对照，每孔加入 5 μL 2DG 和 2 μL 稀释的寡霉素溶液。</li>
	<li>向每个孔中加入 50 μL ATP 溶液以停止反应，并在室温下以 700 rpm 在振荡器上避光孵育 5-10 分钟。</li>
	<li>将 100 μL 上清液转移到特定于 ATP 测定的 96 孔白底板上，并使用发光读数器读取板。</li>
</ol>

提交人声明他们没有竞争利益。

体外大量功能性OC的易于培养和分离对于促进对骨生物学和OC介导疾病的理解非常重要。传统上，OCs是在与成骨细胞或基质细胞以及来自脾脏或骨髓的造血细胞共培养中产生的38，39。在理解破骨形成方面的一个重大突破是将RANKL确定为OC形成，分化和生存的主要调节因子40。依赖RANKL的培养系统的早期协议使用PBMC进行OC生成21，41，42。然而，这些混合培养物时间很长，并且存在许多混杂因素，限制了测试对OC分化和功能的直接影响的能力。该协议描述了一种来自人外周CD14 +单核细胞的高效可靠的碎骨形成的体外模型，其中可以在7天内获得最佳的碎骨形成（图1和图2），与其他一些方案相比，这要快得多43，44，45，46.该方案的主要区别特征是（1）使用纯化的CD14 +单核细胞，（2）在暴露于RANKL之前用M-CSF启动单核细胞，（3）培养物的长度（<7天），以及（4）可靠地检测OC形成（TRAP染色）和功能（吸收，ATP产生，肌动蛋白环重组）与抑制剂。 
在方法优化过程中，确定了几个关键点。已经观察到，OC的体外分化在很大程度上取决于CD14+单核细胞的接种密度。因此，在该协议中，细胞以高密度接种（1 x 105 细胞/孔的 96 孔板，在 100 μL 培养基中），因为细胞必须能够相互作用并且靠近融合并成为成熟的 OC。同样，由于培养基限制和缺乏所需空间，以过高的密度接种细胞会限制其分化和生长。此外，为了通过该协议获得最大的成功，重要的是要仔细进行密度梯度分离，并确保CD14 +细胞的富集群体尽可能纯净。例如，洗涤步骤不足导致血小板缺乏去除，从而抑制OC分化47，48。同样，单独用M-CSF刺激的分离CD14+制剂中存在轻微的T细胞污染可导致OC分化，可能通过T细胞49的RANKL分泌。因此，重要的是为每个实验包括M-CSF对照。还建议进行常规纯度检查，尤其是在使用新的分离试剂盒时，以确保样品的纯度。
使用富含核苷和L-谷氨酰胺的α-MEM培养基可实现最佳OC数（范围：~200-1，600 OC/孔）。其他常规培养基，包括Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）和罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640培养基，都会影响OC产量。FBS的来源也可以影响破骨形成。不同批次的FBS可导致RANK-L衍生的破骨形成减少，以及M-CSF对照中出现少量的TRAP+ 多核细胞（补充图3）。因此，为了获得一致的结果，建议在使用前测试新的FBS批次，并在整个实验过程中继续使用同一批次，以尽量减少分化过程中的变化。此外，供体与供体之间的变异性，即在终点时间点获得的差异化OC的总数，构成了使用该协议来比较例如健康供体与患者的限制。在这些情况下，必须使用完全相同的条件和相同批次的培养基、FBS和其他试剂。
最佳OC分化和成熟的另一个必要步骤是在添加RANKL之前用M-CSF启动单核细胞。在RANKL之前18-24小时将细胞暴露于M-CSF使单核细胞启动以上调RANK表达15，26。在此时间点添加RANKL可确保以剂量依赖性方式实现最佳的OC分化。OC的分化程度因供体而异;然而，25 ng/mL RANKL 通常足以区分大多数供体中的大量 OC。此外，25 ng/mL RANKL 可用于化合物初始筛选的测定，因为它有助于评估测试化合物的增强和抑制作用。其他培养系统在添加RANKL之前使用了更长的M-CSF预孵育时间，但这导致破骨形成50的培养时间更长。此外，让引发的单核细胞孵育过夜允许它们附着在板上，尽管不是完全贴壁状态。因此，当首次引入RANKL时，必须非常小心地对培养基进行半改变，而不是完全改变，以防止引发的单核细胞脱离和丢失。培养基也需要每3-4天刷新一次，以避免培养基耗尽并防止细胞死亡。此外，由于该测定中使用的体积小（96孔板中的100μL/孔），因此在测定孔周围有一个空孔框架至关重要，该空孔在测定孔周围填充有水溶液（即无菌蒸馏H2O或PBS）。这可以防止介质蒸发和边缘效应。
最后，对于代谢测定（例如，ATP测定），细胞必须可行，以避免重复之间的巨大标准偏差（图5）。细胞的高活力对于分选细胞和分选OC的进一步培养也很重要（图4）。但是，此方法有几个限制。完全成熟的OCs非常粘附，难以从板上分离。较大的OC通常无法分离，这可能导致较低的细胞产量。因此，需要在分选后和以所需浓度接种之前对细胞进行计数。此外，在本协议中，使用非酶法（accutase）分离OCs以防止流式细胞术下游表面染色中的膜改变。还测试了细胞刮刀（具有软端或硬端）的使用，并导致高细胞死亡。当下游应用不需要膜完整性时，使用 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 溶液的酶分离可用于提高分离 OC 的产量。此外，为防止OC聚集在一起，强烈建议在细胞分离后的所有缓冲液中使用高浓度的EDTA，并在流式细胞术采集之前进行适当的过滤。需要注意的是，OC培养物是由成熟的OC、OC前体和巨噬细胞组成的异质细胞群。巨噬细胞可以很容易地与OC区分开来，尽管单核前OC和多核OC都表达OSCAR，并且不能用本方法区分（图4）。事实上，后一个问题构成了这种方法的主要局限性。此外，在M-CSF培养物中也存在OSCAR的低表达（图4B），可能表明巨噬细胞已为OC谱系承诺做好准备。根据FMO染色信号设置OSCAR+ 细胞的门非常重要，如图 4B所示。
总之，该协议描述了一种优化且稳健的方法，用于从循环原代人单核细胞中有效生产活性和功能成熟的OC。该协议的优势在于它能够在短时间内生成OC并产生大量差异化的OC。该方法为研究OC分化和功能的基本机制开辟了道路。

