Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Forfatterne anerkender taknemmeligt Flow Core Facility og Glasgow Imaging Facility (GIF) inden for School of Infection and Immunity for deres støtte og hjælp i dette arbejde.

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Den lette dyrkning og isolering af et stort antal funktionelle OC'er in vitro er vigtig for at fremme forståelsen af knoglebiologi og OC-medierede sygdomme. Klassisk blev OC'er genereret i co-kulturer med osteoblaster eller stromale celler og hæmatopoietiske celler fra milten eller knoglemarven38,39. Et signifikant gennembrud i forståelsen af osteoklastogenese var identifikationen af RANKL som den vigtigste regulator af OC-dannelse, differentiering og overlevelse40. Tidlige protokoller af RANKL-afhængige kultursystemer brugte PBMC'er til OC-generation21,41,42. Disse blandede kulturer er imidlertid langvarige og præsenterer mange forvirrende faktorer, der begrænser evnen til at teste de direkte virkninger på OC-differentiering og funktion. Denne protokol beskriver en effektiv og pålidelig in vitro-model af osteoklastogenese fra humane perifere CD14+ monocytter, hvor optimal osteoklastonogenese kan opnås inden for 7 dage (figur 1 og figur 2), hvilket er betydeligt hurtigere sammenlignet med nogle andre protokoller43,44,45,46. De vigtigste kendetegn ved denne protokol er (1) brugen af oprensede CD14+ monocytter, (2) priming af monocytterne med M-CSF før eksponering for RANKL, (3) kulturens længde (<7 dage) og (4) pålidelig påvisning af hæmning af OC-dannelse (TRAP-farvning) og funktion (resorption, ATP-produktion, reorganisering af aktinring) med inhibitorer. 
Under optimeringen af metoden blev der identificeret flere kritiske punkter. Det er blevet observeret, at in vitro-differentieringen af OC'er i høj grad afhænger af såtætheden af CD14+ monocytterne. I denne protokol podes cellerne således med en høj densitet (1 x 105 celler / brønd af en 96-brøndplade i 100 μL medium), da det er vigtigt for cellerne at kunne interagere med hinanden og være i nærheden af at smelte sammen og blive modne OC'er. På samme måde begrænser såning af celler med en tæthed, der er for høj, deres differentiering og vækst på grund af mediebegrænsninger og mangel på den krævede plads. For at opnå maksimal succes med denne protokol er det desuden vigtigt at udføre densitetsgradientadskillelsen omhyggeligt og sikre, at den berigede population af CD14+ celler er så ren som muligt. For eksempel resulterer utilstrækkelige vasketrin i manglende fjernelse af blodplader, hvilket følgelig hæmmer OC-differentiering47,48. Tilsvarende kan tilstedeværelsen af mindre T-cellekontaminering i isolerede CD14+ præparater stimuleret med M-CSF alene resultere i OC-differentiering, potentielt via RANKL-sekretion af T-celler49. Derfor er det vigtigt at inkludere en M-CSF-kontrol for hvert eksperiment. En rutinemæssig renhedskontrol, især når du bruger et nyt isolationssæt, anbefales også for at sikre prøvens renhed.
Optimale OC-tal (interval: ~ 200-1.600 OC'er / brønd) opnås ved hjælp af α-MEM-medium beriget med nukleosider og L-glutamin. Andre konventionelle kulturmedier, herunder Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, påvirker OC-udbyttet. Kilden til FBS kan også påvirke osteoklastogenese. Forskellige batcher af FBS kan føre til reduceret RANK-L-afledt osteoklastogenese samt forekomsten af et lavt antal TRAP+ multinucleated celler i M-CSF-kontrollerne (supplerende figur 3). For at opnå konsistente resultater anbefales det derfor at teste nye FBS-batcher før brug og fortsætte med den samme batch gennem hele forsøgene for at minimere variationer i differentieringsprocessen. Derudover udgør donor-til-donor-variabilitet med hensyn til det samlede antal differentierede OC'er, der er opnået på sluttidspunktet, en begrænsning, når denne protokol bruges til at sammenligne f.eks. raske donorer med patienter. I disse tilfælde er det bydende nødvendigt at bruge nøjagtigt de samme betingelser og det samme parti medium, FBS og andre reagenser.
