Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

De auteurs erkennen dankbaar de Flow Core Facility en de Glasgow Imaging Facility (GIF) binnen de School of Infection and Immunity voor hun steun en hulp bij dit werk.

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

De eenvoudige kweek en isolatie van grote aantallen functionele OC's in vitro zijn belangrijk voor het bevorderen van het begrip van botbiologie en OC-gemedieerde ziekten. Klassiek werden OC's gegenereerd in co-culturen met osteoblasten of stromale cellen en hematopoëtische cellen uit de milt of het beenmerg38,39. Een belangrijke doorbraak in het begrip van osteoclastogenese was de identificatie van RANKL als de belangrijkste regulator van OC-vorming, differentiatie en overleving40. Vroege protocollen van RANKL-afhankelijke cultuursystemen gebruikten PBMC's voor OC-generatie21,41,42. Deze gemengde culturen zijn echter langdurig en vertonen veel verstorende factoren die het vermogen beperken om de directe effecten op oc-differentiatie en -functie te testen. Dit protocol beschrijft een efficiënt en betrouwbaar in vitro model van osteoclastogenese uit humane perifere CD14+ monocyten waarbij binnen 7 dagen optimale osteoclastogenese kan worden verkregen (figuur 1 en figuur 2), wat aanzienlijk sneller is in vergelijking met sommige andere protocollen43,44,45,46. De belangrijkste onderscheidende kenmerken van dit protocol zijn (1) het gebruik van gezuiverde CD14+ monocyten, (2) het primen van de monocyten met M-CSF voorafgaand aan blootstelling aan RANKL, (3) de lengte van de cultuur (<7 dagen), en (4) de betrouwbare detectie van de remming van OC-vorming (TRAP-kleuring) en functie (resorptie, ATP-productie, actineringreorganisatie) met remmers. 
Tijdens de optimalisatie van de methodologie werden verschillende kritische punten geïdentificeerd. Er is waargenomen dat de in vitro differentiatie van OC's grotendeels afhankelijk is van de zaaidichtheid van de CD14+ monocyten. In dit protocol worden de cellen dus gezaaid met een hoge dichtheid (1 x 105 cellen / put van een 96-well-plaat, in 100 μL medium), omdat het essentieel is voor de cellen om met elkaar te kunnen interageren en in de buurt te zijn om te fuseren en volwassen OC's te worden. Evenzo beperkt het zaaien van cellen met een te hoge dichtheid hun differentiatie en groei als gevolg van gemiddelde beperkingen en een gebrek aan de vereiste ruimte. Om maximaal succes te behalen met dit protocol, is het bovendien belangrijk om de dichtheidsgradiëntscheiding zorgvuldig uit te voeren en ervoor te zorgen dat de verrijkte populatie van CD14+ cellen zo zuiver mogelijk is. Ontoereikende wasstappen resulteren bijvoorbeeld in een gebrek aan verwijdering van bloedplaatjes, wat bijgevolg OC-differentiatie remt47,48. Evenzo kan de aanwezigheid van kleine T-celbesmetting in geïsoleerde CD14+ preparaten gestimuleerd met alleen M-CSF resulteren in OC-differentiatie, mogelijk via RANKL-secretie door T-cellen49. Daarom is het belangrijk om voor elk experiment een M-CSF-controle op te nemen. Een routinematige zuiverheidscontrole, vooral bij gebruik van een nieuwe isolatiekit, wordt ook aanbevolen om de zuiverheid van het monster te garanderen.
Optimale OC-getallen (bereik: ~200-1.600 OC's/put) worden bereikt met behulp van α-MEM-medium verrijkt met nucleosiden en L-glutamine. Andere conventionele cultuurmedia, waaronder Dulbecco's gemodificeerde adelaarmedium (DMEM) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, beïnvloeden de OC-opbrengst. De bron van FBS kan ook de osteoclastogenese beïnvloeden. Verschillende batches FBS kunnen leiden tot verminderde RANK-L-afgeleide osteoclastogenese, evenals het verschijnen van lage aantallen TRAP + multinucleaire cellen in de M-CSF-controles (aanvullende figuur 3). Om consistente resultaten te bereiken, wordt daarom geadviseerd om nieuwe FBS-batches voor gebruik te testen en door te gaan met dezelfde batch gedurende de experimenten om variaties in het differentiatieproces te minimaliseren. Bovendien vormt de variabiliteit van donor tot donor, in termen van het totale aantal gedifferentieerde OC's verkregen op het eindtijdpunt, een beperking bij het gebruik van dit protocol om bijvoorbeeld gezonde donoren met patiënten te vergelijken. In deze gevallen is het noodzakelijk om precies dezelfde omstandigheden en dezelfde partij medium, FBS en andere reagentia te gebruiken.