破骨细胞（OCs）是造血谱系的多核巨细胞，具有独特的骨吸收能力。他们负责骨架1，2的开发和持续重塑。在发育的骨骼阶段，OC和组织驻留巨噬细胞来源于红髓祖细胞，并在骨壁龛和器官组织中定植。在生理条件下，正常的骨发育和牙齿萌出需要红髓祖细胞，而循环血液单核细胞流入骨壁龛提供了OCs，骨量和骨髓腔的产后维持3。在病理条件下，单核细胞被募集到活动性炎症部位，并可能导致病理性骨破坏4，5。
患有多种关节炎的患者会出现关节炎症，导致OCs6引起的进行性关节破坏。例如，在类风湿性关节炎（RA）中，过度激活的OC负责病理性骨侵蚀和关节破坏7，8，而目前的治疗通常不能改善或阻止骨损伤9，10，11。在RA患者中，循环单核细胞在群体分布以及转录组学和表观遗传特征方面的改变均已报道12，13，14。此外，据报道，单核细胞对炎症刺激的反应改变会影响活动性疾病15，16，17 的 RA 患者的破骨形成。
OC的分化是一个复杂的多步骤过程，包括髓系前体细胞分化为OC前体的承诺。在破骨过程中，OC通过细胞 - 细胞融合，不完全细胞分裂以及称为裂变和融合的核循环过程变得巨大和多核18，19，20。 在体外区分OCs的能力使得对骨生物学的理解取得了重大进展21。口服避孕药在暴露于巨噬细胞集落刺激因子 （M-CSF） 和核因子 kappa-B 配体 （RANKL） 的受体激活剂时与前体分化。后者对于OCs在体外和体内的正常发育和功能至关重要，即使在炎症条件下也是如此6，22，23。RANKL由成骨细胞和骨细胞以及发炎的RA滑膜中的活化T细胞和成纤维细胞2，24，25呈现。在OC分化过程中，暴露于M-CSF的单核细胞上调其细胞膜上核因子kappa-B（RANK）表达的受体激活剂，并在随后的RANKL刺激下分化为酒石酸盐抗性酸性磷酸酶（TRAP）阳性单核前OCs，然后分化为多核OCs15，26。OC产生几种酶，其中最主要的是TRAP，它能够降解骨内的磷酸蛋白27。OC分化的调节因子和标志物是OC相关受体（OSCAR）。它在承诺OC谱系28的前体细胞早期上调。成熟的巨型多核OC可以通过产生一个大的密封区来降解（再吸收）骨骼基质，该密封区由围绕皱褶边界21，29，30的肌动蛋白环组成。OCs的骨吸收能力需要细胞骨架重组以及随之而来的极化和卷曲膜的形成，即所谓的皱褶边界。褶皱的边界被富含F-肌动蛋白结构的大圆形带包围，这是肌动蛋白环或密封区。肌动蛋白环完整性对于OC在体外和体内吸收骨至关重要，并且有缺陷的皱褶边界形成与较低的液泡腺苷三磷酸酶（V-ATPase）表达31，32，33有关。此外，OC是富含线粒体的细胞，三磷酸腺苷（ATP）与位于皱褶边界31，32，33的OC中的线粒体样结构相关。鱼藤酮作为线粒体复合物I的强抑制剂并影响ATP的产生。鱼藤酮也被证明可以抑制OC分化和功能34。
该协议描述了一种有效且优化的体外 外 周血样本破骨形成方法。在人外周血中，CD14+ 单核细胞是OCs15，35，36的主要来源。在该协议中，已经调整了暴露动力学以及M-CSF和RANKL的浓度，以实现最佳的破骨形成。首先通过密度梯度将单核细胞与全血中的红细胞和粒细胞分离;然后利用磁珠的正向选择富集CD14 + 单核细胞。然后将分离的CD14 + 单核细胞与M-CSF孵育过夜。这启动单核细胞以上调RANK15，26的表达。随后添加RANKL以时间依赖性方式诱导破骨形成和多核。活性再吸收OCs显示了细胞膜30，32 边缘的F-肌动蛋白环的特征分布和TRAP染色。通过定量TRAP + 多核（三个以上细胞核）细胞来分析成熟的OC。成熟OC的功能能力可以通过其吸收，肌动蛋白环完整性和ATP产生来评估。此外，分化的CD14− OSCAR+ OCs可以富集并用于通过矿物质（或牙本质）吸收和F-肌动蛋白组织 评估 某些化合物对OC功能的影响。此外，在这项工作中，一种已知的OC抑制剂鱼藤酮被用作影响OCs功能的化合物的示例。鱼藤酮下OC吸收活性降低与ATP产生减少和肌动蛋白环碎裂有关。总之，该协议建立了一个强大的测定方法，可用作研究OC分化和体外功能的几个生物学方面的参考 方法。 
该方法可用于评估（1）循环单核细胞在健康和疾病中分化为OC的潜力，以及（2）候选治疗药物对OC分化和功能的影响。这种强大的破骨形成方案能够确定骨靶向治疗对前体细胞OC分化和成熟OC功能的疗效和机制。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

