Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Die Autoren danken der Flow Core Facility und der Glasgow Imaging Facility (GIF) innerhalb der School of Infection and Immunity für ihre Unterstützung und Hilfe bei dieser Arbeit.

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Die einfache Kultivierung und Isolierung einer großen Anzahl funktioneller OCs in vitro ist wichtig, um das Verständnis der Knochenbiologie und der OC-vermittelten Erkrankungen zu verbessern. Klassischerweise wurden OCs in Kokulturen mit Osteoblasten oder Stromazellen und hämatopoetischen Zellen aus der Milz oder dem Knochenmark erzeugt38,39. Ein bedeutender Durchbruch im Verständnis der Osteoklastogenese war die Identifizierung von RANKL als Hauptregulator der OC-Bildung, -Differenzierung und -Überleben40. Frühe Protokolle von RANKL-abhängigen Kultursystemen verwendeten PBMCs für die OC-Generation21,41,42. Diese Mischkulturen sind jedoch langwierig und weisen viele Störfaktoren auf, die die Möglichkeit einschränken, die direkten Auswirkungen auf die Differenzierung und Funktion von OC zu testen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes und zuverlässiges In-vitro-Modell der Osteoklastogenese aus humanen peripheren CD14+-Monozyten, bei dem eine optimale Osteoklastogenese innerhalb von 7 Tagen erreicht werden kann (Abbildung 1 und Abbildung 2), was im Vergleich zu einigen anderen Protokollen erheblich schneller ist 43,44,45,46. Die wichtigsten Unterscheidungsmerkmale dieses Protokolls sind (1) die Verwendung von gereinigten CD14+-Monozyten, (2) das Priming der Monozyten mit M-CSF vor der Exposition mit RANKL, (3) die Länge der Kultur (<7 Tage) und (4) der zuverlässige Nachweis der Hemmung der OC-Bildung (TRAP-Färbung) und der Funktion (Resorption, ATP-Produktion, Aktinringreorganisation) mit Inhibitoren. 
Bei der Optimierung der Methodik wurden mehrere kritische Punkte identifiziert. Es konnte beobachtet werden, dass die in vitro Differenzierung von OCs stark von der Saming-Dichte der CD14+ Monozyten abhängt. Daher werden in diesem Protokoll die Zellen mit einer hohen Dichte ausgesät (1 x 105 Zellen/Well einer 96-Well-Platte, in 100 μl Medium), da es für die Zellen unerlässlich ist, miteinander interagieren zu können und sich in der Nähe zu befinden, um zu fusionieren und zu reifen OCs zu werden. In ähnlicher Weise schränkt die Aussaat von Zellen mit einer zu hohen Dichte ihre Differenzierung und ihr Wachstum aufgrund mittlerer Einschränkungen und des Mangels an benötigtem Platz ein. Um mit diesem Protokoll maximalen Erfolg zu erzielen, ist es außerdem wichtig, die Dichtegradiententrennung sorgfältig durchzuführen und sicherzustellen, dass die angereicherte Population von CD14+-Zellen so rein wie möglich ist. So führen z.B. unzureichende Waschschritte zu einer mangelnden Entfernung der Blutplättchen, was folglich die Differenzierung der OC hemmt47,48. In ähnlicher Weise kann das Vorhandensein einer geringfügigen T-Zell-Kontamination in isolierten CD14+-Präparaten, die allein mit M-CSF stimuliert werden, zu einer OC-Differenzierung führen, möglicherweise über die RANKL-Sekretion durch T-Zellen49. Daher ist es wichtig, für jedes Experiment eine M-CSF-Kontrolle einzubauen. Eine routinemäßige Reinheitsprüfung, insbesondere bei Verwendung eines neuen Isolationskits, wird ebenfalls empfohlen, um die Reinheit der Probe sicherzustellen.