Een andere noodzakelijke stap voor optimale OC-differentiatie en rijping is het primen van de monocyten met M-CSF vóór de RANKL-toevoeging. De blootstelling van de cellen aan M-CSF 18-24 h voorafgaand aan RANKL primeert de monocyten om RANK-expressie15,26 te upreguleren. De toevoeging van RANKL op dit tijdstip zorgt voor een optimale OC-differentiatie op een dosisafhankelijke manier. De mate van OC-differentiatie varieert van donor tot donor; 25 ng/ml RANKL is echter meestal voldoende om een hoog aantal OC's bij de meeste donoren te onderscheiden. Bovendien kan 25 ng / ml RANKL worden gebruikt in testen voor de eerste screening van verbindingen, omdat het de evaluatie van zowel de versterkende als remmende effecten van de testverbindingen vergemakkelijkt. Andere kweeksystemen hebben langere M-CSF pre-incubatietijden gebruikt voorafgaand aan RANKL-toevoeging, maar dit resulteert in een langere kweektijd voor osteoclastogenese50. Door de geprimeerde monocyten 's nachts te laten incuberen, kunnen ze zich bovendien aan de plaat hechten, zij het niet in een volledig hechtende toestand. Daarom, wanneer RANKL voor de eerste keer wordt geïntroduceerd, moet het medium zeer zorgvuldig half worden veranderd in plaats van volledig te worden veranderd om het loslaten en verliezen van de geprimeerde monocyten te voorkomen. Het medium moet ook om de 3-4 dagen worden ververst om gemiddelde uitputting te voorkomen en celdood te voorkomen. Bovendien is het, vanwege het lage volume dat in deze test wordt gebruikt (100 μL / put in een plaat met 96 putten), van het grootste belang om een frame van lege putten te hebben die zijn gevuld met een waterige oplossing (d.w.z. steriel gedestilleerd H2O of PBS) rond de testputten. Dit voorkomt medium verdamping en randeffecten.
Ten slotte is het voor metabole assays (bijv. ATP-assays) noodzakelijk dat de cellen levensvatbaar zijn om enorme standaarddeviatie tussen replicaten te voorkomen (figuur 5). Een hoge levensvatbaarheid van de cellen is ook belangrijk voor het sorteren van de cellen en voor het verder kweken van de gesorteerde OC's (figuur 4). Deze methode heeft echter verschillende beperkingen. Volledig volwassen OC's zijn zeer hechtend en moeilijk los te maken van de platen. De grotere OC's zijn vaak niet los te maken, wat kan leiden tot een lagere celopbrengst. Daarom moeten de cellen worden geteld na het sorteren en voorafgaand aan het plateren in de vereiste concentratie. Bovendien wordt in dit protocol een niet-enzymatische methode (accutase) gebruikt om de OC's los te koppelen om membraanveranderingen in downstream oppervlaktekleuring voor flowcytometrie te voorkomen. Het gebruik van celschrapers (zowel met zachte als harde uiteinden) werd ook getest en leidde tot hoge celdood. Enzymatische loslating met behulp van 0,05% trypsine/EDTA-oplossingen kan worden gebruikt voor een hogere opbrengst van losgemaakte OC's wanneer membraanintegriteit niet vereist is voor downstream-toepassingen. Bovendien, om te voorkomen dat de OC's samenklonteren, wordt het gebruik van een hoge concentratie EDTA in alle buffers na celloslating, evenals de juiste filtering voorafgaand aan de acquisitie van flowcytometrie, ten zeerste aanbevolen. Het is belangrijk op te merken dat OC-culturen een heterogene populatie van cellen zijn die bestaat uit volwassen OC's, OC-voorlopers en macrofagen. Macrofagen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden van OC's, hoewel zowel mononucleaire pre-OC's als multinucleaire OC's OSCAR uitdrukken en niet kunnen worden onderscheiden met de huidige methode (figuur 4). Dit laatste punt vormt inderdaad de belangrijkste beperking van deze methode. Bovendien is een lage expressie van OSCAR ook aanwezig in M-CSF-culturen (figuur 4B) en kan dit wijzen op macrofagen die zijn voorbereid op OC-afstammingsverbintenis. Het is belangrijk om de poort voor OSCAR+ cellen in te stellen op basis van het FMO-kleuringssignaal, zoals weergegeven in figuur 4B.
Samenvattend beschrijft dit protocol een geoptimaliseerde en robuuste methode voor de efficiënte productie van actieve en functioneel volwassen OC's uit circulerende primaire menselijke monocyten. De kracht van dit protocol is het vermogen om OC's in een korte tijdsduur te genereren en hoge aantallen gedifferentieerde OC's op te leveren. Deze methode opent de weg voor het onderzoeken van de basismechanismen die ten grondslag liggen aan oc-differentiatie en -functie.

Osteoclasten (OC's) zijn multinucleaire reuzencellen van hematopoietische afstamming met een uniek vermogen om bot te resorberen. Zij zijn verantwoordelijk voor de ontwikkeling en continue verbouwing van het skelet 1,2. In de skeletfasen van ontwikkeling worden OC's en weefselresidente macrofagen afgeleid van erytro-myeloïde voorlopers en koloniseren ze de botniche en orgaanweefsels. In fysiologische omstandigheden zijn erytro-myeloïde voorlopers nodig voor normale botontwikkeling en tanduitbarsting, terwijl de instroom van circulerende bloedmonocyten in de botniche zorgt voor postnataal onderhoud van de OC's, botmassa en beenmergholte3. Onder pathologische omstandigheden worden monocyten gerekruteerd op plaatsen van actieve ontsteking en kunnen ze bijdragen aan pathologische botvernietiging 4,5.
