Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Les auteurs remercient le Flow Core Facility et le Glasgow Imaging Facility (GIF) de la School of Infection and Immunity pour leur soutien et leur assistance dans ce travail.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

La culture et l’isolement faciles d’un grand nombre de CO fonctionnels in vitro sont importants pour faire progresser la compréhension de la biologie osseuse et des maladies médiées par le CO. Classiquement, les CO étaient générés en co-cultures avec des ostéoblastes ou des cellules stromales et des cellules hématopoïétiques de la rate ou de la moelle osseuse38,39. Une percée significative dans la compréhension de l’ostéoclastogenèse a été l’identification de RANKL comme principal régulateur de la formation, de la différenciation et de la surviedu CO 40. Les premiers protocoles des systèmes de culture dépendants de RANKL utilisaient des PBMC pour la génération de CO21,41,42. Cependant, ces cultures mixtes sont longues et présentent de nombreux facteurs de confusion qui limitent la capacité de tester les effets directs sur la différenciation et la fonction du CO. Ce protocole décrit un modèle in vitro efficace et fiable d’ostéoclastogenèse à partir de monocytes CD14+ périphériques humains dans lequel une ostéoclastogenèse optimale peut être obtenue en 7 jours (Figure 1 et Figure 2), ce qui est considérablement plus rapide par rapport à certains autres protocoles43,44,45,46. Les principales caractéristiques distinctives de ce protocole sont (1) l’utilisation de monocytes CD14+ purifiés, (2) l’amorçage des monocytes avec du M-CSF avant l’exposition au RANKL, (3) la durée de la culture (<7 jours) et (4) la détection fiable de l’inhibition de la formation d’OC (coloration TRAP) et de la fonction (résorption, production d’ATP, réorganisation du cycle actine) avec des inhibiteurs. 
Lors de l’optimisation de la méthodologie, plusieurs points critiques ont été identifiés. Il a été observé que la différenciation in vitro des CO dépend en grande partie de la densité d’ensemencement des monocytes CD14+. Ainsi, dans ce protocole, les cellules sont ensemencées à haute densité (1 x 105 cellules/puits d’une plaque de 96 puits, dans 100 μL de milieu), car il est essentiel que les cellules puissent interagir les unes avec les autres et être à proximité de fusionner et devenir des CO matures. De même, l’ensemencement des cellules à une densité trop élevée limite leur différenciation et leur croissance en raison de limitations moyennes et d’un manque d’espace requis. De plus, pour obtenir un succès maximal avec ce protocole, il est important d’effectuer soigneusement la séparation du gradient de densité et de s’assurer que la population enrichie de cellules CD14+ est aussi pure que possible. Par exemple, des étapes de lavage inadéquates entraînent un manque d’élimination des plaquettes, ce qui inhibe par conséquent la différenciation du CO47,48. De même, la présence d’une contamination mineure par les lymphocytes T dans des préparations isolées de CD14+ stimulées par le M-CSF seul peut entraîner une différenciation du CO, potentiellement via la sécrétion de RANKL par les lymphocytes T49. Par conséquent, il est important d’inclure un contrôle M-CSF pour chaque expérience. Un contrôle de pureté de routine, en particulier lors de l’utilisation d’un nouveau kit d’isolation, est également recommandé pour assurer la pureté de l’échantillon.
Les nombres OC optimaux (plage : ~200-1 600 OC/puits) sont obtenus en utilisant un milieu α-MEM enrichi en nucléosides et en L-glutamine. D’autres milieux de culture conventionnels, y compris le milieu aigle modifié de Dulbecco (DMEM) et le milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI), affectent le rendement en CO. La source de FBS peut également influencer l’ostéoclastogenèse. Différents lots de FBS peuvent entraîner une réduction de l’ostéoclastogenèse dérivée de RANK-L, ainsi que l’apparition d’un faible nombre de cellules multinucléées TRAP+ chez les témoins M-CSF (Figure supplémentaire 3). Par conséquent, pour obtenir des résultats cohérents, il est conseillé de tester de nouveaux lots FBS avant utilisation et de continuer avec le même lot tout au long des expériences afin de minimiser les variations dans le processus de différenciation. De plus, la variabilité d’un donneur à l’autre, en termes de nombre total de CO différenciés obtenus au point final, constitue une limite lors de l’utilisation de ce protocole pour comparer, par exemple, les donneurs sains aux patients. Dans ces cas, il est impératif d’utiliser exactement les mêmes conditions et le même lot de milieu, FBS et autres réactifs.