Optimale OC-Zahlen (Bereich: ~200-1.600 OCs/Well) werden mit α-MEM-Medium erreicht, das mit Nukleosiden und L-Glutamin angereichert ist. Andere konventionelle Nährmedien, darunter das modifizierte Adlermedium (DMEM) von Dulbecco und das Medium 1640 des Roswell Park Memorial Institute (RPMI), beeinflussen die OC-Ausbeute. Die Quelle von FBS kann auch die Osteoklastogenese beeinflussen. Unterschiedliche FBS-Chargen können zu einer reduzierten RANK-L-abgeleiteten Osteoklastogenese sowie zum Auftreten einer geringen Anzahl von mehrkernigen TRAP+ -Zellen in den M-CSF-Kontrollen führen (ergänzende Abbildung 3). Um konsistente Ergebnisse zu erzielen, wird daher empfohlen, neue FBS-Chargen vor der Verwendung zu testen und während der gesamten Experimente mit derselben Charge fortzufahren, um Schwankungen im Differenzierungsprozess zu minimieren. Darüber hinaus stellt die Variabilität von Spender zu Spender in Bezug auf die Gesamtzahl der differenzierten OCs, die zum Endzeitpunkt erhalten wurden, eine Einschränkung dar, wenn dieses Protokoll verwendet wird, um z. B. gesunde Spender mit Patienten zu vergleichen. In diesen Fällen ist es zwingend erforderlich, genau die gleichen Bedingungen und die gleiche Charge von Medium, FBS und anderen Reagenzien zu verwenden.
Ein weiterer notwendiger Schritt für eine optimale OC-Differenzierung und -Reifung ist das Priming der Monozyten mit M-CSF vor der RANKL-Zugabe. Die Exposition der Zellen bei M-CSF 18-24 h vor RANKL bereitet die Monozyten darauf vor, die RANK-Expression hochzuregulieren15,26. Die Zugabe von RANKL zu diesem Zeitpunkt sorgt für eine optimale OC-Differenzierung in dosisabhängiger Weise. Der Grad der OC-Differenzierung variiert von Spender zu Spender; 25 ng/ml RANKL sind jedoch in der Regel ausreichend, um bei den meisten Spendern eine hohe Anzahl von OCs zu differenzieren. Darüber hinaus kann 25 ng/ml RANKL in Assays für das erste Screening von Verbindungen verwendet werden, da es die Bewertung sowohl der verstärkenden als auch der hemmenden Wirkung der Testverbindungen erleichtert. Andere Kultursysteme haben längere M-CSF-Vorinkubationszeiten vor der RANKL-Zugabe verwendet, was jedoch zu einer längeren Kultivierungszeit für die Osteoklastogenese führt50. Wenn man die geprimten Monozyten über Nacht inkubieren lässt, können sie sich außerdem an die Platte anheften, wenn auch nicht in einem vollständig haftenden Zustand. Daher muss bei der erstmaligen Einführung von RANKL das Medium sehr vorsichtig halb gewechselt werden, anstatt es vollständig zu verändern, um die Ablösung und den Verlust der geprimten Monozyten zu verhindern. Das Medium muss auch alle 3-4 Tage aufgefrischt werden, um eine Erschöpfung des Mediums zu vermeiden und den Zelltod zu verhindern. Darüber hinaus ist es aufgrund des geringen Volumens, das in diesem Assay verwendet wird (100 μL/Well in einer 96-Well-Platte), von größter Bedeutung, einen Rahmen aus leeren Wells zu haben, die mit einer wässrigen Lösung (d. h. steril destilliertem H2O oder PBS) um die Assay-Wells herum gefüllt sind. Dadurch werden Mediumverdunstung und Kanteneffekte vermieden.
Schließlich ist es für metabolische Assays (z. B. ATP-Assays) unerlässlich, dass die Zellen lebensfähig sind, um eine große Standardabweichung zwischen den Replikaten zu vermeiden (Abbildung 5). Eine hohe Viabilität der Zellen ist auch für die Sortierung der Zellen und für die weitere Kultivierung der sortierten OCs wichtig (Abbildung 4). Diese Methode weist jedoch einige Einschränkungen auf. Voll ausgereifte OCs sind sehr haftend und lassen sich nur schwer von den Platten lösen. Die größeren OCs lassen sich oft nicht ablösen, was zu einer geringeren Zellausbeute führen kann. Daher müssen die Zellen nach der Sortierung und vor dem Ausplattieren in der erforderlichen Konzentration gezählt werden. Darüber hinaus wird im vorliegenden Protokoll eine nicht-enzymatische Methode (Accutase) zur Ablösung der OCs verwendet, um Membranveränderungen bei der nachgeschalteten Oberflächenfärbung für die Durchflusszytometrie zu verhindern. Die Verwendung von Zellschaber (sowohl mit weichen als auch mit harten Enden) wurde ebenfalls getestet und führte zu einem hohen Zelltod. Die enzymatische Ablösung mit 0,05%igen Trypsin/EDTA-Lösungen kann für eine höhere Ausbeute an abgelösten OCs verwendet werden, wenn die Membranintegrität für nachgeschaltete Anwendungen nicht erforderlich ist. Um zu verhindern, dass die OCs verklumpen, wird außerdem dringend empfohlen, nach der Zellablösung eine hohe Konzentration von EDTA in allen Puffern sowie eine geeignete Filterung vor der durchflusszytometrischen Erfassung zu verwenden. Es ist wichtig zu beachten, dass OC-Kulturen eine heterogene Population von Zellen sind, die aus reifen OCs, OC-Vorläufern und Makrophagen besteht. Makrophagen können leicht von OCs unterschieden werden, obwohl sowohl mononukleäre prä-OCs als auch multinukleäre OCs OSCAR exprimieren und mit der vorliegenden Methode nicht unterschieden werden können (Abbildung 4). Letzteres stellt in der Tat die Haupteinschränkung dieser Methode dar. Darüber hinaus ist eine geringe Expression von OSCAR auch in M-CSF-Kulturen vorhanden (Abbildung 4B) und könnte auf Makrophagen hindeuten, die für die OC-Linienbindung vorbereitet sind. Es ist wichtig, das Gate für OSCAR+ -Zellen basierend auf dem FMO-Färbesignal festzulegen, wie in Abbildung 4B dargestellt.
Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine optimierte und robuste Methode zur effizienten Herstellung aktiver und funktionell reifer OCs aus zirkulierenden primären humanen Monozyten. Die Stärke dieses Protokolls liegt in seiner Fähigkeit, OCs in kurzer Zeit zu generieren und eine große Anzahl differenzierter OCs zu erhalten. Diese Methode eröffnet den Weg, um die grundlegenden Mechanismen zu untersuchen, die der Differenzierung und Funktion von OC zugrunde liegen.

Osteoklasten (OCs) sind mehrkernige Riesenzellen hämatopoetischer Abstammung mit einer einzigartigen Fähigkeit, Knochen zu resorbieren. Sie sind verantwortlich für die Entwicklung und den kontinuierlichen Umbau des Skeletts 1,2. In den skelettalen Entwicklungsphasen leiten sich OCs und geweberesidente Makrophagen von erythromyeloischen Vorläuferzellen ab und besiedeln die Knochennische und das Organgewebe. Unter physiologischen Bedingungen sind erythromyeloische Vorläuferzellen für eine normale Knochenentwicklung und einen Zahndurchbruch erforderlich, während der Zustrom zirkulierender Blutmonozyten in die Knochennische für die postnatale Aufrechterhaltung der OCs, der Knochenmasse und der Knochenmarkhöhle sorgt3. Unter pathologischen Bedingungen werden Monozyten an Orte aktiver Entzündung rekrutiert und können zur pathologischen Knochenzerstörung beitragen 4,5.
Bei Patienten mit verschiedenen Formen von Arthritis kommt es zu einer Gelenkentzündung, die zu einer fortschreitenden Gelenkzerstörung führt, die durch OCs verursachtwird 6. Bei rheumatoider Arthritis (RA) beispielsweise sind überaktivierte OCs für pathologische Knochenerosion und Gelenkzerstörung verantwortlich7,8, und die derzeitigen Behandlungen verbessern oder stoppen die Knochenschädigung oft nicht9,10,11. Veränderungen der zirkulierenden Monozyten sowohl in Bezug auf die Populationsverteilung als auch auf die transkriptomischen und epigenetischen Signaturen wurden bei RA-Patienten berichtet12,13,14. Darüber hinaus wurde berichtet, dass veränderte Monozytenantworten auf Entzündungsstimulation die Osteoklastogenese bei RA-Patienten mit aktiver Erkrankung beeinflussen15,16,17.