Et andet nødvendigt skridt for optimal OC-differentiering og modning er priming af monocytterne med M-CSF før RANKL-tilsætningen. Eksponeringen af cellerne for M-CSF 18-24 timer før RANKL primer monocytterne for at opregulere RANK-ekspression15,26. Tilføjelsen af RANKL på dette tidspunkt sikrer optimal OC-differentiering på en dosisafhængig måde. Graden af OC-differentiering varierer fra donor til donor; 25 ng/ml RANKL er dog normalt tilstrækkeligt til at differentiere et stort antal OC'er hos de fleste donorer. Derudover kan 25 ng / ml RANKL anvendes i assays til indledende screening af forbindelser, da det letter evalueringen af både de forstærkende og hæmmende virkninger af testforbindelserne. Andre dyrkningssystemer har brugt længere M-CSF præinkubationstider før RANKL-tilsætning, men dette resulterer i en længere dyrkningstid for osteoklastogenese50. Derudover forlader de primede monocytter at inkubere natten over, at de fastgøres til pladen, omend ikke i en fuldt klæbende tilstand. Derfor, når RANKL introduceres for første gang, skal mediet ændres halvt meget omhyggeligt snarere end fuldstændigt ændret for at forhindre løsrivelse og tab af de primede monocytter. Mediet skal også opdateres hver 3-4 dage for at undgå medium udtømning og forhindre celledød. På grund af det lave volumen, der anvendes i dette assay (100 μL/brønd i en 96-brøndsplade), er det desuden yderst vigtigt at have en ramme af tomme brønde, der er fyldt med en vandig opløsning (dvs. sterilt destilleret H2O eller PBS) omkring analysehullerne. Dette forhindrer medium fordampning og kanteffekter.
Endelig er det for metaboliske assays (f.eks. ATP-assays) afgørende, at cellerne er levedygtige for at undgå enorm standardafvigelse mellem replikater (figur 5). Cellernes høje levedygtighed er også vigtig for sortering af cellerne og for den videre dyrkning af de sorterede OC'er (figur 4). Denne metode har dog flere begrænsninger. Fuldt modne OC'er er meget klæbende og vanskelige at løsne fra pladerne. De større OC'er er ofte umulige at løsne, hvilket kan føre til et lavere celleudbytte. Derfor skal cellerne tælles efter sortering og før plettering ved den krævede koncentration. Desuden anvendes i denne protokol en ikke-enzymatisk metode (accutase) til at løsne OC'erne for at forhindre membranændringer i nedstrøms overfladefarvning til flowcytometri. Brugen af celleskrabere (begge med bløde eller hårde ender) blev også testet og førte til høj celledød. Enzymatisk løsrivelse ved hjælp af 0,05% Trypsin / EDTA-opløsninger kan anvendes til et højere udbytte af løsrevne OC'er, når membranintegritet ikke er påkrævet til downstream-applikationer. For at forhindre, at OC'erne klumper sammen, anbefales det desuden stærkt at anvende en høj koncentration af EDTA i alle buffere efter celleløsrivelse samt passende filtrering inden flowcytometriopkøb. Det er vigtigt at bemærke, at OC-kulturer er en heterogen population af celler, der består af modne OC'er, OC-forløbere og makrofager. Makrofager kan let skelnes fra OC'er, selvom både mononukleare præ-OC'er og multinukleare OC'er udtrykker OSCAR og ikke kan skelnes med den nuværende metode (figur 4). Faktisk udgør sidstnævnte spørgsmål den største begrænsning af denne metode. Derudover er et lavt udtryk for OSCAR også til stede i M-CSF-kulturer (figur 4B) og kan indikere makrofager, der er primet til OC-afstamningsforpligtelse. Det er vigtigt at indstille porten til OSCAR+ -celler baseret på FMO-farvningssignalet, som vist i figur 4B.
Sammenfattende beskriver denne protokol en optimeret og robust metode til effektiv produktion af aktive og funktionelt modne OC'er fra cirkulerende primære humane monocytter. Styrken ved denne protokol er dens evne til at generere OC'er på kort tid og give et stort antal differentierede OC'er. Denne metode åbner vejen for at undersøge de grundlæggende mekanismer, der ligger til grund for OC-differentiering og funktion.

Osteoklaster (OC'er) er multinucleated gigantiske celler af hæmatopoietisk afstamning med en unik evne til at resorbere knogle. De er ansvarlige for udvikling og kontinuerlig ombygning af skelettet 1,2. I skeletfaserne af udvikling er OC'er og vævsresidente makrofager afledt af erythro-myeloide forfædre og koloniserer knoglenichen og organvævet. Under fysiologiske forhold kræves erythro-myeloide forfædre til normal knogleudvikling og tandudbrud, mens tilstrømningen af cirkulerende blodmonocytter ind i knoglenichen giver postnatal vedligeholdelse af OC'erne, knoglemasse og knoglemarvshulrum3. Under patologiske tilstande rekrutteres monocytter til steder med aktiv inflammation og kan bidrage til patologisk knogledestruktion 4,5.
Patienter med flere former for gigt oplever ledbetændelse, hvilket fører til progressiv fælles ødelæggelse forårsaget af OC'er6. For eksempel i reumatoid arthritis (RA) er overaktiverede OC'er ansvarlige for patologisk knogleerosion og ledødelæggelse 7,8, og nuværende behandlinger forbedrer eller stopper ofte ikke knogleskaden9,10,11. Ændringer i cirkulerende monocytter både med hensyn til populationsfordeling og transkriptomiske og epigenetiske signaturer er blevet rapporteret hos RA-patienter12,13,14. Desuden er det blevet rapporteret, at ændrede monocytresponser på inflammatorisk stimulering påvirker osteoklastogenese hos RA-patienter med aktiv sygdom15,16,17.