Une autre étape nécessaire pour une différenciation et une maturation optimales du CO consiste à amorcer les monocytes avec du M-CSF avant l’ajout de RANKL. L’exposition des cellules au M-CSF 18-24 h avant RANKL incite les monocytes à réguler positivement l’expression de RANK 15,26. L’ajout de RANKL à ce moment assure une différenciation optimale du CO d’une manière dose-dépendante. Le degré de différenciation du CO varie d’un donneur à l’autre; cependant, 25 ng/mL de RANKL est généralement suffisant pour différencier un nombre élevé de CO chez la plupart des donneurs. De plus, 25 ng/mL de RANKL peut être utilisé dans les essais pour le criblage initial des composés, car il facilite l’évaluation des effets améliorants et inhibiteurs des composés d’essai. D’autres systèmes de culture ont utilisé des temps de pré-incubation du M-CSF plus longs avant l’ajout de RANKL, mais cela entraîne un temps de culture plus long pour l’ostéoclastogenèse50. De plus, laisser les monocytes amorcés incuber pendant la nuit leur permet de se fixer à la plaque, mais pas dans un état d’adhérence complète. Par conséquent, lorsque RANKL est introduit pour la première fois, le milieu doit être à moitié changé très soigneusement plutôt que complètement changé pour éviter le détachement et la perte des monocytes amorcés. Le milieu doit également être rafraîchi tous les 3-4 jours pour éviter l’épuisement moyen et prévenir la mort cellulaire. De plus, en raison du faible volume utilisé dans cet essai (100 μL/puits dans une plaque de 96 puits), il est de la plus haute importance d’avoir un cadre de puits vides remplis d’une solution aqueuse (c.-à-d.H2Oou PBS distillé stérile) autour des puits d’essai. Cela empêche l’évaporation moyenne et les effets de bord.
Enfin, pour les tests métaboliques (p. ex., les tests ATP), il est impératif que les cellules soient viables pour éviter un écart type énorme entre les répétitions (Figure 5). Une viabilité élevée des cellules est également importante pour le tri des cellules et pour la poursuite de la culture des CO triés (Figure 4). Cette méthode présente toutefois plusieurs limites. Les CO complètement matures sont très adhérents et difficiles à détacher des plaques. Les CO plus grands sont souvent impossibles à détacher, ce qui peut entraîner une baisse du rendement cellulaire. Par conséquent, les cellules doivent être comptées après le tri et avant le placage à la concentration requise. En outre, dans le protocole actuel, une méthode non enzymatique (accutase) pour détacher les CO est utilisée pour prévenir les altérations membranaires de la coloration de surface en aval pour la cytométrie en flux. L’utilisation de grattoirs cellulaires (à la fois avec des terminaisons molles ou dures) a également été testée et a conduit à une mort cellulaire élevée. Le décollement enzymatique utilisant des solutions de trypsine/EDTA à 0,05 % peut être utilisé pour un rendement plus élevé des CO détachés lorsque l’intégrité de la membrane n’est pas requise pour les applications en aval. De plus, pour éviter que les CO ne s’agglutinent, l’utilisation d’une concentration élevée d’EDTA dans tous les tampons après le décollement cellulaire, ainsi qu’un filtrage approprié avant l’acquisition de la cytométrie en flux, sont fortement recommandés. Il est important de noter que les cultures de CO sont une population hétérogène de cellules constituées de CO matures, de précurseurs de CO et de macrophages. Les macrophages peuvent être facilement distingués des CO, bien que les CO mononucléaires pré-OC et les CO multinucléaires expriment OSCAR et ne puissent pas être distingués avec la présente méthode (Figure 4). En effet, cette dernière question constitue la principale limite de cette méthode. En outre, une faible expression d’OSCAR est également présente dans les cultures de M-CSF (Figure 4B) et pourrait indiquer des macrophages qui sont préparés pour l’engagement de la lignée OC. Il est important de régler la grille des cellules OSCAR+ en fonction du signal de coloration FMO, comme illustré à la figure 4B.
En résumé, ce protocole décrit une méthode optimisée et robuste pour la production efficace de CO actifs et fonctionnellement matures à partir de monocytes humains primaires circulants. La force de ce protocole est sa capacité à générer des CO dans un court laps de temps et à produire un nombre élevé de CO différenciés. Cette méthode ouvre la voie à l’étude des mécanismes de base sous-jacents à la différenciation et à la fonction du CO.

Les ostéoclastes (OC) sont des cellules géantes multinucléées de lignée hématopoïétique avec une capacité unique à résorber les os. Ils sont responsables du développement et du remodelage continu du squelette 1,2. Dans les phases squelettiques du développement, les CO et les macrophages résidant dans les tissus sont dérivés de progéniteurs érythro-myéloïdes et colonisent la niche osseuse et les tissus organiques. Dans des conditions physiologiques, les progéniteurs érythro-myéloïdes sont nécessaires au développement normal des os et à l’éruption dentaire, tandis que l’afflux de monocytes sanguins circulants dans la niche osseuse assure le maintien postnatal des CO, de la masse osseuse et de la cavité médullaire3. Dans des conditions pathologiques, les monocytes sont recrutés sur des sites d’inflammation active et peuvent contribuer à la destruction osseuse pathologique 4,5.