Die Differenzierung von OCs ist ein komplexer mehrstufiger Prozess, bei dem myeloische Vorläuferzellen an die Differenzierung in OC-Vorläuferzellen gebunden werden. Während der Osteoklastogenese werden OCs durch Zell-Zell-Fusion, unvollständige Zytokinese und einen Kernrecyclingprozess, der als Spaltung und Fusion bezeichnet wird, riesig und mehrkernig18,19,20. Die Fähigkeit, OCs in vitro zu differenzieren, hat zu bedeutenden Fortschritten im Verständnis der Knochenbiologie geführt21. OCs unterscheiden sich von Vorstufen durch Exposition gegenüber dem Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und dem Rezeptoraktivator des Kernfaktors kappa-B-Liganden (RANKL). Letzteres ist essentiell für die normale Entwicklung und Funktion von OCs in vitro und in vivo, auch unter entzündlichen Bedingungen6,22,23. RANKL wird durch Osteoblasten und Osteozyten sowie durch aktivierte T-Zellen und Fibroblasten in der entzündeten RA-Synoviapräsentiert 2,24,25. Während des OC-Differenzierungsprozesses regulieren Monozyten, die M-CSF ausgesetzt sind, den Rezeptoraktivator des nukleären Faktors kappa-B (RANK)-Expression auf ihrer Zellmembran hoch und differenzieren sich unter anschließender Stimulation mit RANKL in Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP)-positive mononukleäre prä-OCs und dann in mehrkernige OCs15,26. OCs produzieren mehrere Enzyme, das wichtigste unter ihnen ist TRAP, das den Abbau von Phosphoproteinen im Knochenermöglicht 27. Ein Regulator und Marker der OC-Differenzierung ist der OC-assoziierte Rezeptor (OSCAR). Es wird früh in Vorläuferzellen hochreguliert, die sich an die OC-Linie binden28. Reife riesige, mehrkernige OCs können die Skelettmatrix abbauen (resorbieren), indem sie eine große Versiegelungszone erzeugen, die aus einem Aktinring besteht, der einen gekräuselten Randumgibt 21,29,30. Die Knochenresorptionsfähigkeit von OCs erfordert eine Reorganisation des Zytoskeletts und die daraus resultierende Polarisation und Bildung einer gewundenen Membran, der sogenannten gekräuselten Grenze. Der gekräuselte Rand ist von einem großen kreisförmigen Band einer F-Aktin-reichen Struktur umgeben, das den Aktinring oder die Dichtungszone darstellt. Die Integrität des Aktinrings ist für OCs essentiell, um Knochen sowohl in vitro als auch in vivo zu resorbieren, und eine fehlerhafte Bildung von gekräuselten Rändern ist mit der Expression der niedervakuolären Adenosintriphosphatase (V-ATPase) assoziiert31,32,33. Darüber hinaus sind OCs mitochondrienreiche Zellen, und Adenosintriphosphat (ATP) assoziiert mit mitochondrialen Strukturen in OCs, die an der gekräuselten Grenze lokalisiert sind31,32,33. Rotenon wirkt als starker Inhibitor des mitochondrialen Komplexes I und beeinflusst die ATP-Produktion. Es wurde auch gezeigt, dass Rotenon die Differenzierung und Funktion von OC hemmt34.
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und optimierte Methode der in vitro Osteoklastogenese aus humanen peripheren Blutproben. Im peripheren Blut des Menschen sind CD14+-Monozyten die Hauptquelle für OCs15,35,36. In diesem Protokoll wurden die Kinetik der Exposition und die Konzentrationen von M-CSF und RANKL für eine optimale Osteoklastogenese angepasst. Mononukleäre Zellen werden zunächst durch einen Dichtegradienten von den im Vollblut vorhandenen Erythrozyten und Granulozyten getrennt; Sie werden dann durch positive Selektion durch magnetische Beads für CD14+-Monozyten angereichert. Die isolierten CD14+ Monozyten werden dann über Nacht mit M-CSF inkubiert. Dies bereitet die Monozyten darauf vor, die Expression von RANK15,26 hochzuregulieren. Die anschließende Zugabe von RANKL induziert zeitabhängig die Osteoklastogenese und Multinukleation. Aktiv resorbierende OCs zeigen die charakteristische Verteilung von F-Aktin-Ringen am Rand der Zellmembran30,32 und die Färbung für TRAP. Reife OCs werden durch Quantifizierung von mehrkernigen TRAP+-Zellen (mehr als drei Kerne) analysiert. Die funktionelle Leistungsfähigkeit reifer OCs kann anhand ihrer Resorption, Aktinringintegrität und ATP-Produktion beurteilt werden. Darüber hinaus können differenzierte CD14− OSCAR+ OCs angereichert und verwendet werden, um die Auswirkungen bestimmter Verbindungen auf die OC-Funktionalität über Mineral- (oder Dentin-) Resorption und F-Aktin-Organisation zu bewerten. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit ein bekannter OC-Inhibitor, Rotenon, als Beispiel für eine Verbindung verwendet, die die Funktionalität von OCs beeinflusst. Eine verminderte OC-Resorptionsaktivität unter Rotenon ist mit einer verminderten ATP-Produktion und Aktinringfragmentierung verbunden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll einen robusten Assay etabliert, der als Referenzmethode verwendet werden kann, um verschiedene biologische Aspekte der OC-Differenzierung und -Funktion in vitro zu untersuchen.