破骨细胞（OCs）是骨吸收细胞，在骨骼发育和成人骨骼重塑中起着关键作用。几种骨骼疾病是由OCs的分化和激活增加引起的，因此抑制这种病理生物学是一个关键的治疗原则。两个关键因素驱动OCs与髓系前体的分化：巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和核因子κ-B配体的受体激活因子（RANKL）。长期以来，人们一直知道人循环CD14+ 单核细胞在体外分化为OC。然而，暴露时间和RANKL的浓度会影响分化效率。事实上，已经描述了在 体外 产生人类OC的方案，但它们通常会导致糟糕和漫长的分化过程。本文提供了一种稳健且标准化的方案，用于及时生成功能活跃的成熟人OC。CD14+ 单核细胞富集自人外周血单核细胞（PBMC），并用M-CSF引发上调RANK。随后暴露于RANKL以剂量和时间依赖性方式产生OC。通过酒石酸盐抗酸磷酸酶（TRAP）染色和光学显微镜分析来鉴定和定量OC。细胞核和F-肌动蛋白的免疫荧光染色用于鉴定功能活性的OC。此外，OSCAR+CD14− 成熟OC通过流式细胞术细胞分选进一步富集，并通过矿物（或牙本质/骨）吸收测定和肌动蛋白环形成定量OC功能。最后，一种已知的OC抑制剂鱼藤酮用于成熟的OC，证明三磷酸腺苷（ATP）的产生对于肌动蛋白环完整性和OC功能至关重要。总之，在这项工作中建立了用于区分大量OC的稳健测定方法，该测定与肌动蛋白环染色和ATP测定相结合，为评估OC功能并筛选可以调节分化过程的新型治疗化合物提供了有用的 体外 模型。