Les patients atteints de plusieurs formes d’arthrite éprouvent une inflammation articulaire, conduisant à une destruction articulaire progressive causée par les CO6. Par exemple, dans la polyarthrite rhumatoïde (PR), les CO suractivés sont responsables de l’érosion osseuse pathologique et de la destruction des articulations7,8, et les traitements actuels n’améliorent ou n’arrêtent souvent pas les lésions osseuses9,10,11. Des altérations des monocytes circulants en termes de distribution de la population et de signatures transcriptomiques et épigénétiques ont été rapportées chez des patients atteints de PR12,13,14. De plus, il a été rapporté que les réponses monocytaires altérées à la stimulation inflammatoire affectent l’ostéoclastogenèse chez les patients atteints de PR atteints de maladie active15,16,17.
La différenciation des CO est un processus complexe en plusieurs étapes comprenant l’engagement des cellules précurseurs myéloïdes à la différenciation en précurseurs du CO. Au cours de l’ostéoclastogenèse, les CO deviennent géants et multinucléés par fusion cellule-cellule, cytocinèse incomplète et un processus de recyclage nucléaire décrit comme fission et fusion18,19,20. La capacité de différencier les CO in vitro a permis des avancées significatives dans la compréhension de la biologie osseuse21. Les CO se différencient des précurseurs lorsqu’ils sont exposés au facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et à l’activateur des récepteurs du ligand kappa-B du facteur nucléaire (RANKL). Ce dernier est essentiel pour le développement normal et la fonction des CO in vitro et in vivo, même dans des conditions inflammatoires 6,22,23. RANKL est présenté par les ostéoblastes et les ostéocytes, ainsi que par les lymphocytes T activés et les fibroblastes dans la synoviale 2,24,25 enflammée de PR. Au cours du processus de différenciation OC, les monocytes exposés au M-CSF régulent positivement l’activateur du récepteur de l’expression du facteur nucléaire kappa-B (RANK) sur leur membrane cellulaire et, sous stimulation ultérieure avec RANKL, se différencient en pré-CO mononucléés positifs à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP), puis en CO multinucléés15,26. Les CO produisent plusieurs enzymes, la principale d’entre elles étant TRAP, qui permet la dégradation des phosphoprotéines dans l’os27. Un régulateur et marqueur de la différenciation OC est le récepteur associé à OC (OSCAR). Il est régulé à la hausse tôt dans les cellules précurseurs s’engageant dans la lignée OC28. Les OC géants multinucléés matures peuvent dégrader (résorber) la matrice squelettique en générant une grande zone d’étanchéité, qui est constituée d’un anneau d’actine entourant une bordure ébouriffée21,29,30. La capacité de résorption osseuse des CO nécessite une réorganisation du cytosquelette et la polarisation et la formation d’une membrane alambiquée, appelée bordure ébouriffée. La bordure ébouriffée est entourée d’une grande bande circulaire d’une structure riche en F-actine, qui est l’anneau d’actine ou la zone de scellement. L’intégrité du cycle d’actine est essentielle pour que les CO résorbent l’os à la fois in vitro et in vivo, et une formation défectueuse de bordure ébouriffée est associée à une expression inférieure de l’adénosine triphosphatase vacuolaire (V-ATPase)31,32,33. De plus, les CO sont des cellules riches en mitochondries, et l’adénosine triphosphate (ATP) s’associe à des structures de type mitochondrial dans les CO localisées à la frontière ébouriffée31,32,33. La roténone agit comme un puissant inhibiteur du complexe mitochondrial I et a un impact sur la production d’ATP. Il a également été démontré que la roténone inhibe la différenciation et la fonctionOC 34.
Ce protocole décrit une méthode efficace et optimisée d’ostéoclastogenèse in vitro à partir d’échantillons de sang périphérique humain. Dans le sang périphérique humain, les monocytes CD14+ sont la principale source de CO15,35,36. Dans ce protocole, la cinétique d’exposition et les concentrations de M-CSF et de RANKL ont été ajustées pour une ostéoclastogenèse optimale. Les cellules mononucléaires sont d’abord séparées des érythrocytes et des granulocytes présents dans le sang total par gradient de densité; ils sont ensuite enrichis pour les monocytes CD14+ par sélection positive par billes magnétiques. Les monocytes CD14+ isolés sont ensuite incubés pendant une nuit avec du M-CSF. Cela amorce les monocytes à réguler positivement l’expression de RANK15,26. L’ajout ultérieur de RANKL induit l’ostéoclastogenèse et la multinucléation de manière dépendante du temps. Les CO à résorbation active montrent la distribution caractéristique des anneaux F-actine au bord de la membrane cellulaire30,32 et la coloration pour TRAP. Les CO matures sont analysés en quantifiant les cellules multinucléées TRAP+ (plus de trois noyaux). La capacité fonctionnelle des CO matures peut être évaluée par leur résorption, l’intégrité du cycle actine et la production d’ATP. De plus, les CO CD14− OSCAR+ différenciés peuvent être enrichis et utilisés pour évaluer les effets de certains composés sur la fonctionnalité du CO via la résorption minérale (ou dentine) et l’organisation de la F-actine. De plus, dans ce travail, un inhibiteur connu du CO, la roténone, est utilisé comme exemple d’un composé qui affecte la fonctionnalité des CO. Une activité réduite de résorption du CO sous la roténone est associée à une production réduite d’ATP et à une fragmentation du cycle d’actine. En conclusion, ce protocole établit un essai robuste qui peut être utilisé comme méthode de référence pour étudier plusieurs aspects biologiques de la différenciation et de la fonction OC in vitro. 