Patiënten met verschillende vormen van artritis ervaren gewrichtsontsteking, wat leidt tot progressieve gewrichtsvernietiging veroorzaakt door OC's6. Bij reumatoïde artritis (RA) zijn bijvoorbeeld overactieve OC's verantwoordelijk voor pathologische boterosie en gewrichtsvernietiging 7,8, en de huidige behandelingen verbeteren of stoppen de botschade vaak niet9,10,11. Veranderingen in circulerende monocyten, zowel in termen van populatieverdeling als transcriptomische en epigenetische handtekeningen, zijn gemeld bij RA-patiënten12,13,14. Bovendien is gemeld dat veranderde monocytenreacties op ontstekingsstimulatie de osteoclastogenese beïnvloeden bij RA-patiënten met actieve ziekte15,16,17.
De differentiatie van OC's is een complex meerstappenproces dat bestaat uit de inzet van myeloïde voorlopercellen om te differentieren in OC-voorlopers. Tijdens osteoclastogenese worden OC's gigantisch en meerkernig door celcelfusie, onvolledige cytokinese en een nucleair recyclingproces beschreven als splijting en fusie18,19,20. Het vermogen om OC's in vitro te onderscheiden heeft aanzienlijke vooruitgang mogelijk gemaakt in het begrip van botbiologie21. OC's onderscheiden zich van voorlopers bij blootstelling aan macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) en receptoractivator van nucleaire factor kappa-B-ligand (RANKL). Dit laatste is essentieel voor de normale ontwikkeling en functie van OC's in vitro en in vivo, zelfs onder inflammatoire omstandigheden 6,22,23. RANKL wordt gepresenteerd door osteoblasten en osteocyten, evenals door geactiveerde T-cellen en fibroblasten in het ontstoken RA-synovium 2,24,25. Tijdens het OC-differentiatieproces upreguleren monocyten blootgesteld aan M-CSF receptoractivator van nucleaire factor kappa-B (RANK) expressie op hun celmembraan en, onder daaropvolgende stimulatie met RANKL, differentiëren in tartraatresistente zure fosfatase (TRAP)-positieve mononucleaire pre-OC's en vervolgens in multinucleaire OC's15,26. OC's produceren verschillende enzymen, de belangrijkste daarvan is TRAP, dat de afbraak van fosfoproteïnen in bot27 mogelijk maakt. Een regulator en marker van OC-differentiatie is de OC-geassocieerde receptor (OSCAR). Het wordt vroeg geupreguleerd in voorlopercellen die zich committeren aan de OC-afstamming28. Volwassen gigantische multinucleaire OC's kunnen de skeletmatrix afbreken (resorberen) door een grote afdichtingszone te genereren, die is gemaakt van een actinering rond een gegolfde rand21,29,30. Het botresorptievermogen van OC's vereist cytoskeletreorganisatie en de daaruit voortvloeiende polarisatie en vorming van een ingewikkeld membraan, de zogenaamde gegolfde grens. De gegolfde rand is omgeven door een grote cirkelvormige band van een F-actinerijke structuur, die de actinering of afdichtingszone is. Actineringintegriteit is essentieel voor OC's om bot zowel in vitro als in vivo te resorberen, en defecte gegolfde grensvorming is geassocieerd met lagere vacuolaire adenosinetrifosfatase (V-ATPase) expressie31,32,33. Bovendien zijn OC's mitochondriënrijke cellen en adenosinetrifosfaat (ATP) associeert met mitochondriale structuren in OC's gelokaliseerd op de gegolfde grens31,32,33. Rotenon werkt als een sterke remmer van het mitochondriale complex I en beïnvloedt de ATP-productie. Van rotenon is ook aangetoond dat het oc-differentiatie en -functie remt34.
Dit protocol beschrijft een efficiënte en geoptimaliseerde methode van in vitro osteoclastogenese uit menselijke perifere bloedmonsters. In menselijk perifeer bloed zijn CD14+ monocyten de belangrijkste bron van OC's15,35,36. In dit protocol zijn de kinetiek van de blootstelling en de concentraties van M-CSF en RANKL aangepast voor een optimale osteoclastogenese. Mononucleaire cellen worden eerst gescheiden van de erytrocyten en granulocyten die aanwezig zijn in volbloed door dichtheidsgradiënt; ze worden vervolgens verrijkt voor CD14+ monocyten met behulp van positieve selectie door magnetische kralen. De geïsoleerde CD14+ monocyten worden vervolgens 's nachts geïncubeerd met M-CSF. Dit priemt de monocyten om de expressie van RANK15,26 te upreguleren. De daaropvolgende toevoeging van RANKL induceert osteoclastogenese en multinucleatie op een tijdsafhankelijke manier. Actief-resorberende OC's tonen de karakteristieke verdeling van F-actineringen aan de rand van het celmembraan30,32 en kleuring voor TRAP. Volwassen OC's worden geanalyseerd door TRAP + meerkernige (meer dan drie kernen) cellen te kwantificeren. De functionele capaciteit van volwassen OC's kan worden beoordeeld aan de hand van hun resorptie, actineringintegriteit en ATP-productie. Bovendien kunnen gedifferentieerde CD14− OSCAR+ OC's worden verrijkt en gebruikt om de effecten van bepaalde verbindingen op oc-functionaliteit te beoordelen via minerale (of dentine) resorptie en F-actine-organisatie. Bovendien wordt in dit werk een bekende OC-remmer, rotenon, gebruikt als een voorbeeld van een verbinding die de functionaliteit van OC's beïnvloedt. Verminderde OC-resorptieactiviteit onder rotenon is geassocieerd met verminderde ATP-productie en actineringfragmentatie. Kortom, dit protocol stelt een robuuste test vast die kan worden gebruikt als referentiemethode om verschillende biologische aspecten van oc-differentiatie en -functie in vitro te bestuderen.