Diese Methodik kann verwendet werden, um (1) das Potenzial zirkulierender Monozyten zur Differenzierung in OCs in Gesundheit und Krankheiten sowie (2) den Einfluss von therapeutischen Kandidaten auf die OC-Differenzierung und -Funktion zu bewerten. Dieses robuste Osteoklastogenese-Protokoll ermöglicht die Bestimmung der Wirksamkeit und der Mechanismen knochenspezifischer Therapien sowohl auf die Differenzierung von OC aus Vorläuferzellen als auch auf die Funktion reifer OCs.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Osteoklasten (OCs) sind knochenresorbierende Zellen, die eine zentrale Rolle bei der Skelettentwicklung und dem Knochenumbau von Erwachsenen spielen. Mehrere Knochenerkrankungen werden durch eine verstärkte Differenzierung und Aktivierung von OCs verursacht, so dass die Hemmung dieser Pathobiologie ein zentrales therapeutisches Prinzip ist. Zwei Schlüsselfaktoren treiben die Differenzierung von OCs von myeloischen Vorläufern voran: der Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (M-CSF) und der Rezeptoraktivator des nukleären Faktors kappa-B-Liganden (RANKL). Es ist seit langem bekannt, dass sich humane zirkulierende CD14+ -Monozyten in vitro in OCs differenzieren. Die Belichtungszeit und die Konzentration von RANKL beeinflussen jedoch die Differenzierungseffizienz. In der Tat wurden Protokolle für die Erzeugung von humanen OCs in vitro beschrieben, die jedoch oft zu einem schlechten und langwierigen Differenzierungsprozess führen. Hierin wird ein robustes und standardisiertes Protokoll zur zeitnahen Generierung funktionell aktiver, reifer humaner OCs bereitgestellt. CD14+ Monozyten werden aus humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) angereichert und mit M-CSF geprimt, um RANK hochzuregulieren. Eine anschließende Exposition gegenüber RANKL erzeugt dosis- und zeitabhängig OCs. OCs werden durch Färbung mit Tartratsäure-resistenter Phosphatase (TRAP) und lichtmikroskopischer Analyse identifiziert und quantifiziert. Die Immunfluoreszenzfärbung von Zellkernen und F-Aktin wird verwendet, um funktionell aktive OCs zu identifizieren. Darüber hinaus werden OSCAR+CD14− -reife OCs durch durchflusszytometrische Zellsortierung weiter angereichert und die OC-Funktionalität durch Mineral- (oder Dentin-/Knochen-) Resorptionsassays und Aktinringbildung quantifiziert. Schließlich wird ein bekannter OC-Inhibitor, Rotenon, bei reifen OCs eingesetzt, was zeigt, dass die Produktion von Adenosintriphosphat (ATP) für die Integrität des Aktinrings und die OC-Funktion unerlässlich ist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit ein robuster Assay zur Differenzierung einer hohen Anzahl von OCs etabliert wird, der in Kombination mit Aktinringfärbung und einem ATP-Assay ein nützliches in vitro Modell darstellt, um die OC-Funktion zu bewerten und nach neuen therapeutischen Verbindungen zu suchen, die den Differenzierungsprozess modulieren können.

OC-Generierung aus CD14+ Monozyten Diese Methode zielte darauf ab, eine große Anzahl von OCs aus humanen CD14+-Monozyten im peripheren Blut in vitro, typischerweise innerhalb von 1 Woche, leicht zu unterscheiden. Zunächst wurden CD14+-Monozyten aus PBMCs angereichert und über Nacht mit M-CSF geprimt, um RANK hochzuregulieren, wie bereits berichtetwurde 15. Um nach dem Monozyten-Priming die optimale Konzentration von RANKL für die OC-Differenzierung und -Reifung zu bestimmen, wurden RANKL-Konzentrationen von 1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml und 100 ng/ml zusammen mit 25 ng/ml m-CSF verwendet. Die Zugabe von RANKL führte zu einer zunehmenden Anzahl großer TRAP-positiver mehrkerniger OCs in dosisabhängiger Weise, was mittels TRAP-Färbung untersucht wurde. Reife OCs sind definiert als TRAP-positive Zellen mit mehreren Kernen (typischerweise mehr als drei; Abbildung 2A,B und ergänzende Abbildung 1). Des Weiteren wurde die Kinetik der OC-Differenzierung von Monozyten mittels TRAP-Färbung und Lichtmikroskopie über einen Kulturzeitraum von 2-14 Tagen untersucht. In diesem Fall wurde eine OC-Differenzierung mit einer mittleren Konzentration von 50 ng/ml RANKL gewählt, um zu beurteilen, wie schnell sich OCs in Kultur differenzieren. Unter diesen Kulturbedingungen waren ab Tag 5 mehrkernige OCs sichtbar, und eine optimale Differenzierung wurde an Tag 7 erreicht (Abbildung 2C). Die verlängerte Inkubation von Kulturen über 10 Tage auf Kunststoffen hinaus führte zu abnorm riesigen fusionierten Zellen. In diesem Protokoll werden in der Regel die Tage 6-8 als optimaler Endpunkt der OC-Generierung verwendet. Die OCs können quantifiziert oder für Downstream-Assays verwendet werden.