Cette méthodologie peut être utilisée pour évaluer (1) le potentiel des monocytes circulants à se différencier en CO dans la santé et les maladies, ainsi que (2) l’impact des candidats thérapeutiques sur la différenciation et la fonction des CO. Ce protocole robuste d’ostéoclastogenèse permet de déterminer l’efficacité et les mécanismes des thérapies ciblant les os à la fois sur la différenciation du CO par rapport aux cellules précurseurs et sur la fonction des CO matures.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Les ostéoclastes (CO) sont des cellules résorbant les os qui jouent un rôle central dans le développement du squelette et le remodelage osseux chez l’adulte. Plusieurs troubles osseux sont causés par une différenciation et une activation accrues des CO, de sorte que l’inhibition de cette pathobiologie est un principe thérapeutique clé. Deux facteurs clés déterminent la différenciation des CO des précurseurs myéloïdes : le facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF) et l’activateur des récepteurs du ligand kappa-B du facteur nucléaire (RANKL). On sait depuis longtemps que les monocytes CD14+ circulants humains se différencient en CO in vitro. Cependant, le temps d’exposition et la concentration de RANKL influencent l’efficacité de la différenciation. En effet, des protocoles pour la génération de CO humains in vitro ont été décrits, mais ils aboutissent souvent à un processus de différenciation long et médiocre. Ici, un protocole robuste et normalisé pour générer des CO humains matures fonctionnellement actifs en temps opportun est fourni. Les monocytes CD14+ sont enrichis à partir de cellules mononucléées du sang périphérique humain (PBMC) et amorcés avec du M-CSF pour réguler positivement RANK. L’exposition ultérieure à RANKL génère des CO en fonction de la dose et du temps. Les CO sont identifiés et quantifiés par coloration à l’aide de phosphatase résistante aux acides au tartrate (TRAP) et d’une analyse par microscopie optique. La coloration par immunofluorescence des noyaux et de la F-actine est utilisée pour identifier les CO fonctionnellement actifs. De plus, les CO matures OSCAR+CD14− sont enrichis par le tri cellulaire par cytométrie en flux et la fonctionnalité du CO quantifiée par des tests de résorption minérale (ou dentine/os) et la formation d’un cycle d’actine. Enfin, un inhibiteur connu du CO, la roténone, est utilisé sur les CO matures, démontrant que la production d’adénosine triphosphate (ATP) est essentielle à l’intégrité du cycle actine et à la fonction OC. En conclusion, un test robuste pour différencier un grand nombre de CO est établi dans ce travail, qui, en combinaison avec la coloration du cycle d’actine et un test ATP, fournit un modèle in vitro utile pour évaluer la fonction OC et dépister de nouveaux composés thérapeutiques capables de moduler le processus de différenciation.

Génération de CO à partir de monocytes CD14+ Cette méthode visait à différencier facilement un grand nombre de CO des monocytes CD14+ du sang périphérique humain in vitro, généralement en 1 semaine. Tout d’abord, les monocytes CD14+ ont été enrichis à partir de PBMC et amorcés avec du M-CSF pendant la nuit pour réguler à la hausse RANK, comme indiqué précédemment15. Après l’amorçage des monocytes, pour déterminer la concentration optimale de RANKL pour la différenciation et la maturation du CO, des concentrations de RANKL de 1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL et 100 ng/mL, ainsi que 25 ng/mL DE M-CSF, ont été utilisées. L’ajout de RANKL a produit un nombre croissant de grands CO multinucléés positifs au TRAP d’une manière dose-dépendante, et cela a été évalué à l’aide de la coloration TRAP. Les CO matures sont définis comme des cellules TRAP-positives avec plusieurs noyaux (généralement plus de trois; Figure 2A,B et Figure supplémentaire 1). De plus, la cinétique de la différenciation OC des monocytes a été étudiée à l’aide de la coloration TRAP et de la microscopie optique sur une période de culture de 2 à 14 jours. Dans ce cas, la différenciation OC à l’aide d’une concentration intermédiaire de 50 ng/mL RANKL a été choisie pour évaluer la vitesse à laquelle les CO se différencient en culture. Dans ces conditions de culture, les CO multinucléés étaient visibles à partir du jour 5, et une différenciation optimale a été atteinte le jour 7 (Figure 2C). L’incubation prolongée de cultures au-delà de 10 jours sur des plastiques a abouti à des cellules fusionnées anormalement géantes. Dans ce protocole, les jours 6 à 8 sont généralement utilisés comme critère d’évaluation optimal de la génération de CO. Les CO peuvent être quantifiés ou utilisés pour des essais en aval.