Deze methodologie kan worden gebruikt om (1) het potentieel van circulerende monocyten om te differentiëren in OC's in gezondheid en ziekten te beoordelen, evenals (2) de impact van therapeutische kandidaten op oc-differentiatie en -functie. Dit robuuste osteoclastogeneseprotocol maakt het mogelijk om de werkzaamheid en mechanismen van botgerichte therapieën te bepalen op zowel OC-differentiatie van voorlopercellen als de functie van volwassen OC's.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Osteoclasten (OC's) zijn botresorberende cellen die een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van het skelet en de remodellering van volwassen botten. Verschillende botaandoeningen worden veroorzaakt door verhoogde differentiatie en activering van OC's, dus de remming van deze pathobiologie is een belangrijk therapeutisch principe. Twee belangrijke factoren stimuleren de differentiatie van OC's van myeloïde voorlopers: macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) en receptoractivator van nucleaire factor kappa-B ligand (RANKL). Van menselijke circulerende CD14+ monocyten is al lang bekend dat ze in vitro differentiëren in OC's. De belichtingstijd en de concentratie van RANKL beïnvloeden echter de differentiatie-efficiëntie. Inderdaad, protocollen voor het genereren van menselijke OC's in vitro zijn beschreven, maar ze resulteren vaak in een slecht en langdurig differentiatieproces. Hierin wordt een robuust en gestandaardiseerd protocol gegeven voor het tijdig genereren van functioneel actieve volwassen menselijke OC's. CD14+ monocyten worden verrijkt uit menselijke perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) en geprimed met M-CSF om RANK te upreguleren. Daaropvolgende blootstelling aan RANKL genereert OC's op een dosis- en tijdsafhankelijke manier. OC's worden geïdentificeerd en gekwantificeerd door kleuring met tartraatzuurresistente fosfatase (TRAP) en lichtmicroscopieanalyse. Immunofluorescentiekleuring van kernen en F-actine wordt gebruikt om functioneel actieve OC's te identificeren. Daarnaast worden OSCAR+CD14− volwassen OC's verder verrijkt via flowcytometriecelsortering en oc-functionaliteit gekwantificeerd door minerale (of dentine/bot) resorptietesten en actineringvorming. Ten slotte wordt een bekende OC-remmer, rotenon, gebruikt op volwassen OC's, wat aantoont dat de productie van adenosinetrifosfaat (ATP) essentieel is voor de integriteit van actineringen en de OC-functie. Kortom, in dit werk wordt een robuuste test voor het differentiëren van hoge aantallen OC's vastgesteld, die in combinatie met actineringkleuring en een ATP-test een nuttig in vitro model biedt om de OC-functie te evalueren en te screenen op nieuwe therapeutische verbindingen die het differentiatieproces kunnen moduleren.

OC-generatie uit CD14+ monocyten Deze methode was gericht op het gemakkelijk onderscheiden van een groot aantal OC's van humaan perifeer bloed CD14 + monocyten in vitro, meestal in 1 week. Ten eerste werden CD14+ monocyten verrijkt met PBMC's en 's nachts geprimed met M-CSF om RANK te upreguleren, zoals eerder gemeld15. Na monocytenpriming, om de optimale concentratie van RANKL voor OC-differentiatie en rijping te bepalen, werden RANKL-concentraties van 1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml en 100 ng / ml, samen met 25ng / mL M-CSF, gebruikt. De toevoeging van RANKL produceerde steeds meer grote TRAP-positieve multinucleaire OC's op een dosisafhankelijke manier, en dit werd beoordeeld met behulp van TRAP-kleuring. Volwassen OC's worden gedefinieerd als TRAP-positieve cellen met meerdere kernen (meestal meer dan drie; Figuur 2A,B en aanvullende figuur 1). Bovendien werd de kinetiek van OC-differentiatie van monocyten onderzocht met behulp van TRAP-kleuring en lichtmicroscopie gedurende een kweekperiode van 2-14 dagen. In dit geval werd oc-differentiatie met behulp van een tussenliggende concentratie van 50 ng / ml RANKL gekozen om te beoordelen hoe snel OC's differentieerden in cultuur. In deze kweekomstandigheden waren meerkernige OC's zichtbaar vanaf dag 5 en werd optimale differentiatie bereikt op dag 7 (figuur 2C). De langdurige incubatie van culturen langer dan 10 dagen op kunststoffen resulteerde in abnormaal gigantische gesmolten cellen. In dit protocol worden dagen 6-8 meestal gebruikt als het optimale eindpunt van OC-generatie. De OC's kunnen worden gekwantificeerd of gebruikt voor downstream-assays.