Funktionelle Bewertung differenzierter OCs Um die funktionelle Aktivität der erzeugten OCs zu bestimmen, untersuchten wir ihre resorptive Aktivität durch Differenzierung der OCs auf einer mineralisierten Oberfläche. Da große OCs erst nach einer Kulturperiode von 7 Tagen gebildet werden und um genügend Zeit für die Resorption des Mineralsubstrats zu haben, wurden die Kulturen bis zum 10. Tag beibehalten. Die Bildung von runden Löchern oder Resorptionsgruben wurde nur auf den mineralisierten Oberflächen von Bohrlöchern beobachtet, die Zellen enthielten, die sowohl mit M-CSF als auch mit RANKL behandelt worden waren (Abbildung 3). Der prozentuale Anteil der gelösten mineralisierten Oberfläche (Resorptionsgruben) ermöglicht somit die Bestimmung der OC-Resorptionskapazität. Darüber hinaus zeigten die OCs, die nach diesem Protokoll bis Tag 7 differenziert wurden, sowohl auf Kunststoff- als auch auf Glaskammerobjektträgern, eine gut organisierte Aktinringstruktur, die durch Immunfluoreszenzfärbung sichtbar gemacht werden konnte (ergänzende Abbildung 2).
Wirkung eines Inhibitors auf die reife OC-Funktion Die oben genannten Kultivierungsbedingungen wurden genutzt, um die funktionelle Leistungsfähigkeit der in vitro erzeugten OCs in Gegenwart des bekannten OC-Inhibitors Rotenon34 zu bestimmen. Die OCs wurden für 6-8 Tage differenziert und CD14−OSCAR+ OCs und OC-Vorstufen mittels Durchflusszytometrie angereichert (Abbildung 4). Die angereicherten Zellen wurden dann mit 50.000 Zellen/pro Well für 3 Tage auf eine mineralbeschichtete 96-Well-Platte in pro-osteoklastogenem Medium (25 ng/mL M-CSF und RANKL) plattiert. Die Behandlung mit Rotenon (Abbildung 5A,B) hemmte dosisabhängig die Resorption der mineralisierten Oberfläche im Vergleich zur unbehandelten Kontrollbohrung, was mit früheren Studien übereinstimmt34. Zusätzlich wurde die OC-Funktionalität anhand der ATP-Produktion und der Aktinringbildung untersucht. Die Rotenon-abhängige Hemmung der OC-Resorption war mit der Hemmung der ATP-Produktion assoziiert (Abbildung 5C). Resorbierende OCs sind stark polarisierte Zellen, die ihre Resorptionskapazität regulieren, indem sie die Organisation des Zytoskeletts fördern. Alexa Fluor 647 konjugiertes Phalloidin wurde verwendet, um das F-Aktin-Zytoskelett der reifen OCs zu markieren, die in An- oder Abwesenheit von Rotenon kultiviert wurden. Rotenon verursachte die Fragmentierung des RANKL-abgeleiteten Aktinrings der reifen OCs (Abbildung 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> Abbildung 2: OCs, die sich effizient von CD14+ -Monozyten-Vorläufern unterscheiden. CD14+ Monozyten wurden magnetisch angereichert, mit 1 x 105 Zellen /Well in 96-Well-Platten plattiert und über Nacht mit 25 ng/mL M-CSF inkubiert. (A) M-CSF-geprimte Monozyten wurden mit steigenden Konzentrationen von RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml und 100 ng/ml) stimuliert, fixiert und an Tag 7 für TRAP gefärbt. Es wurden Bilder aufgenommen und die mehrkernigen TRAP+ -Zellen (MNCs) gezählt. Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung sind in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Die Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD (n = 3). Die Daten wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA und dem Holm-Sidak-Mehrfachvergleichstest für gepaarte Daten analysiert. * P ≤ 0,05 und ** P ≤ 0,005. (B) Repräsentatives Bild einer TRAP-gefärbten Vertiefung einer 96-Well-Platte, die die typische Menge an erwarteten OCs/Well und deren Morphologie unter 25 ng/mL RANK-L im Vergleich zu M-CSF-abgeleiteten Makrophagen an Tag 7 zeigt. Maßstabsbalken: 1000 μm. (C) Repräsentative Bilder der OC-Bildung unter 50 ng/ml RANKL, bewertet