Évaluation fonctionnelle des CO différenciés Pour déterminer l’activité fonctionnelle des CO générés, nous avons examiné leur activité résorptive en différenciant les CO sur une surface minéralisée. Comme les gros CO ne sont générés qu’après une période de culture de 7 jours, et pour laisser suffisamment de temps pour résorber le substrat minéral, les cultures ont été maintenues jusqu’au jour 10. La formation de trous ronds, ou fosses de résorption, n’a été observée que sur les surfaces minéralisées de puits contenant des cellules qui avaient été traitées à la fois avec du M-CSF et du RANKL (Figure 3). Ainsi, le pourcentage de surface minéralisée dissoute (fosses de résorption) permet de déterminer la capacité de résorption du CO. De plus, les CO différenciés suivant ce protocole jusqu’au jour 7, à la fois sur des lames de chambre en plastique et en verre, présentaient une structure d’anneau d’actine bien organisée qui pouvait être visualisée par coloration immunofluorescente (figure supplémentaire 2).
Effet d’un inhibiteur sur la fonction OC mature Les conditions de culture mentionnées ci-dessus ont été utilisées pour déterminer la capacité fonctionnelle des CO générés in vitro en présence de l’inhibiteur connu du CO, la roténone34. Les CO ont été différenciés pendant 6 à 8 jours, et les CO CD14−OSCAR+ et les précurseurs OC ont été enrichis par cytométrie en flux (Figure 4). Les cellules enrichies ont ensuite été plaquées à 50 000 cellules/par puits sur une plaque minérale de 96 puits dans un milieu pro-ostéoclastogène (25 ng/ml de m-CSF et RANKL) pendant 3 jours. Le traitement à la roténone (figure 5A,B) a inhibé la résorption de la surface minéralisée par rapport au puits témoin non traité, conformément aux études antérieures34. De plus, la fonctionnalité du CO a été évaluée via la production d’ATP et la formation d’anneaux d’actine. L’inhibition de la résorption du CO dépendante de la roténone était associée à l’inhibition de la production d’ATP (Figure 5C). Les CO résorbants sont des cellules hautement polarisées qui régulent leur capacité de résorption en favorisant l’organisation du cytosquelette. La phalloïdine conjuguée Alexa fluor 647 a été utilisée pour marquer le cytosquelette F-actine des CO matures cultivés en présence ou en l’absence de roténone. La roténone a provoqué la fragmentation de l’anneau actine dérivé de RANKL des CO matures (Figure 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> Figure 2 : Les CO se différencient efficacement des précurseurs des monocytes CD14+. Les monocytes CD14+ ont été enrichis magnétiquement, plaqués à 1 x 105 cellules/puits dans des plaques de 96 puits, et incubés pendant une nuit avec 25 ng/ml de m-CSF. (A) Les monocytes amorcés par le M-CSF ont été stimulés avec des concentrations croissantes de RANKL (1 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL et 100 ng / mL), fixés et colorés pour TRAP le jour 7. Des images ont été acquises et les cellules multinucléées TRAP+ (MNC) ont été comptées. Des images représentatives de la coloration TRAP sont présentées à la figure supplémentaire 1. Les barres d’erreur indiquent ± ET moyen (n = 3). Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA unidirectionnelle et du test de comparaisons multiples de Holm-Sidak pour les données appariées; * P ≤ 0,05 et ** P ≤ 0,005. (B) Image représentative d’un puits coloré par TRAP d’une plaque de 96 puits montrant la quantité typique de CO/puits attendue et leur morphologie inférieure à 25 ng/mL RANK-L par rapport aux macrophages dérivés du M-CSF au jour 7. Barres d’échelle: 1000 μm. (C) Images représentatives de la formation d’OC sous 50 ng / mL RANKL évaluées par coloration TRAP du jour 2 au jour 14. Les CO sont visibles à partir du jour 5. Des CO géants anormalement fusionnés sont présents après 10 jours. Barres d’échelle: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> Figure 3 : CO résorptifs différenciés des monocytes CD14+. Les cellules CD14+ isolées des PBMC ont été différenciées pendant 10 jours en CO en présence de 25 ng/ml de m-CSF (m) et de RANKL(R) sur des plaques minérales de surface (ostéo-essai). (A) Images de puits reconstruits représentatifs prises à un grossissement de 10x pour analyser la résorption au jour 10 (substrat minéral en gris; fosses de résorption en blanc). Barres d’échelle: 1000 μm. (B) Quantification du pourcentage de surface résorbée. Les données de résorption ont été analysées avec une analyse par paires de Wilcoxon. Les barres d’erreur indiquent ± ET moyen (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> Figure 4 : Enrichissement en cytométrie en flux des CO CD14−OSCAR+. Les monocytes CD14+ ont été enrichis à partir de PBMC, et les CO ont été différenciés comme décrit précédemment. Les cultures OC adhérentes ont été détachées avec de l’accutase et colorées pour la cytométrie en flux. (A-C) Les CO du jour 8 ont été triés en fonction de CD14 et de l’expression OSCAR. (A) Stratégie représentative de tri des points de contrôle. Les cellules ont été fermées sous forme de singlets, négatives pour la coloration morte, et les sous-ensembles CD14+ OSCAR+ (rouge) et CD14− OSCAR+ (bleu) ont été triés. (B) Graphiques représentatifs montrant le chevauchement de la coloration OSCAR des CO dérivés de RANKL (cyan) et des macrophages témoins dérivés