Functionele beoordeling van gedifferentieerde OC's Om de functionele activiteit van de gegenereerde OC's te bepalen, onderzochten we hun resorptieve activiteit door de OC's op een gemineraliseerd oppervlak te differentiëren. Omdat grote OC's pas na een kweekperiode van 7 dagen worden gegenereerd en om voldoende tijd te hebben om het minerale substraat te resorberen, werden de culturen tot dag 10 gehandhaafd. De vorming van ronde gaten, of resorptieputten, werd alleen waargenomen op de gemineraliseerde oppervlakken van putten met cellen die waren behandeld met zowel M-CSF als RANKL (figuur 3). Het percentage opgelost gemineraliseerd oppervlak (resorptieputten) maakt het dus mogelijk om de OC-resorptieve capaciteit te bepalen. Bovendien vertoonden de OC's die tot dag 7 volgens dit protocol werden gedifferentieerd, zowel op plastic als op glazen kamerglaasjes, een goed georganiseerde actineringstructuur die kon worden gevisualiseerd door immunofluorescente kleuring (aanvullende figuur 2).
Effect van een remmer op volwassen OC-functie De bovengenoemde kweekomstandigheden werden gebruikt om het functionele vermogen van de in vitro gegenereerde OC's te bepalen in aanwezigheid van de bekende OC-remmer, rotenon34. De OC's werden gedurende 6-8 dagen gedifferentieerd en CD14−OSCAR+ OC's en OC-precursoren werden verrijkt via flowcytometrie (figuur 4). De verrijkte cellen werden vervolgens geplateerd op 50.000 cellen / per put op een mineraalgecoate 96-well plaat in pro-osteoclastogeen medium (25 ng / mL M-CSF en RANKL) gedurende 3 dagen. Behandeling met rotenon (figuur 5A,B) dosisafhankelijk remde de resorptie van het gemineraliseerde oppervlak in vergelijking met de onbehandelde controleput, in overeenstemming met eerdere studies34. Daarnaast werd de OC-functionaliteit beoordeeld via ATP-productie en actineringvorming. De rotenonafhankelijke remming van OC-resorptie was geassocieerd met de remming van ATP-productie (figuur 5C). Resorberende OC's zijn sterk gepolariseerde cellen die hun resorptieve capaciteit reguleren door cytoskeletale organisatie te bevorderen. Alexa fluor 647 geconjugeerd falloidine werd gebruikt om het F-actine cytoskelet van de volwassen OC's gekweekt in de aan- of afwezigheid van rotenon te labelen. Rotenon veroorzaakte de fragmentatie van de RANKL-afgeleide actinering van de volwassen OC's (figuur 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> Figuur 2: OC's die efficiënt onderscheid maken van CD14+ monocytenprecursoren. CD14+ monocyten werden magnetisch verrijkt, geplateerd op 1 x 105 cellen/put in 96-well platen, en 's nachts geïncubeerd met 25 ng/mL M-CSF. (A) M-CSF-geprimeerde monocyten werden gestimuleerd met toenemende concentraties RANKL (1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml en 100 ng / ml), gefixeerd en gekleurd voor TRAP op dag 7. Beelden werden verkregen en de TRAP + multinucleated cellen (MNC's) werden geteld. Representatieve beelden van TRAP-kleuring zijn weergegeven in aanvullende figuur 1. De foutbalken tonen het gemiddelde ± SD (n = 3). De gegevens werden geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA en Holm-Sidak's meervoudige vergelijkingstest voor gepaarde gegevens; * P ≤ 0,05 en ** P ≤ 0,005. (B) Representatieve afbeelding van een met TRAP bevlekte put van een plaat met 96 putten die de typische hoeveelheid verwachte OC's/put en hun morfologie onder 25 ng/ml RANK-L toont in vergelijking met van M-CSF afgeleide macrofagen op dag 7. Schaalstaven: 1000 μm. (C) Representatieve beelden van OC-formatie onder 50 ng / ml RANKL beoordeeld via TRAP-kleuring van dag 2 tot dag 14. OC's zijn zichtbaar vanaf dag 5. Gigantische abnormaal gesmolten OC's zijn na 10 dagen aanwezig. Schaalstaven: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> Figuur 3: Resorptieve OC's onderscheiden van CD14+ monocyten. CD14+ cellen geïsoleerd uit PBMC's werden gedurende 10 dagen gedifferentieerd in OC's in aanwezigheid van 25 ng/mL M-CSF (M) en RANKL (R) op minerale assay oppervlak (osteo-assay) platen. (A) Beelden van representatieve gereconstrueerde putten genomen met 10x vergroting om de resorptie op dag 10 te analyseren (mineraal substraat in grijs; resorptieputten in wit). Schaalstaven: 1000 μm. (B) Kwantificering van het percentage geresorbeerd oppervlak. De resorptiegegevens werden geanalyseerd met een Wilcoxon gepaarde analyse. De foutbalken tonen het gemiddelde ± SD (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> Figuur 4: Flowcytometrieverrijking van CD14−OSCAR+ OC's. CD14+ monocyten werden verrijkt met PBMC's en de OC's werden gedifferentieerd zoals eerder beschreven. Aanhangende OC-culturen werden losgemaakt met accutase en gekleurd voor flowcytometrie. (A-C) OC's op dag 8 werden gesorteerd op basis van CD14 en OSCAR-expressie. (A) Representatieve sorteerstrategie. De cellen werden afgesloten als singlets, negatief voor dode kleuring, en de CD14+ OSCAR+ (rood) en CD14− OSCAR+ (blauw) subsets werden gesorteerd. (B) Representatieve plots met de overlappende OSCAR-kleuring van van RANKL afgeleide OC's (cyaan) en van controle M-CSF afgeleide macrofagen (oranje). In rood staat de OSCAR isotype-gekleurde controle van RANKL-afgeleide OC's. (C) De gesorteerde populaties werden op plastic geplateerd en gedurende 2 uur in pro-OC-medium (25 ng / mL M-CSF en 50 ng / ml RANKL) geplakt, gevolgd door TRAP-kleuring en visualisatie. De representatieve afbeeldingen tonen een gebrek aan TRAP+ cellen in de CD14+ subset (rood) en mono- en multinucleated TRAP+ pre-OC's en OC's in de CD14− subset (blauw). Schaalstaven: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> Figuur 5: Assays om de functie van volwassen OC's te beoordelen. Om de functie van volwassen OC's te evalueren, werden CD14+ cellen geïsoleerd uit PBMC's gekweekt met M-CSF (M) alleen of gecombineerd met RANKL (R) gedurende 7 dagen, de OC's werden verrijkt via flowcytometrie en de OC's werden vervolgens behandeld met de remmer rotenon gedurende 24 uur. (A) Volwassen OC's werden gesorteerd via flowcytometrie (CD14−OSCAR+) en werden gekweekt op een mineraal testoppervlak in de aan- of afwezigheid van rotenon gedurende 3 dagen, waarna de cellen werden gebleekt en 10x in beeld werden gebracht om het geresorbeerde gebied te onthullen (resorptieputten in wit). (A) Representatieve gereconstrueerde beelden van putten. Schaalstaven: 1000 μm. (B) De kwantificering van het percentage geresorbeerd oppervlak. De gegevens in (B) werden geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA met Dunn's meervoudige vergelijkingstest (n = 7); * P ≤ 0,05 en** P ≤ 0,01. De foutbalken tonen het gemiddelde ± SD. (C) Totaal intracellulair ATP-gehalte van ongedifferentieerde en dag 7 gedifferentieerde volwassen OC's gedifferentieerd met RANKL en behandeld met vehikel of rotenon (10 nM en 30 nM). Hier werden 2DG en oligomycine gebruikt als positieve controles voor de test en werden 30 minuten voorafgaand aan cellyse en ATP-kwantificering toegevoegd. De foutbalken tonen het gemiddelde ± SD (n = 4). De gegevens werden geanalyseerd met een eenrichtings-ANOVA en dunnett's meervoudige vergelijkingstest voor gepaarde gegevens. ** P ≤ 0,01. (D) Een representatief 20x beeld van volwassen OC's gekleurd voor actineringvorming (rood) en kernen (blauw), met het verlies van de actineringing met de remmer. Schaalstaven: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plaatformaat</td>
			<td>96 putplaat</td>
			<td>48 putplaat</td>
			<td>24 putplaat</td>
			<td>12 putplaat</td>
			<td>6 put-plaat</td>
		</tr><tr><td>volume</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225–250 μL</td>
			<td>450–500 μL</td>
			<td>0,8-1 ml</td>
			<td>1,8-2 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Volume van de celsuspensie voor verschillende plaatformaten. De volumes worden berekend op basis van een oplossing van 1 x 106 cellen /ml en bieden een optimale dichtheid voor cel-celfusie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Fluorofoor, kloon</td>
			<td>Volume (μL) per 106 cellen</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/Cyaan7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Celsorteerbuffer</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2 : Antilichaam master mix oplossing. 
Aanvullende figuur 1: TRAP-kleuring van de RANKL-dosisrespons. CD14+ monocyten werden magnetisch verrijkt, geplateerd op 1 x 105 cellen/put in 96-well platen, en 's nachts geïncubeerd met 25 ng/mL M-CSF, zoals in figuur 2. Representatieve afbeeldingen van TRAP-kleuring tonen MCSF-geprimeerde monocyten gestimuleerd met toenemende concentraties RANKL (1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml en 100 ng / ml), gefixeerd en gekleurd voor TRAP op dag 7. Schaalstaven: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: Werkende ringkleuring in volledig gedifferentieerde OC's. (A) Een 10x vergroting van OC's gedifferentieerd op TC plastic en gekleurd met AF647 falloidine (in rood). Schaalbalk: 400 μm. (B) Een 40x vergroting van OC's gedifferentieerd op glazen kamerglaasjes en gekleurd met AF488 falloidine (in geel). Schaalbalk: 100 μm.De kernen zijn gekleurd met DAPI, weergegeven in blauw in (A) en in cyaan in (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 3: Effect van verschillende FBS-batches op oc-differentiatie-efficiëntie. OC's werden onderscheiden van CD14+ monocyten in aanwezigheid van 25 ng/mL M-CSF en 50 ng/mL RANKL (MR) gedurende 7 dagen. De controleputten hadden alleen M-CSF (M). (A) Representatieve 10x vergrotingen (schaalbalken: 400 μm) en (B) kwantificering van TRAP-gekleurde OC's gedifferentieerd van één donor in twee verschillende batches FBS. De foutbalken tonen de gemiddelde ± SD van drie technische replicaties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasten zijn belangrijke bot-resorberende cellen in het lichaam. Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor de in vitro differentiatie van osteoclasten van menselijke perifere bloedmonocyten. Deze methode kan worden gebruikt als een belangrijk hulpmiddel om de biologie van osteoclasten in homeostase en bij ziekten verder te begrijpen.