mittels TRAP-Färbung von Tag 2 bis Tag 14. OCs sind ab Tag 5 sichtbar. Riesige, abnorm verschmolzene OCs sind nach 10 Tagen vorhanden. Maßstabsbalken: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> Abbildung 3: Resorptive OCs im Unterschied zu CD14+ Monozyten. CD14+ Zellen, die aus PBMCs isoliert wurden, wurden in Gegenwart von 25 ng/mL M-CSF (M) und RANKL (R) auf Mineralassay-Oberflächenplatten (Osteo-Assay) für 10 Tage in OCs differenziert. (A) Bilder von repräsentativen rekonstruierten Brunnen, die mit 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurden, um die Resorption an Tag 10 zu analysieren (mineralisches Substrat in grau; Resorptionsgruben in weiß). Maßstabsbalken: 1000 μm. (B) Quantifizierung des Prozentsatzes der resorbierten Fläche. Die Resorptionsdaten wurden mit einer Wilcoxon-Paaranalyse analysiert. Die Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> Abbildung 4: Durchflusszytometrische Anreicherung von CD14−OSCAR+ OCs. CD14+ Monozyten wurden aus PBMCs angereichert und die OCs wie zuvor beschrieben differenziert. Adhärente OC-Kulturen wurden mit Accutase abgelöst und für die Durchflusszytometrie gefärbt. (A-C) Die OCs an Tag 8 wurden anhand der CD14- und OSCAR-Expression sortiert. (A) Repräsentative Sortier-Gating-Strategie. Die Zellen wurden als Singuletts gated und negativ für die Totfärbung, und die CD14+ OSCAR+ (rot) und CD14− OSCAR+ (blau) Untergruppen wurden sortiert. (B) Repräsentative Diagramme, die die überlappende OSCAR-Färbung von RANKL-abgeleiteten OCs (cyan) und Kontroll-M-CSF-abgeleiteten Makrophagen (orange) zeigen. In Rot ist die OSCAR-isotypgefärbte Kontrolle von RANKL-abgeleiteten OCs dargestellt. (C) Die sortierten Populationen wurden auf Plastik plattiert und 2 h lang in pro-OC-Medium (25 ng/mL M-CSF und 50 ng/mL RANKL) haften, gefolgt von TRAP-Färbung und Visualisierung. Die repräsentativen Bilder zeigen einen Mangel an TRAP+-Zellen in der CD14+-Untergruppe (rot) und ein- und mehrkernige TRAP+-Prä-OCs und OCs in der CD14−-Untergruppe (blau). Maßstabsbalken: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> Abbildung 5: Assays zur Beurteilung der Funktion reifer OCs. Um die Funktion reifer OCs zu evaluieren, wurden CD14+ Zellen, die aus PBMCs isoliert wurden, entweder mit M-CSF (M) allein oder in Kombination mit RANKL (R) für 7 Tage kultiviert, die OCs mittels Durchflusszytometrie angereichert und die OCs dann 24 h lang mit dem Inhibitor Rotenon behandelt. (A) Reife OCs wurden mittels Durchflusszytometrie (CD14−OSCAR+) und wurden 3 Tage lang auf einer Mineralassay-Oberfläche in An- oder Abwesenheit von Rotenon kultiviert, wonach die Zellen gebleicht und bei 10x abgebildet wurden, um den resorbierten Bereich (Resorptionsgruben in weiß) sichtbar zu machen. (A) Repräsentative rekonstruierte Bilder von Brunnen. Maßstabsbalken: 1000 μm. (B) Die Quantifizierung des Prozentsatzes der resorbierten Fläche. Die Daten in (B) wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Dunn-Mehrfachvergleichstest (n = 7) analysiert; * P ≤ 0,05 und** P ≤ 0,01. Die Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD. (C) Gesamter intrazellulärer ATP-Gehalt von undifferenzierten und am Tag 7 differenzierten reifen OCs, die mit RANKL differenziert und entweder mit Vehikel oder Rotenon (10 nM und 30 nM) behandelt wurden. Hier wurden 2DG und Oligomycin als Positivkontrollen für den Assay verwendet und 30 min vor der Zelllyse und ATP-Quantifizierung zugegeben. Die Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD (n = 4). Die Daten wurden mit einer einfaktoriellen ANOVA und dem Dunnett-Mehrfachvergleichstest für gepaarte Daten analysiert. ** P ≤ 0,01. (D) Ein repräsentatives 20-faches Bild reifer OCs, die auf Aktinringbildung (rot) und Zellkerne (blau) gefärbt wurden, zeigt den Verlust des Aktinrings mit dem Inhibitor. Maßstabsbalken: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plattenformat</td>