Differentieringen af OC'er er en kompleks flertrinsproces, der omfatter forpligtelsen af myeloide forløberceller til differentiering i OC-prækursorer. Under osteoklastogenese bliver OC'er gigantiske og multinucleated gennem cellecellefusion, ufuldstændig cytokinese og en nuklear genanvendelsesproces beskrevet som fission og fusion18,19,20. Evnen til at differentiere OC'er in vitro har muliggjort betydelige fremskridt i forståelsen af knoglebiologi21. OC'er adskiller sig fra forstadier ved eksponering for makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og receptoraktivator af nuklear faktor kappa-B-ligand (RANKL). Sidstnævnte er afgørende for den normale udvikling og funktion af OC'er in vitro og in vivo, selv under inflammatoriske tilstande 6,22,23. RANKL præsenteres af osteoblaster og osteocytter såvel som af aktiverede T-celler og fibroblaster i det betændte RA-synovium 2,24,25. Under OC-differentieringsprocessen opregulerer monocytter udsat for M-CSF receptoraktivator af nuklear faktor kappa-B (RANK) ekspression på deres cellemembran og differentieres under efterfølgende stimulering med RANKL til tartratresistente syrephosphatase (TRAP)-positive mononukleære præ-OC'er og derefter til multinucleated OC'er15,26. OC'er producerer flere enzymer, hvoraf den vigtigste er TRAP, som muliggør nedbrydning af phosphoproteiner i knogle27. En regulator og markør for OC-differentiering er den OC-associerede receptor (OSCAR). Det opreguleres tidligt i forløberceller, der forpligter sig til OC-slægten28. Modne gigantiske multinucleated OC'er kan nedbryde (resorbere) skeletmatrixen ved at generere en stor tætningszone, som er lavet af en actinring, der omgiver en flæsekant21,29,30. OC'ernes knogleresorptionsevne kræver cytoskeletomorganisering og den deraf følgende polarisering og dannelse af en indviklet membran, som er den såkaldte ruffled border. Den flæsede kant er omgivet af et stort cirkulært bånd af en F-actinrig struktur, som er actinringen eller forseglingszonen. Actinringintegritet er afgørende for, at OC'er kan resorbere knogle både in vitro og in vivo, og defekt ruffled grænsedannelse er forbundet med lavere vakuolær adenosintrifosfatase (V-ATPase) ekspression31,32,33. Desuden er OC'er mitokondrierrige celler, og adenosintrifosfat (ATP) associerer med mitokondrielignende strukturer i OC'er lokaliseret ved den ruffled grænse31,32,33. Rotenon virker som en stærk hæmmer af mitokondriekomplekset I og påvirker ATP-produktionen. Rotenon har også vist sig at hæmme OC-differentiering og funktion34.
Denne protokol beskriver en effektiv og optimeret metode til in vitro osteoklastogenese fra humane perifere blodprøver. I humant perifert blod er CD14 + monocytter den vigtigste kilde til OC'er15,35,36. I denne protokol er eksponeringskinetikken og koncentrationerne af M-CSF og RANKL blevet justeret for optimal osteoklastogenese. Mononukleære celler adskilles først fra erytrocytterne og granulocytterne, der er til stede i fuldblod ved densitetsgradient; de beriges derefter til CD14+ monocytter ved hjælp af positiv selektion af magnetiske perler. De isolerede CD14+ monocytter inkuberes derefter natten over med M-CSF. Dette primer monocytterne for at opregulere ekspressionen af RANK15,26. Den efterfølgende tilsætning af RANKL inducerer osteoklastogenese og multinucleation på en tidsafhængig måde. Aktiv-resorberende OC'er viser den karakteristiske fordeling af F-actinringe ved kanten af cellemembranen30,32 og farvning for TRAP. Modne OC'er analyseres ved at kvantificere TRAP+ multinucleated (mere end tre kerner) celler. Den funktionelle kapacitet hos modne OC'er kan vurderes ud fra deres resorption, aktinringintegritet og ATP-produktion. Desuden kan differentierede CD14-OSCAR + OC'er beriges og bruges til at vurdere virkningerne af visse forbindelser på OC-funktionalitet via mineral (eller dentin) resorption og F-actinorganisation. Derudover anvendes en kendt OC-hæmmer, rotenon, i dette arbejde som et eksempel på en forbindelse, der påvirker funktionaliteten af OC'er. Reduceret OC-resorptionsaktivitet under rotenon er forbundet med reduceret ATP-produktion og aktinringfragmentering. Afslutningsvis etablerer denne protokol et robust assay, der kan bruges som referencemetode til at studere flere biologiske aspekter af OC-differentiering og funktion in vitro. 