Differentiatie van functionele osteoclasten van humaan perifeer bloed CD14+ monocyten

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0.Ons protocol beschrijft een geoptimaliseerde en reproduceerbare methode om osteoclast in vitro te genereren die kan worden gebruikt om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan hun differentiatieproces en functionaliteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om binnen slechts een week grote aantallen functioneel actieve osteoclasten te genereren. Een hoge differentiatieopbrengst wordt bereikt door gezuiverde monocyten te gebruiken en cytokines op tijd toe te voegen.Osteoclasten zijn verantwoordelijk voor botvernietiging bij elke vorm van artritis, en deze methode biedt de hulpmiddelen om nieuwe therapeutische verbindingen te screenen die hun differentiatie en / of functies kunnen moduleren. De procedure wordt gedemonstreerd door Patricia Riedlova, een promovenda van ons laboratorium. Isoleer om te beginnen de PBMC's door het bloed over te brengen in een nieuwe buis van 50 milliliter.Verdun het met steriele PBS in een gelijk volume voor vers bloed, of een verhouding van 1:3 voor leukocytenkegels en buffy coats. Meng het bloed voorzichtig door inversie. Bereid buizen van 15 milliliter met drie milliliter dichtheidsgradiëntmedium voor en leg langzaam acht tot 10 milliliter verdund bloed op de bovenkant van het dichtheidsgradiëntmedium, vermijd mengen.Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder rem. Gooi vervolgens de bovenste laag voorzichtig weg met een Pasteurpipet. Verzamel de onderliggende interfaselaag met de PBMC's en breng deze laag over in een nieuwe buis van 50 milliliter.Suspensie de cellen tot 50 milliliter met steriele PBS en was het resterende dichtheidsgradiëntmedium af door gedurende 10 minuten bij 300 x g bij kamertemperatuur met volle rem te centrifugeren. Om resterende bloedplaatjes te verwijderen, herhaalt u het centrifugatieproces zoals beschreven in het manuscript, resuspensie van de geïsoleerde en gezuiverde PBMC's in 20 milliliter PBS en telt u ze met behulp van een hemacytometer volgens de standaardmethode. Om CD14+monocyten te verrijken, brengt u 1 x 10 over naar de zevende PBMC's in een geschikte polystyreen buis met ronde bodem en pellet u de cellen gedurende vijf minuten op 300 x g.Na het weggooien van het supernatant en het opnieuw suspuskeren van de celpellet in de celscheidingsbuffer, incubeer je de cellen gedurende 10 minuten met 10 microliter antilichaamcocktail per 100 microliter met het deksel erop. Voeg aan het einde van de incubatie 10 microliter van de magnetische nanodeeltjesparels per 100 microliter toe en incuber gedurende drie minuten met het deksel erop. Vul het volume aan tot 2,5 milliliter met de celscheidingsbuffer.Plaats de buis in een magneet en incubeer gedurende drie minuten met het deksel eraf. Gooi nu de negatieve-celpopulatie weg met één continue beweging door inversie terwijl de buis nog in de magneet zit. Verwijder de buis van de magneet, was de verrijkte CD14+monocyten die aan de magnetische kralen zijn bevestigd door ze opnieuw in 2,5 milliliter van de celsuspensiebuffer te plaatsen en plaats de buis terug in de magneet.Tel de geïsoleerde cellen zoals eerder aangetoond. Centrifugeer de verzamelde cellen gedurende vijf minuten op 300 x g. Na het weggooien van het supernatant, resuspendien de cellen met 1 miljoen-cellen-per-milliliter in volledig alfa minimaal essentieel medium met 10% FBS.Om de osteoclast te differentiëren, voegt u M-CSF in een eindconcentratie van 25 nanogram per milliliter toe aan de celsuspensie en mengt u door grondig te pipetteren om de celsuspensie te homogeniseren. Plaat 100-microliter van de suspensie-per-put in een vlakke bodem 96-well plaat. Voeg vervolgens 200 microliter steriel gedestilleerd water per put toe rond de vergulde cellen om mediumverdamping en randeffecten in het kweeksysteem te voorkomen.Incubeer de cellen 's nachts gedurende ongeveer 18 tot 20 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Bereid verse media voor aangevuld met M-CSF en RANK ligand. Verwijder na de incubatie voorzichtig de helft van het medium door aspiratie met behulp van een P200-pipet en vervang het door vers, warm compleet medium aangevuld met M-CSF en RANK-ligand in een eindconcentratie van 25 nanogram per milliliter.Differentieer de cellen in osteoclasten gedurende zeven tot 14 dagen met een volledige vervanging van het medium om de drie dagen. Na het verwijderen van het medium, fixeert u de gedifferentieerde aanhangende osteoclasten met 100 microliter per put van de bereide fixatieve oplossing en incubeert u gedurende één minuut. Raak de bodem van de putjes niet aan om krassen op de aanhangende cellen te voorkomen.Zodra de putten drie keer zijn gewassen met 300 microliter steriel gedestilleerd water, tikt u de platen droog en voegt u 100 microliter vers bereide kleuringsoplossing toe aan elke put. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius in het donker gedurende 20 minuten. Verwijder na incubatie de kleuringsoplossing door inversie en was de plaat drie keer met 300 microliter per put gedestilleerd water.Verwijder het overtollige water door op de platen op keukenpapier te tikken en laat de platen open en beschermd tegen licht tot aan de lucht drogen 's nachts. Maak met behulp van een brightfield-microscoop met een tegeloptie foto's van 10x of 20x om het hele putoppervlak vast te leggen. Tel handmatig de osteoclasten die zijn geïdentificeerd als TRAP + paars gekleurde cellen met meer dan drie kernen met behulp van een beeldanalysesoftware met een celtellerplug-in.Plaat 100-microliter van de geïsoleerde CD14+monocyten-per-put in een 18-well kamer schuift bij een celdichtheid van 1 x 10 tot de vijfde cellen-per-put. Differentieer de osteoclasten in aanwezigheid van M-CSF en RANK ligand zoals eerder aangetoond met een volledige verandering van medium om de drie dagen. Verwijder op het eindtijdpunt voorzichtig het medium en was elke put twee keer met 200 microliter voorverwarmde PBS bij pH 7,4.Laat de putten niet tussen de treden door drogen. Bevestig het monster met 100 microliter per put van 4% formaldehyde-oplossing in PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder met zacht schudden. Na incubatie, was de cellen twee keer met 200-microliter-per-put van PBS.Permeabiliseer de cellen met 100-microliter-per-well van 0,1% Triton x-100-oplossing verdund in PBS en incubeer gedurende 10 minuten zoals eerder getoond. Was twee keer met 200 microliter PBS per put. Om niet-specifieke binding te blokkeren en het signaal te verhogen, voegt u 100 microliter blokkerende oplossing toe die is gemaakt met 2% runderserumalbumine en PBS-oplossing.Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker met zacht schudden. Voeg na het verwijderen van de blokkerende oplossing 100 microliter fluorescerend geconjugeerde falloïdine-oplossing verdund in 2% BSA / PBS-oplossing toe aan elk putje. Was twee keer met 200 microliter PBS per put.Bevlek de kernen met 100 microliter per put van een oplossing van PBS die 300 nanomolaire DAPI bevat. Verwijder na 10 tot 15 minuten de DAPI-oplossing en vervang deze door PBS van 100 microliter per put. Visualiseer de kleuring met behulp van geschikte immunofluorescentie of confocale microscopen op vier tot 40x.De rijpe osteoclasten worden gedefinieerd als TRAP+multiple nucleate cellen. De toevoeging van RANK-ligand produceerde steeds meer grote TRAP+multi-nucleated osteoclasten op een dosisafhankelijke manier. De kinetiek van osteoclastische differentiatie van monocyten werd onderzocht gedurende een kweekperiode van twee tot 14 dagen.Multinucleaire osteoclasten waren zichtbaar vanaf dag vijf en optimale differentiatie werd bereikt op dag zeven. De differentiatie van osteoclasten op gemineraliseerde oppervlakken maakt het mogelijk om hun resorptieactiviteit te beoordelen door de vorming van ronde gaten of resorptieputten te analyseren. Het resorptiepercentage neemt significant toe in de aanwezigheid van M-CSF en RANK ligand in vergelijking met M-CSF alleen.Verder remde behandeling met rotenon dosisafhankelijk de resorptie van het gemineraliseerde oppervlak in vergelijking met de onbehandelde controleput. De rotenonafhankelijke remming van osteoclastresorptie was geassocieerd met de remming van ATP-productie. De fragmentatie van de RANK ligand-afgeleide actine ring van de volwassen OCS werd waargenomen in aanwezigheid van rotenon.Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de verrijkte monocyten geen bloedplaatjes bevatten, dat de cellen op de juiste dichtheid zijn geplateerd en dat de omliggende putten met water zijn gevuld om het randeffect te voorkomen. Dit protocol is vooral nuttig om mechanistisch te onderzoeken hoe osteoclasten zich vormen en wat hun functionaliteit beïnvloedt, zowel in de basis- als in de translationele wetenschap. Bijvoorbeeld door verbindingen of eiwitten te gebruiken die deze processen kunnen moduleren.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Uitbreiding, zuivering, en functionele beoordeling van de humane perifere bloed NK-cellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Uitbreiding van de humane perifere bloed γδ T-cellen met behulp van zoledronaat

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecteren Glycogeen in perifeer bloed mononucleaire cellen met Periodic Acid Schiff kleuring

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

De isolatie, differentiatie en kwantificering van menselijk antilichaam-uitscheidende B-cellen uit bloed: ELISpot als functionele Uitlezing van humorale immuniteit

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran verbetert de efficiëntie van de lentivirale transductie van lymfkliertest en menselijke primaire NK-cellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyt differentiatie en bloedplaatjes vorming van mens koord bloed afkomstige CD34+ cellen

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Beoordeling van de synaptische Interface van primaire menselijke T-cellen uit perifeer bloed en lymfoïde weefsel

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...