du M-CSF (orange). En rouge se trouve le contrôle coloré par l’isotype OSCAR des CO dérivés de RANKL. (C) Les populations triées ont été plaquées sur du plastique et laissées adhérer pendant 2 h dans un milieu pro-OC (25 ng/mL M-CSF et 50 ng/mL RANKL), suivies d’une coloration TRAP et d’une visualisation. Les images représentatives montrent un manque de cellules TRAP+ dans le sous-ensemble CD14+ (rouge) et de pré-CO et OC TRAP+ mononucléés et multinucléés dans le sous-ensemble CD14− (bleu). Barres d’échelle: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> Figure 5 : Essais pour évaluer la fonction des CO matures. Pour évaluer la fonction des CO matures, les cellules CD14+ isolées des PBMC ont été cultivées soit avec du M-CSF (M) seul, soit avec du RANKL(R) pendant 7 jours, les CO ont été enrichis par cytométrie en flux et les CO ont ensuite été traités avec l’inhibiteur roténone pendant 24 h. (A) Les CO matures ont été triés par cytométrie de flux (CD14−OSCAR+) et ont été cultivées sur une surface d’essai minéral en présence ou en l’absence de roténone pendant 3 jours, après quoi les cellules ont été blanchies et imagées à 10x pour révéler la zone résorbée (fosses de résorption en blanc). (A) Images représentatives reconstruites de puits. Barres d’échelle: 1000 μm. (B) La quantification du pourcentage de surface résorbée. Les données en (B) ont été analysées avec une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaisons multiples de Dunn (n = 7); * P ≤ 0,05 et** P ≤ 0,01. Les barres d’erreur montrent la moyenne ± écart-type. (C) Teneur totale en ATP intracellulaire des CO matures indifférenciés et différenciés du jour 7 différenciés avec RANKL et traités avec le véhicule ou la roténone (10 nM et 30 nM). Ici, le 2DG et l’oligomycine ont été utilisés comme témoins positifs pour le test et ont été ajoutés 30 minutes avant la lyse cellulaire et la quantification de l’ATP. Les barres d’erreur indiquent la moyenne ± ET (n = 4). Les données ont été analysées avec une ANOVA unidirectionnelle et le test de comparaison multiple de Dunnett pour les données appariées. ** P ≤ 0,01. (D) Une image représentative 20x des CO matures colorés pour la formation du cycle actine (rouge) et des noyaux (bleu), montrant la perte du cycle actine avec l’inhibiteur. Barres d’échelle: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Format de plaque</td>
			<td>96 puits-plaque</td>
			<td>48 puits-plaque</td>
			<td>24 puits-plaque</td>
			<td>12 plaques de puits</td>
			<td>6 plaques de puits</td>
		</tr><tr><td>volume</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225 à 250 μL</td>
			<td>450 à 500 μL</td>
			<td>0,8 à 1 mL</td>
			<td>1,8 à 2 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Volume de la suspension cellulaire pour différents formats de plaques. Les volumes sont calculés à partir d’une solution 1 x 106 cellules/ml et fournissent une densité optimale pour la fusion cellule-cellule.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Fluorophore, clone</td>
			<td>Volume (μL) par 106 cellules</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/Cyanine7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Tampon de tri cellulaire</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Solution de mélange principal d’anticorps. 
Figure supplémentaire 1 : coloration TRAP de la relation dose-réponse RANKL. Les monocytes CD14+ ont été enrichis magnétiquement, plaqués à 1 x 105 cellules/puits dans des plaques de 96 puits, et incubés pendant une nuit avec 25 ng/ml de m-CSF, comme le montre la figure 2. Des images représentatives de la coloration TRAP montrent des monocytes amorcés par MCSF stimulés par des concentrations croissantes de RANKL (1 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL et 100 ng / mL), fixés et colorés pour TRAP le jour 7. Barres d’échelle: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 2 : Coloration de l’anneau agissante dans les CO entièrement différenciés. (A) Un grossissement 10x des CO différenciés sur du plastique TC et colorés avec de la phalloïdine AF647 (en rouge). Barre d’échelle : 400 μm. (B) Un grossissement 40x des CO différencié sur des lames de chambre en verre et coloré avec de la phalloïdine AF488 (en jaune). Barre d’échelle: 100 μm.Les noyaux sont colorés au DAPI, représenté en bleu en (A) et en cyan en (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire 3 : Effet de différents lots FBS sur l’efficacité de la différenciation du CO. Les CO ont été différenciés des monocytes CD14+ en présence de 25 ng/mL DE M-CSF et de 50 ng/mL RANKL (MR) pendant 7 jours. Les puits de contrôle ne contenaient que du M-CSF (M). (A) grossissements représentatifs de 10x (barres d’échelle: 400 μm) et (B) quantification des CO colorés par TRAP différenciés d’un donneur dans deux lots différents de FBS. Les barres d’erreur montrent la moyenne ± SD de trois répétitions techniques. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Les ostéoclastes sont des cellules clés qui résorbent les os dans le corps. Ce protocole décrit une méthode fiable pour la différenciation in vitro des ostéoclastes des monocytes du sang périphérique humain. Cette méthode peut être utilisée comme un outil important pour mieux comprendre la biologie des ostéoclastes dans l’homéostasie et dans les maladies.