从CD14+单核细胞生成OC 该方法旨在体外轻松区分大量OCs与人外周血CD14 +单核细胞，通常在1周内。首先，CD14 +单核细胞从PBMC富集，并在过夜之间用M-CSF引发以上调RANK，如先前报道的那样15。单核细胞启动后，为了确定用于OC分化和成熟的RANKL的最佳浓度，使用1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL以及25ng/mL m-CSF的RANKL浓度。添加RANKL以剂量依赖性方式产生越来越多的大TRAP阳性多核OC，并使用TRAP染色进行评估。成熟口服避孕药被定义为具有多个细胞核（通常超过三个;图2A、B和补充图1）。此外，使用TRAP染色和光学显微镜在2-14天的培养期内研究了单核细胞OC分化的动力学。在这种情况下，选择使用中等浓度为50 ng/mL RANKL的OC分化来评估OC在培养中的分化速度。在这些培养条件下，从第5天开始可见多核OC，并在第7天达到最佳分化（图2C）。培养物在塑料上长时间孵育超过10天导致异常巨大的融合细胞。在该协议中，第6-8天通常用作OC生成的最佳终点。OC可以定量或用于下游测定。
差异化OC的功能评估 为了确定生成的OC的功能活性，我们通过区分矿化表面上的OC来检查它们的吸收活性。由于大OCs仅在7天培养期后产生，并且为了留出足够的时间来重新吸收矿物底物，因此将培养物保持到第10天。仅在含有用M-CSF和RANKL处理过的细胞的孔的矿化表面上观察到圆孔或吸收坑的形成（图3）。因此，溶解矿化表面（吸收坑）的百分比可以确定OC的再吸收能力。此外，在塑料和玻璃室载玻片上，遵循该方案分化的OC至第7天，显示出组织良好的肌动蛋白环结构，可以通过免疫荧光染色可视化（补充图2）。
抑制剂对成熟OC功能的影响 利用上述培养条件来确定在已知OC抑制剂鱼藤酮34存在下体外生成的OC的功能能力。将口服酶分化6-8天，通过流式细胞术富集CD14−OSCAR+口服避孕药和口服避孕药前体（图4）。然后将富集的细胞以50，000个细胞/每孔接种到产骨培养基（25ng / mL M-CSF和RANKL）中的矿物包被的96孔板上3天。与未处理的对照井相比，用鱼藤酮（图5A，B）处理剂量依赖性地抑制了矿化表面的再吸收，与以前的研究一致34。此外，通过ATP产生和肌动蛋白环形成评估OC功能。鱼藤酮依赖性OC吸收抑制与ATP产生的抑制有关（图5C）。吸收OCs是高度极化的细胞，通过促进细胞骨架组织来调节其吸收能力。Alexa fluor 647共轭鬼笔环肽用于标记在存在或不存在鱼藤酮的情况下培养的成熟OC的F-肌动蛋白细胞骨架。鱼藤酮导致成熟OC的RANKL衍生肌动蛋白环碎裂（图5D）。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> 图 2：OCs 有效区分 CD14+ 单核细胞前体。 将CD14 + 单核细胞磁性富集，以1 x 105 个细胞/孔接种在96孔板中，并用25ng / mL M-CSF孵育过夜。（A） 用增加浓度的 RANKL（1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL 和 100 ng/mL）刺激 M-CSF 引发的单核细胞，固定并在第 7 天染色以进行 TRAP。采集图像，并对TRAP+ 多核细胞（MNC）进行计数。TRAP染色的代表性图像如 补充图1所示。误差线显示平均值 SD ± （n = 3）。使用单因素方差分析和Holm-Sidak多重比较检验对数据进行分析;* P ≤ 0.05 和 ** P ≤ 0.005。（B） 96 孔板的 TRAP 染色孔的代表性图像，显示了 25 ng/mL RANK-L 下的典型 OC/井预期量及其形态，与第 7 天的 M-CSF 衍生巨噬细胞相比。比例尺：1000 μm。 （C） 从第 2 天到第 14 天通过 TRAP 染色 评估 50 ng/mL RANKL 下 OC 形成的代表性图像。从第 5 天开始可以看到 OC。10 天后出现巨型异常融合 OC。比例尺：200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> 图3：从CD14 + 单核细胞分化的吸收性OC。 从PBMC分离的CD14 + 细胞在矿物测定表面（骨测定）板上存在25ng / mL M-CSF （M）和RANKL （R）的情况下分化为OCs10天。（A）以10倍放大倍率拍摄的代表性重建井的图像，以分析第10天的吸收（灰色矿物基质;白色的吸收坑）。比例尺：1000 μm。 （B）再吸收面积百分比的量化。通过Wilcoxon配对分析对吸收数据。误差线显示平均值 SD ± （n = 7）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> 图 4：CD14−OSCAR+ OC 的流式细胞术富集。CD14+单核细胞从PBMC富集，并且如前所述对OCs进行分化。贴壁OC培养物用Accutase分离并染色以进行流式细胞术。（A-C）第8天的OC根据CD14和OSCAR表达进行分类。（一）具有代表性的分拣门控策略。将细胞门控为单体，死染色阴性，并对CD14 + OSCAR+（红色）和CD14 - OSCAR+（蓝色）亚群进行分选。