Denne metode kan bruges til at vurdere (1) potentialet for cirkulerende monocytter til at differentiere sig til OC'er i sundhed og sygdomme samt (2) virkningen af terapeutiske kandidater på OC-differentiering og funktion. Denne robuste osteoklastogeneseprotokol muliggør bestemmelse af effektiviteten og mekanismerne for knoglemålrettede terapier på både OC-differentiering fra forløberceller og funktionen af modne OC'er.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Osteoklaster (OC'er) er knogleresorberende celler, der spiller en afgørende rolle i skeletudvikling og voksen knoglemodellering. Flere knoglesygdomme skyldes øget differentiering og aktivering af OC'er, så hæmningen af denne patobiologi er et centralt terapeutisk princip. To nøglefaktorer driver differentieringen af OC'er fra myeloide forløbere: makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og receptoraktivator af nuklear faktor kappa-B-ligand (RANKL). Human cirkulerende CD14+ monocytter har længe været kendt for at differentiere sig til OC'er in vitro. Eksponeringstiden og koncentrationen af RANKL påvirker imidlertid differentieringseffektiviteten. Faktisk er protokoller for generering af humane OC'er in vitro blevet beskrevet, men de resulterer ofte i en dårlig og langvarig differentieringsproces. Heri leveres en robust og standardiseret protokol til generering af funktionelt aktive modne humane OC'er rettidigt. CD14+ monocytter er beriget fra humane mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) og primet med M-CSF for at opregulere RANK. Efterfølgende eksponering for RANKL genererer OC'er på en dosis- og tidsafhængig måde. OC'er identificeres og kvantificeres ved farvning med tartratsyreresistent fosfatase (TRAP) og lysmikroskopianalyse. Immunofluorescensfarvning af kerner og F-actin bruges til at identificere funktionelt aktive OC'er. Derudover beriges OSCAR + CD14-modne OC'er yderligere via flowcytometricellesortering og OC-funktionalitet kvantificeret ved mineralske (eller dentin/knogle) resorptionsassays og actinringdannelse. Endelig anvendes en kendt OC-hæmmer, rotenon, på modne OC'er, hvilket viser, at adenosintrifosfat (ATP) produktion er afgørende for actinringintegritet og OC-funktion. Afslutningsvis etableres et robust assay til differentiering af et stort antal OC'er i dette arbejde, som i kombination med actinringfarvning og et ATP-assay giver en nyttig in vitro-model til evaluering af OC-funktion og til screening for nye terapeutiske forbindelser, der kan modulere differentieringsprocessen.

OC-generering fra CD14+ monocytter Denne metode havde til formål let at skelne et stort antal OC'er fra humant perifert blod CD14+ monocytter in vitro, typisk i 1 uge. For det første blev CD14+ monocytter beriget fra PBMC'er og primet med M-CSF natten over for at opregulere RANK, som tidligere rapporteret15. Efter monocytpriming blev der anvendt RANKL-koncentrationer på 1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml og 100 ng/ml sammen med 25ng/mL M-CSF for at bestemme den optimale koncentration af RANKL til OC-differentiering og modning. Tilføjelsen af RANKL producerede et stigende antal store TRAP-positive multinucleated OC'er på en dosisafhængig måde, og dette blev vurderet ved hjælp af TRAP-farvning. Modne OC'er defineres som TRAP-positive celler med flere kerner (typisk mere end tre; Figur 2A, B og supplerende figur 1). Desuden blev kinetikken af OC-differentiering fra monocytter undersøgt ved hjælp af TRAP-farvning og lysmikroskopi over en 2-14 dages dyrkningsperiode. I dette tilfælde blev OC-differentiering ved hjælp af en mellemkoncentration på 50 ng/ml RANKL valgt til at vurdere, hvor hurtigt OC'er differentierede sig i kultur. Under disse dyrkningsforhold var multinucleated OC'er synlige fra dag 5 og fremefter, og optimal differentiering blev nået på dag 7 (figur 2C). Den langvarige inkubation af kulturer ud over 10 dage på plast resulterede i unormalt store smeltede celler. I denne protokol bruges dag 6-8 normalt som det optimale endepunkt for OC-generering. OC'erne kan kvantificeres eller anvendes til downstream-assays.
Funktionel vurdering af differentierede OC'er For at bestemme den funktionelle aktivitet af de genererede OC'er undersøgte vi deres resorptive aktivitet ved at differentiere OC'erne på en mineraliseret overflade. Da store OC'er kun genereres efter en 7-dages dyrkningsperiode og for at give tilstrækkelig tid til at resorbere mineralsubstratet, blev kulturerne opretholdt indtil dag 10. Dannelsen af runde huller eller resorptionsgruber blev kun observeret på de mineraliserede overflader af brønde indeholdende celler, der var blevet behandlet med både M-CSF og RANKL (figur 3). Således tillader procentdelen af opløst mineraliseret overflade (resorptionsgruber) bestemmelse af OC-resorptionskapaciteten. Derudover viste OC'erne, der differentierede sig efter denne protokol frem til dag 7, både på plast- og glaskammerdias, en velorganiseret aktinringstruktur, der kunne visualiseres ved immunofluorescerende farvning (supplerende figur 2).