Différenciation des ostéoclastes fonctionnels des monocytes CD14+ du sang périphérique humain

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0.Notre protocole décrit une méthode optimisée et reproductible pour générer de l’ostéoclaste in vitro qui peut être utilisée pour étudier les mécanismes sous-jacents à leur processus de différenciation et à leur fonctionnalité. Le principal avantage de cette technique est la capacité de générer un nombre élevé d’ostéoclastes fonctionnellement actifs en seulement une semaine. Un rendement de différenciation élevé est obtenu en utilisant des monocytes purifiés et en ajoutant des cytokines à temps.Les ostéoclastes sont responsables de la destruction osseuse dans toutes les formes d’arthrite, et cette méthode fournit les outils pour cribler de nouveaux composés thérapeutiques qui peuvent moduler leur différenciation et / ou leurs fonctions. Patricia Riedlova, doctorante de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, isolez les PBMC en transférant le sang dans un nouveau tube de 50 millilitres.Diluez-le avec du PBS stérile dans un volume égal pour le sang frais, ou un rapport de 1:3 pour les cônes leucocytaires et les manteaux leucocytaires. Mélanger délicatement le sang par inversion. Préparez des tubes de 15 millilitres contenant trois millilitres de milieu de gradient de densité et déposez lentement huit à 10 millilitres de sang dilué sur le dessus du milieu de gradient de densité, en évitant de mélanger.Centrifuger le tube à 400 x g pendant 30 minutes à température ambiante sans frein. Ensuite, jetez soigneusement la couche supérieure avec une pipette Pasteur. Recueillez la couche interphasée inférieure contenant les PBMC et transférez cette couche dans un nouveau tube de 50 millilitres.Suspendre les cellules jusqu’à 50 millilitres avec du PBS stérile et laver le milieu de gradient de densité résiduelle en centrifugeant à 300 x g pendant 10 minutes à température ambiante avec le frein à fond. Pour éliminer les plaquettes résiduelles, répétez le processus de centrifugation décrit dans le manuscrit, remettez en suspension les PBMC isolés et purifiés dans 20 millilitres de PBS et comptez-les à l’aide d’un hémocytomètre en suivant la méthode standard. Pour enrichir les monocytes CD14+, transférer 1 x 10 aux septièmes PBMC dans un tube à fond rond en polystyrène approprié et enduire les cellules à 300 x g pendant cinq minutes.Après avoir jeté le surnageant et remis en suspension la pastille cellulaire dans un tampon de séparation cellulaire, incuber les cellules avec 10 microlitres de cocktail d’anticorps par 100 microlitres avec le couvercle pendant 10 minutes. À la fin de l’incubation, ajoutez 10 microlitres de billes de nanoparticules magnétiques par 100 microlitres et incuber pendant trois minutes avec le couvercle. Complétez le volume à 2,5 millilitres avec le tampon de séparation cellulaire.Placez le tube dans un aimant et incuber pendant trois minutes avec le couvercle enlevé. Maintenant, jetez la population de cellules négatives avec un mouvement continu par inversion alors que le tube est encore dans l’aimant. Retirez le tube de l’aimant, Lavez les monocytes CD14+ enrichis attachés aux billes magnétiques en les remettant en suspension dans 2,5 millilitres du tampon de suspension cellulaire et replacez le tube dans l’aimant.Comptez les cellules isolées comme démontré précédemment. Centrifuger les cellules collectées à 300 x g pendant cinq minutes. Après avoir éliminé le surnageant, remettre les cellules en suspension à 1 million de cellules par millilitre dans un milieu essentiel alpha minimum complet avec 10% FBS.Pour différencier l’ostéoclaste, ajouter du M-CSF à une concentration finale de 25 nanogrammes par millilitre à la suspension cellulaire et mélanger en pipetant soigneusement pour homogénéiser la suspension cellulaire. Plaque de 100 microlitres de suspension par puits dans une plaque à fond plat de 96 puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’eau distillée stérile par puits autour des cellules plaquées pour éviter l’évaporation du milieu et les effets de bord dans le système de culture.Incuber les cellules pendant la nuit pendant environ 18 à 20 heures à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Préparer des milieux frais complétés par du M-CSF et du ligand RANK. Après l’incubation, retirer délicatement la moitié du milieu par aspiration à l’aide d’une pipette P200 et la remplacer par un milieu complet frais et chaud complété par du M-CSF et du ligand RANK à une concentration finale de 25 nanogrammes par millilitre.Différencier les cellules en ostéoclastes pendant sept à 14 jours avec un remplacement complet du milieu tous les trois jours. Après avoir retiré le milieu, fixez les ostéoclastes adhérents différenciés avec 100 microlitres par puits de la solution fixatrice préparée et incuber pendant une minute. Ne touchez pas le fond des puits pour éviter de rayer les cellules adhérentes.Une fois les puits lavés trois fois avec 300 microlitres d’eau distillée stérile, séchez les plaques et ajoutez 100 microlitres de solution de coloration fraîchement préparée à chaque puits. Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius dans l’obscurité pendant 20 minutes. Après l’incubation, retirer la solution de coloration par inversion et laver la plaque trois fois avec 300 microlitres par puits d’eau distillée.Enlevez l’excès d’eau en tapotant les assiettes sur des serviettes en papier et laissez les assiettes ouvertes et protégées de la lumière à l’air pendant la nuit. À l’aide d’un microscope à fond clair avec une option de tuiles, prenez des images à 10x ou 20x pour capturer toute la surface du puits. Comptez manuellement les ostéoclastes identifiés comme des cellules colorées TRAP+violet avec plus de trois noyaux à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images avec un plugin de compteur de cellules.Plaquer 100 microlitres des monocytes CD14+ isolés par puits dans une lame de chambre de 18 puits à une densité cellulaire de 1 x 10 jusqu’à la cinquième cellule par puits. Différencier les ostéoclastes en présence de M-CSF et de ligand RANK comme démontré précédemment avec un changement complet de milieu tous les trois jours. À la fin, retirez doucement le milieu et lavez chaque puits deux fois avec 200 microlitres de PBS préchauffé à pH 7,4.Ne laissez pas les puits sécher entre les étapes. Fixer l’échantillon avec 100 microlitres par puits de solution de formaldéhyde à 4% dans du PBS et incuber pendant 10 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital en agitant doucement. Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres par puits de PBS.Perméabiliser les cellules avec 100 microlitres par puits de solution de Triton x-100 à 0,1% diluée dans du PBS et incuber pendant 10 minutes comme indiqué précédemment. Laver deux fois avec 200 microlitres par puits de PBS. Pour bloquer la liaison non spécifique et augmenter le signal, ajoutez 100 microlitres de solution de blocage à base d’albumine sérique bovine à 2% et de solution PBS.Incuber pendant 20 minutes à température ambiante sur un agitateur orbital en agitant doucement. Après avoir retiré la solution de blocage, ajouter 100 microlitres de solution de phalloïdine conjuguée par fluorescence diluée dans une solution BSA/PBS à 2 % dans chaque puits. Laver deux fois avec 200 microlitres par puits de PBS.Colorer les noyaux avec 100 microlitres par puits d’une solution de PBS contenant 300 nanomolaires DAPI. Après 10 à 15 minutes, retirez la solution DAPI et remplacez-la par du PBS de 100 microlitres par puits. Visualisez la coloration à l’aide d’immunofluorescence appropriée ou de microscopes confocaux à quatre à 40x.Les ostéoclastes matures sont définis comme des cellules nucléées multiples TRAP+. L’ajout du ligand RANK a produit un nombre croissant de grands ostéoclastes TRAP+multinucléés de manière dose-dépendante. La cinétique de la différenciation des ostéoclastes des monocytes a été étudiée sur une période de culture de deux à 14 jours.Les ostéoclastes multinucléés étaient visibles dès le cinquième jour, et une différenciation optimale a été atteinte le septième jour. La différenciation des ostéoclastes sur des surfaces minéralisées permet d’évaluer leur activité de résorption en analysant la formation de trous ronds, ou fosses de résorption. Le pourcentage de résorption augmente significativement en présence de M-CSF et de ligand RANK par rapport au M-CSF seul.De plus, le traitement à la roténone en fonction de la dose a inhibé la résorption de la surface minéralisée par rapport au puits témoin non traité. L’inhibition roténone-dépendante de la résorption des ostéoclastes était associée à l’inhibition de la production d’ATP. La fragmentation de l’anneau actine dérivé du ligand RANK de l’OCS mature a été observée en présence de roténone.Il est important de s’assurer que les monocytes enrichis ne contiennent pas de plaquettes, que les cellules sont plaquées à la bonne densité et que les puits environnants sont remplis d’eau pour éviter l’effet de bord. Ce protocole est particulièrement utile pour interroger mécaniquement comment les ostéoclastes se forment et ce qui influence leur fonctionnalité à la fois en science fondamentale et translationnelle. Par exemple, en utilisant des composés ou des protéines qui peuvent moduler ces processus.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, purification et d&#39;évaluation fonctionnelle des cellules NK humaines périphérique Sang

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

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Immunologie et infection

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

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Expansion du sang périphérique humain cellules T γδ utilisant zolédronate

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Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Imagerie quantitative de Lineage spécifiques Toll-like Receptor la signalisation médiée par les monocytes et les cellules dendritiques à partir de petits échantillons de sang humain

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Détection glycogène dans les cellules mononucléaires du sang périphérique avec l&#39;acide périodique Schiff coloration

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