（B）显示RANKL衍生的OC（青色）和对照M-CSF衍生的巨噬细胞（橙色）重叠OSCAR染色的代表性图。红色是RANKL衍生的OC的OSCAR同种型染色对照。（C）将分选的群体铺在塑料上，并在亲OC培养基（25 ng / mL M-CSF和50 ng / mL RANKL）中粘附2小时，然后进行TRAP染色和可视化。代表性图像显示CD14+亚群（红色）中缺乏TRAP+细胞，CD14−亚群中缺乏单核和多核TRAP +前OCs和OCs（蓝色）。比例尺：200 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> 图5：评估成熟口服避孕药功能的测定。 为了评估成熟口服避孕药的功能，从PBMC中分离的CD14+ 细胞单独用M-CSF（M）或与RANKL（R）联合培养7天，通过流式细胞术 富 集OCs，然后用抑制剂鱼藤酮处理OCs24小时。 （A）成熟口服避孕药 通过 流式细胞术（CD14−OSCAR+），并在存在或不存在鱼藤酮的情况下在矿物测定表面上培养3天，然后将细胞漂白并以10x成像以显示再吸收区域（白色的吸收坑）。（A）具有代表性的重建井图像。比例尺：1000 μm。 （B）再吸收面积百分比的量化。（B）中的数据用单因素方差分析与邓恩多重比较检验（n = 7）进行分析;* P ≤ 0.05 和** P ≤ 0.01。误差线显示SD±平均值。 （C）用RANKL分化的未分化和第7天分化的成熟OC的总细胞内ATP含量，并用载体或鱼藤酮（10nM和30nM）处理。在这里，使用2DG和寡霉素作为测定的阳性对照，并在细胞裂解和ATP定量前30分钟加入。误差线显示 SD ±平均值 （n = 4）。使用单因素方差分析和邓内特多重比较检验对配对数据进行分析。** P ≤ 0.01。 （D）针对肌动蛋白环形成（红色）和细胞核（蓝色）染色的成熟OC的代表性20倍图像，显示肌动蛋白环与抑制剂的丢失。比例尺：100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>板格式</td>
			<td>96孔板</td>
			<td>48孔板</td>
			<td>24孔板</td>
			<td>12孔板</td>
			<td>6孔板</td>
		</tr><tr><td>卷</td>
			<td>100 微升</td>
			<td>225–250 μL</td>
			<td>450–500 μL</td>
			<td>0.8–1 毫升</td>
			<td>1.8–2 毫升</td>
		</tr></tbody></table>表1：不同板格式的细胞悬液体积。 体积从 1 x 106 个细胞/mL 溶液开始计算，并为细胞间融合提供最佳密度。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>荧光基团，克隆</td>
			<td>每 10个 6 个细胞的体积 （μL）</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/花青7， HCD14</td>
			<td>5 微升</td>
		</tr><tr><td>奥斯卡</td>
			<td>FITC， REA494</td>
			<td>10 微升</td>
		</tr><tr><td>细胞分选缓冲液</td>
			<td></td>
			<td>80 微升</td>
		</tr></tbody></table>表2：抗体预混液。 
补充图1：RANKL剂量反应的TRAP染色。 将CD14 + 单核细胞磁性富集，以1 x 105 个细胞/孔接种在96孔板中，并用25ng / mL M-CSF孵育过夜，如图 2所示。TRAP 染色的代表性图像显示 MCSF 引发的单核细胞受到 RANKL 浓度增加（1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL 和 100 ng/mL）刺激，在第 7 天固定并染色以进行 TRAP。比例尺：400 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击这里下载此文件。</a>
补充图2：全分化OC中的作用环染色。 （A）在TC塑料上分化的OC的10倍放大倍数，并用AF647鬼笔环肽（红色）染色。比例尺：400 μm。 （B） 在玻璃室载玻片上分化的 OC 的 40 倍放大倍率，并用 AF488 鬼笔环肽（黄色）染色。比例尺：100μm.细胞核用DAPI染色，在（A）中以蓝色显示，在（B）中以青色显示。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充图3：不同FBS批次对OC分化效率的影响。 在25 ng / mL M-CSF和50 ng / mL RANKL （MR）存在下，将OCs与CD14 + 单核细胞分化7天。对照孔只有M-CSF（M）。（A）代表性的10倍放大倍率（比例尺：400μm）和（B）定量从两个不同批次的FBS中从一个供体分化的TRAP染色OC。误差线显示三个技术重复的平均±SD。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