Effekt af en hæmmer på moden OC-funktion De ovennævnte dyrkningsbetingelser blev anvendt til at bestemme den funktionelle evne af de in vitro genererede OC'er i nærvær af den kendte OC-hæmmer, rotenon34. OC'erne blev differentieret i 6-8 dage, og CD14-OSCAR + OC'er og OC-forstadier blev beriget via flowcytometri (figur 4). De berigede celler blev derefter belagt med 50.000 celler / pr. Brønd på en mineralbelagt 96-brøndplade i pro-osteoklastogent medium (25 ng / mL, M-CSF og RANKL) i 3 dage. Behandling med rotenon (figur 5A,B) hæmmede dosisafhængig resorptionen af den mineraliserede overflade sammenlignet med den ubehandlede kontrolbrønd, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser34. Derudover blev OC-funktionalitet vurderet via ATP-produktion og aktinringdannelse. Den rotenonafhængige hæmning af OC-resorption var forbundet med hæmningen af ATP-produktionen (figur 5C). Resorberende OC'er er stærkt polariserede celler, der regulerer deres resorptive kapacitet ved at fremme cytoskeletal organisation. Alexa fluor 647 konjugeret phalloidin blev brugt til at mærke F-actin cytoskelettet af de modne OC'er dyrket i nærvær eller fravær af rotenon. Rotenon forårsagede fragmenteringen af den RANKL-afledte actinring af de modne OC'er (figur 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> Figur 2: OC'er, der effektivt adskiller sig fra CD14+ monocytprækursorer. CD14+ monocytter blev magnetisk beriget, belagt med 1 x 105 celler/brønd i 96-brønds plader og inkuberet natten over med 25 ng/mL M-CSF. (A) M-CSF-primede monocytter blev stimuleret med stigende koncentrationer af RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml og 100 ng/ml), fikseret og farvet til TRAP på dag 7. Billeder blev erhvervet, og TRAP + multinucleated celler (MNC'er) blev talt. Repræsentative billeder af TRAP-farvning er vist i supplerende figur 1. Fejlbjælkerne viser middelværdien ± SD (n = 3). Dataene blev analyseret med en envejs ANOVA og Holm-Sidaks multiple sammenligningstest for parrede data; * P ≤ 0,05 og ** P ≤ 0,005. (B) Repræsentativt billede af en TRAP-farvet brønd med en 96-brønds plade, der viser den typiske mængde OC'er/forventet brønd og deres morfologi under 25 ng/ml RANK-L sammenlignet med M-CSF-afledte makrofager på dag 7. Skalastænger: 1000 μm. (C) Repræsentative billeder af OC-dannelse under 50 ng/ml RANKL vurderet via TRAP-farvning fra dag 2 til dag 14. OC'er er synlige fra dag 5 og fremefter. Kæmpe unormalt smeltede OC'er er til stede efter 10 dage. Skalastænger: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> Figur 3: Resorptive OC'er differentieret fra CD14+ monocytter. CD14+ celler isoleret fra PBMC'er blev differentieret i 10 dage til OC'er i nærvær af 25 ng/mL M-CSF (M) og RANKL (R) på mineralassayoverflade (osteo-assay) plader. (A) Billeder af repræsentative rekonstruerede brønde taget ved 10x forstørrelse for at analysere resorptionen på dag 10 (mineralsubstrat i gråt; resorptionsgruber i hvidt). Skalastænger: 1000 μm. (B) Kvantificering af procentdelen af det resorberede areal. Resorptionsdataene blev analyseret med en Wilcoxon-parret analyse. Fejlbjælkerne viser middelværdien ± SD (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> Figur 4: Flowcytometriberigelse af CD14-OSCAR + OC'er. CD14+ monocytter blev beriget fra PBMC'er, og OC'erne blev differentieret som tidligere beskrevet. Adhærente OC-kulturer blev løsrevet med accutase og farvet til flowcytometri. (A-C) OC'er på dag 8 blev sorteret baseret på CD14 og OSCAR-udtryk. (A) Repræsentativ sorteringsstrategi. Cellerne blev lukket som singlets, negative for død farvning, og CD14 + OSCAR + (rød) og CD14 - OSCAR + (blå) undergrupper blev sorteret. B) Repræsentative plots, der viser den overlappende OSCAR-farvning af RANKL-afledte OC'er (cyan) og kontrolmakrofager afledt af M-CSF (orange). I rødt er OSCAR isotype-farvet kontrol af RANKL-afledte OC'er. (C) De sorterede populationer blev belagt med plast og fik lov til at klæbe i 2 timer i pro-OC-medium (25 ng/mL M-CSF og 50 ng/ml RANKL), efterfulgt af TRAP-farvning og visualisering. De repræsentative billeder viser mangel på TRAP+-celler i CD14+-delmængden (rød) og mono- og multinucleated TRAP+-præ-OC'er og OC'er i CD14-delmængden (blå). Skalastænger: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> Figur 5: Assays til vurdering af funktionen af modne OC'er. For at evaluere funktionen af modne OC'er blev CD14+ celler isoleret fra PBMC'er dyrket enten med M-CSF (M) alene eller kombineret med RANKL (R) i 7 dage, OC'erne blev beriget via flowcytometri, og OC'erne blev derefter behandlet med inhibitoren rotenon i 24 timer. (A) Modne OC'er blev sorteret via flowcytometri (CD14-OSCAR +) og blev dyrket på en mineralsk analyseoverflade i nærvær eller fravær af rotenon i 3 dage, hvorefter cellerne blev bleget og afbildet ved 10x for at afsløre det resorberede område (resorptionsgruber i hvidt). (A) Repræsentative rekonstruerede billeder af brønde. Skalastænger: 1000 μm. (B) Kvantificering af procentdelen af det resorberede areal. Dataene i (B) blev analyseret med en envejs ANOVA med Dunns multiple sammenligningstest (n = 7); * P ≤ 0,05 og ** P ≤ 0,01. Fejlbjælkerne viser den gennemsnitlige ± SD. (C) Samlet intracellulært ATP-indhold af udifferentierede og dag 7 differentierede modne OC'er differentieret med RANKL og behandlet med enten vehikel eller rotenon (10 nM og 30 nM). Her blev 2DG og oligomycin anvendt som positive kontroller til analysen og blev tilsat 30 minutter før cellelyse og ATP-kvantificering. Fejlbjælkerne viser middelværdien ± SD (n = 4). Dataene blev analyseret med en envejs ANOVA og Dunnetts multiple sammenligningstest for parrede data. ** P ≤ 0,01. (D) Et repræsentativt 20x billede af modne OC'er farvet til actinringdannelse (rød) og kerner (blå), der viser tabet af actinringen med inhibitoren. Skalastænger: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plade format</td>
			<td>96 brøndplade</td>
			<td>48 brøndplade</td>
			<td>24 brøndplade</td>
			<td>12 brøndplade</td>
			<td>6 brøndplade</td>
		</tr><tr><td>lydstyrke</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225-250 μL</td>
			<td>450-500 μL</td>
			<td>0,8-1 ml</td>
			<td>1,8-2 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Volumen af cellesuspension for forskellige pladeformater. Volumenerne beregnes ud fra en 1 x 106 celler / ml opløsning og giver en optimal densitet for celle-celle fusion.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Fluorofor, klon</td>
			<td>Volumen (μL) pr. 106 celler</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/cyanin7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer til cellesortering</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Antistof master mix opløsning. 
Supplerende figur 1: TRAP-farvning af RANKL-dosisresponsen. CD14+ monocytter blev magnetisk beriget, belagt med 1 x 105 celler/brønd i 96-brøndsplader og inkuberet natten over med 25 ng/mL M-CSF, som i figur 2. Repræsentative billeder af TRAP-farvning viser MCSF-primede monocytter stimuleret med stigende koncentrationer af RANKL (1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml og 100 ng / ml), fastgjort og farvet til TRAP på dag 7. Skalabjælker: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 2: Virkende ringfarvning i fuldt differentierede OC'er. (A) En 10x forstørrelse af OC'er differentieret på TC-plast og farvet med AF647 phalloidin (i rødt). Skalabjælke: 400 μm. (B) En 40x forstørrelse af OC'er differentieret på glaskammerglas og farvet med AF488 phalloidin (i gul). Skalabjælke: 100 μm.Kernerne farves med DAPI, vist med blåt i (A) og i cyan i (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende figur 3: Forskellige FBS-batchers indvirkning på OC-differentieringseffektiviteten. OC'er blev differentieret fra CD14+ monocytter i nærvær af 25 ng/mL M-CSF og 50 ng/mL RANKL (MR) i 7 dage. Kontrolbrøndene havde kun M-CSF (M). (A) Repræsentative 10x forstørrelser (skalastænger: 400 μm) og (B) kvantificering af TRAP-farvede OC'er differentieret fra en donor i to forskellige batcher af FBS. Fejlbjælkerne viser den gennemsnitlige SD ± tre tekniske replikater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoklaster er vigtige knogleresorberende celler i kroppen. Denne protokol beskriver en pålidelig metode til in vitro-differentiering af osteoklaster fra humane perifere blodmonocytter. Denne metode kan bruges som et vigtigt redskab til yderligere at forstå osteoklastbiologi i homeostase og i sygdomme.