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Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

破骨细胞是体内关键的骨吸收细胞。该协议描述了一种从人外周血单核细胞体 外 分化的破骨细胞的可靠方法。该方法可作为进一步了解体内平衡和疾病中破骨细胞生物学的重要工具。

功能性破骨细胞与人外周血CD14+ 单核细胞的鉴别

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0.我们的协议描述了一种优化且可重复的体外生成破骨细胞的方法，可用于研究其分化过程和功能背后的机制。该技术的主要优点是能够在短短一周内产生大量功能活跃的破骨细胞。通过使用纯化的单核细胞并按时添加细胞因子来实现高分化产量。破骨细胞负责所有形式的关节炎的骨破坏，这种方法提供了筛选可以调节其分化和/或功能的新型治疗化合物的工具。演示该程序的将是来自我们实验室的博士生Patricia Riedlova。首先，通过将血液转移到新的50毫升管中来分离PBMC。用等体积的无菌PBS稀释新鲜血液，或白细胞锥细胞和白细胞沉棕黄层的1：3比例稀释。通过倒置轻轻混合血液。准备含有三毫升密度梯度培养基的15毫升试管，并在密度梯度培养基的顶部缓慢地将8至10毫升稀释的血液分层，避免混合。将试管在室温下以400 x g 离心30分钟，无需制动。然后用巴斯德移液管小心地丢弃顶层。收集含有PBMC的下层间层，并将该层转移到新的50毫升管中。用无菌PBS悬浮细胞至50毫升，并通过在室温下以300×g离心10分钟并完全制动来洗去残留的密度梯度培养基。为了去除残留的血小板，重复手稿中所述的离心过程，将分离和纯化的PBMC重悬于20毫升PBS中，并按照标准方法使用血细胞计数器计数。为了富集CD14 +单核细胞，将1 x 10转移到第七个PBMC中，放入合适的聚苯乙烯圆底管中，并以300 x g 沉淀细胞五分钟。弃去上清液并将细胞沉淀重悬于细胞分离缓冲液中后，盖上盖子，每 100 微升用 10 微升抗体混合物孵育细胞 10 分钟。在孵育结束时，每100微升加入10微升磁性纳米颗粒珠，并盖上盖子孵育三分钟。用细胞分离缓冲液将体积加满至2.5毫升。将试管放入磁铁中，盖上盖子孵育三分钟。现在，当管仍在磁铁中时，通过反转连续移动丢弃阴细胞群。从磁铁上取下试管，通过将附着在磁珠上的富集CD14 +单核细胞重悬于2.5毫升细胞悬浮缓冲液中来洗涤它们，然后将管放回磁铁中。如前所述，对分离的细胞进行计数。将收集的细胞以300 x g 离心五分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于含有10%FBS的完全α最小必需培养基中，每毫升100万个细胞。为了区分破骨细胞，将终浓度为每毫升25纳克的M-CSF添加到细胞悬液中，并通过彻底移液混合以使细胞悬液匀浆。将每孔100微升悬浮液板放在平底96孔板中。接下来，在铺板细胞周围每孔添加200微升无菌蒸馏水，以防止培养基蒸发和培养系统中的边缘效应。将细胞在 37% 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育约 18 至 20 小时。准备补充有M-CSF和RANK配体的新鲜培养基。孵育后，使用P200移液管通过抽吸小心地除去一半的培养基，并用补充有M-CSF和RANK配体的新鲜，温暖的完全培养基代替，终浓度为每毫升25纳克。将细胞分化为破骨细胞7至14天，每三天完全更换一次培养基。除去培养基后，用每孔100微升制备的固定溶液固定分化的贴壁破骨细胞，并孵育一分钟。不要触摸孔的底部，以免划伤贴壁细胞。用300微升无菌蒸馏水洗涤孔三次后，将板敲干，并向每个孔中加入100微升新鲜制备的染色溶液。将板在 37 摄氏度的黑暗中孵育 20 分钟。孵育后，倒置除去染色溶液，并用每孔300微升蒸馏水洗涤板三次。通过在纸巾上敲击盘子来去除多余的水，并将盘子打开并避光至风干过夜。使用带有平铺选项的明场显微镜，以10倍或20倍拍摄图像以捕获整个孔表面。使用带有细胞计数器插件的图像分析软件手动计数被鉴定为具有三个以上细胞核的 TRAP+紫色染色细胞的破骨细胞。将每孔100微升分离的CD14 +单核细胞以1 x 10的细胞密度接种到每孔第五个细胞中。如前所述，在存在M-CSF和RANK配体的情况下区分破骨细胞，每三天完全更换培养基。在结束时间点，轻轻取出培养基，并用pH 7.4的200微升预热PBS洗涤每个孔两次。不要让井在步骤之间干涸。用每孔 100 微升 4% 甲醛溶液在 PBS 中固定样品，并在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动孵育 10 分钟。孵育后，用每孔200微升的PBS洗涤细胞两次。用在PBS中稀释的每孔100微升0.1%Triton x-100溶液透化细胞，并如前所述孵育10分钟。用每孔200微升的PBS洗涤两次。为了阻断非特异性结合并增加信号，加入100微升由2%牛血清白蛋白和PBS溶液制成的封闭溶液。在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动孵育20分钟。除去封闭溶液后，向每个孔中加入100微升荧光共轭鬼笔环肽溶液，该溶液在2%BSA / PBS溶液中稀释。用每孔200微升的PBS洗涤两次。用每孔 100 微升含有 300 纳摩尔 DAPI 的 PBS 溶液染色细胞核。10 到 15 分钟后，取出 DAPI 溶液并用每孔 100 微升的 PBS 代替。使用适当的免疫荧光或共聚焦显微镜在 4 到 40 倍处可视化染色。成熟的破骨细胞被定义为TRAP+多个有核细胞。RANK配体的添加以剂量依赖性方式产生越来越多的大型TRAP+多核破骨细胞。在2至14天的培养期内研究了单核细胞破骨细胞分化的动力学。从第五天开始可见多核破骨细胞，并在第七天达到最佳分化。破骨细胞在矿化表面上的分化允许通过分析圆孔或吸收坑的形成来评估其吸收活性。与单独的M-CSF相比，存在M-CSF和RANK配体时，吸收百分比显着增加。此外，与未处理的对照井相比，用鱼藤酮剂量依赖性地处理抑制了矿化表面的再吸收。破骨细胞吸收的鱼藤酮依赖性抑制与ATP产生的抑制有关。在鱼藤酮存在下观察到成熟OCS的RANK配体衍生肌动蛋白环的碎裂。重要的是要确保富集的单核细胞不含血小板，细胞以正确的密度接种，并且周围的孔充满水以避免边缘效应。该协议对于机械地询问破骨细胞如何形成以及影响它们在基础和转化科学中的功能特别有用。例如，通过使用可以调节这些过程的化合物或蛋白质。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

人外周血NK细胞的扩展，纯化和功能评估

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

科研

免疫与感染

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

扩展人外周血γδT细胞使用Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

定量成像小样本人体血液中单核细胞和树突状细胞系特定的Toll样受体介导的信号

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

与碘酸雪夫染色检测糖原的外周血单个核细胞

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

从外周血人类同种异体抗原特异性T细胞的生成

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

的分离，分化和人类的定量分泌抗体的B细胞从血液：酶联免疫斑点作为体液免疫的功能读出

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

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葡聚糖增强小鼠和人原发性 NK 细胞的慢转导效率

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人脐血巨分化与血小板形成的 CD34+单元格

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

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人外周血和淋巴组织中原发性 T 细胞突触界面的评价

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

原人类单核细胞的隔离、转染和文化

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...