Differentiering af funktionelle osteoklaster fra humant perifert blod CD14+ monocytter

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0.Vores protokol beskriver en optimeret og reproducerbar metode til generering af osteoklast in vitro, der kan bruges til at undersøge mekanismerne bag deres differentieringsproces og funktionalitet. Den største fordel ved denne teknik er evnen til at generere et stort antal funktionelt aktive osteoklaster inden for kun en uge. Højt differentieringsudbytte opnås ved at anvende rensede monocytter og tilføje cytokiner til tiden.Osteoklaster er ansvarlige for knogleødelæggelse i alle former for gigt, og denne metode giver værktøjerne til at screene nye terapeutiske forbindelser, der kan modulere deres differentiering og / eller funktioner. Patricia Riedlova, ph.d.-studerende fra vores laboratorium, demonstrerer proceduren. Til at begynde med skal du isolere PBMC'erne ved at overføre blodet til et nyt 50 milliliter rør.Fortynd det med sterilt PBS i et lige stort volumen for frisk blod eller et forhold på 1: 3 for leukocytkegler og buffy coats. Bland forsigtigt blodet ved inversion. Forbered 15 ml rør indeholdende tre ml densitetsgradientmedium, og lag langsomt otte til 10 ml fortyndet blod på toppen af densitetsgradientmediet, undgå blanding.Centrifuger røret ved 400 x g i 30 minutter ved stuetemperatur uden bremse. Kassér derefter forsigtigt det øverste lag med en Pasteur-pipette. Saml det underliggende interfaselag, der indeholder PBMC'erne, og overfør dette lag til et nyt 50 milliliter rør.Suspender cellerne op til 50 ml med steril PBS, og vask restdensitetsgradientmediet af ved centrifugering ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur med fuld bremse. For at fjerne resterende blodplader gentages centrifugeringsprocessen som beskrevet i manuskriptet, de isolerede og rensede PBMC'er resuspenderes i 20 ml PBS og tælles ved hjælp af et hæmacytometer efter standardmetoden. For at berige CD14 + monocytter overføres 1 x 10 til de syvende PBMC'er i et passende polystyren rundbundet rør og pellet cellerne ved 300 x g i fem minutter.Efter at supernatanten er kasseret, og cellepelletten er resuspenderet i celleseparationsbufferen, inkuberes cellerne med 10 mikroliter antistofcocktail pr. 100 mikroliter med låg på i 10 minutter. Ved afslutningen af inkubationen tilsættes 10 mikroliter magnetiske nanopartikelperler pr. 100 mikroliter og inkuberes i tre minutter med låget på. Fyld lydstyrken op til 2,5 ml med celleseparationsbufferen.Anbring røret i en magnet, og inkuber i tre minutter med låget slukket. Kassér nu den negative cellepopulation med en kontinuerlig bevægelse ved inversion, mens røret stadig er i magneten. Fjern røret fra magneten, vask de berigede CD14 + monocytter, der er fastgjort til magnetperlerne, ved at resuspendere dem i 2,5 ml af cellesuspensionsbufferen, og læg røret tilbage i magneten.Tæl de isolerede celler som vist tidligere. De opsamlede celler centrifugeres ved 300 x g i fem minutter. Efter at supernatanten er kasseret, resuspenderes cellerne ved 1 mio. celler pr. milliliter i komplet alfa-minimum essentielt medium med 10 % FBS.For at differentiere osteoklasten tilsættes M-CSF i en endelig koncentration på 25 nanogram pr. milliliter til cellesuspensionen og blandes ved pipettering grundigt for at homogenisere cellesuspensionen. Plade 100 mikroliter af suspension-per-brønd i en fladbundet 96-brøndplade. Derefter tilsættes 200 mikroliter sterilt destilleret vand pr. brønd omkring de belagte celler for at forhindre medium fordampning og kanteffekter i dyrkningssystemet.Inkuber cellerne natten over i ca. 18 til 20 timer ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Forbered friske medier suppleret med M-CSF og RANK ligand. Efter inkubationen fjernes forsigtigt halvdelen af mediet ved aspiration ved hjælp af en P200-pipette og erstattes med frisk, varm komplet medium suppleret med M-CSF og RANK-ligand i en slutkoncentration på 25 nanogram pr. milliliter.Differentier cellerne i osteoklaster i syv til 14 dage med en komplet udskiftning af medium hver tredje dag. Efter fjernelse af mediet fastgøres de differentierede vedhængende osteoklaster med 100 mikroliter pr. Brønd af den fremstillede fikseringsopløsning og inkuberes i et minut. Rør ikke ved bunden af brøndene for at undgå at ridse de klæbende celler.Når brøndene er vasket tre gange med 300 mikroliter sterilt destilleret vand, skal du banke pladerne tørre og tilsæt 100 mikroliter frisklavet farvningsopløsning til hver brønd. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i mørke i 20 minutter. Efter inkubation fjernes farvningsopløsningen ved invertering og vaskes pladen tre gange med 300 mikroliter destilleret vand pr. Brønd.Fjern overskydende vand ved at banke pladerne på køkkenrulle, og lad pladerne være åbne og beskyttet mod lys til lufttørring natten over. Brug et brightfield-mikroskop med en fliseindstilling til at tage billeder på 10x eller 20x for at fange hele brøndoverfladen. Tæl manuelt osteoklaster identificeret som TRAP + lilla farvede celler med mere end tre kerner ved hjælp af en billedanalysesoftware med et celletæller-plugin.Plade 100 mikroliter af den isolerede CD14 + monocytter pr. Brønd i et 18-brønds kammerglas ved en celletæthed på 1 x 10 til den femte celle pr. Brønd. Differentier osteoklaster i nærvær af M-CSF og RANK ligand som vist tidligere med en fuldstændig ændring af medium hver tredje dag. Ved sluttidspunktet fjernes mediet forsigtigt og vaskes hver brønd to gange med 200 mikroliter forvarmet PBS ved pH 7,4.Lad ikke brøndene tørre mellem trinnene. Prøven fastgøres med 100 mikroliter 4% formaldehydopløsning pr. brønd i PBS, og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur på en orbitalryster med forsigtig omrystning. Efter inkubation vaskes cellerne to gange med 200 mikroliter PBS pr. Brønd.Permeabiliser cellerne med 100 mikroliter pr. Brønd 0,1% Triton x-100-opløsning fortyndet i PBS og inkuber i 10 minutter som vist tidligere. Vask to gange med 200 mikroliter-per-brønd PBS. For at blokere ikke-specifik binding og øge signalet tilsættes 100 mikroliter blokerende opløsning fremstillet med 2% bovin serumalbumin og PBS-opløsning.Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur på en orbital shaker med forsigtig omrystning. Efter fjernelse af blokeringsopløsningen tilsættes 100 mikroliter fluorescerende konjugeret phalloidinopløsning fortyndet i 2% BSA / PBS-opløsning til hvert hul. Vask to gange med 200 mikroliter-per-brønd PBS.Plet kernerne med 100 mikroliter pr. brønd af en opløsning af PBS indeholdende 300 nanomolær DAPI. Efter 10 til 15 minutter fjernes DAPI-opløsningen og erstattes med PBS med 100 mikroliter PBS pr. brønd. Visualiser farvningen ved hjælp af passende immunofluorescens eller konfokale mikroskoper ved fire til 40x.De modne osteoklaster er defineret som TRAP+multiple nukleatceller. Tilføjelsen af RANK-ligand producerede et stigende antal store TRAP+multinukleerede osteoklaster på en dosisafhængig måde. Kinetikken af osteoklastdifferentiering fra monocytter blev undersøgt over en to til 14-dages dyrkningsperiode.Multikernede osteoklaster var synlige fra dag fem og fremefter, og optimal differentiering blev nået på dag syv. Differentieringen af osteoklaster på mineraliserede overflader gør det muligt at vurdere deres resorptionsaktivitet ved at analysere dannelsen af runde huller eller resorptionsgruber. Resorptionsprocenten stiger signifikant i nærvær af M-CSF og RANK ligand sammenlignet med M-CSF alene.Endvidere hæmmede behandling med rotenondosisafhængig resorptionen af den mineraliserede overflade sammenlignet med den ubehandlede kontrolbrønd. Den rotenonafhængige hæmning af osteoklastresorption var forbundet med hæmningen af ATP-produktionen. Fragmenteringen af den RANK-ligandafledte actinring af den modne OCS blev observeret i nærvær af rotenon.Det er vigtigt at sikre, at de berigede monocytter ikke indeholder blodplader, at cellerne er belagt med den rigtige densitet, og at de omgivende brønde er fyldt med vand for at undgå kanteffekten. Denne protokol er særlig nyttig til mekanisk at forhøre, hvordan osteoklaster dannes, og hvad der påvirker deres funktionalitet både i grundlæggende og translationel videnskab. For eksempel ved at bruge forbindelser eller proteiner, der kan modulere disse processer.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Kvantitativ afbildning af Lineage-specifikke Toll-lignende receptor-medieret signalering i monocytter og dendritiske celler fra små prøver af humant blod

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation af human alloantigen-specifikke T-celler fra perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Den Isolering, differentiering, og Kvantificering af humant antistof-secernerende B-celler fra Blood: ELISpot som Funktionel Udlæsning af humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran effektiviserer Lentiviral transduktion af Murine og menneskelige primære NK-celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte differentiering og trombocyttal dannelse fra menneskelige ledning blod-afledte CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Vurdering af Synaptic grænsefladen af primære menneskelige T celler fra perifert blod og lymfoide væv

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Isolation, Transfection og kultur af primære humane monocytter

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...