			<td>96 Well-Platte</td>
			<td>48 Well-Platte</td>
			<td>24-Well-Platte</td>
			<td>12-Well-Platte</td>
			<td>6-Well-Platte</td>
		</tr><tr><td>Volumen</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225–250 μL</td>
			<td>450–500 μL</td>
			<td>0,8–1 ml</td>
			<td>1,8–2 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Volumen der Zellsuspension für verschiedene Plattenformate. Die Volumina werden ausgehend von einer 1 x 106 Zellen/ ml Lösung berechnet und bieten eine optimale Dichte für die Zell-Zell-Fusion.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Fluorophor, Klon</td>
			<td>Volumen (μL) pro 106 Zellen</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/Cyanin7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Puffer für die Zellsortierung</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2 : Antikörper-Mastermix-Lösung. 
Ergänzende Abbildung 1: TRAP-Färbung der RANKL-Dosis-Wirkungs-Beziehung. CD14+ -Monozyten wurden magnetisch angereichert, mit 1 x 105 Zellen /Well in 96-Well-Platten plattiert und über Nacht mit 25 ng/mL M-CSF inkubiert, wie in Abbildung 2 dargestellt. Repräsentative Bilder der TRAP-Färbung zeigen MCSF-grundierte Monozyten, die mit steigenden Konzentrationen von RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml und 100 ng/ml) stimuliert, fixiert und an Tag 7 für TRAP gefärbt wurden. Maßstabsbalken: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Wirkende Ringfärbung in vollständig differenzierten OCs. (A) Eine 10-fache Vergrößerung von OCs, die auf TC-Kunststoff differenziert und mit AF647-Phalloidin (in rot) gefärbt wurden. Maßstabsleiste: 400 μm. (B) Eine 40-fache Vergrößerung von OCs, die auf Objektträgern aus Glaskammer differenziert und mit AF488-Phalloidin (in gelb) gefärbt wurden. Maßstabsbalken: 100 μm.Die Kerne sind mit DAPI gefärbt, dargestellt in blau in (A) und in cyan in (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 3: Einfluss verschiedener FBS-Chargen auf die OC-Differenzierungseffizienz. OCs wurden von CD14+ Monozyten in Gegenwart von 25 ng/mL M-CSF und 50 ng/mL RANKL (MR) für 7 Tage unterschieden. Die Kontrollbohrungen wiesen nur M-CSF (M) auf. (A) Repräsentative 10-fache Vergrößerung (Maßstabsbalken: 400 μm) und (B) Quantifizierung von TRAP-gefärbten OCs, die von einem Donor in zwei verschiedenen FBS-Chargen unterschieden wurden. Die Fehlerbalken zeigen den Mittelwert ± SD von drei technischen Replikationen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoklasten sind wichtige knochenresorbierende Zellen im Körper. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur in vitro Differenzierung von Osteoklasten aus humanen Monozyten im peripheren Blut. Diese Methode kann als wichtiges Werkzeug verwendet werden, um die Osteoklastenbiologie in der Homöostase und bei Krankheiten besser zu verstehen.

Abgrenzung funktioneller Osteoklasten von CD14+ Monozyten aus humanem peripherem Blut

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0.Unser Protokoll beschreibt eine optimierte und reproduzierbare Methode zur Erzeugung von Osteoklasten in vitro, mit der die Mechanismen untersucht werden können, die ihrem Differenzierungsprozess und ihrer Funktionalität zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, innerhalb von nur einer Woche eine große Anzahl funktionell aktiver Osteoklasten zu erzeugen. Eine hohe Differenzierungsausbeute wird durch die Verwendung von gereinigten Monozyten und die rechtzeitige Zugabe von Zytokinen erreicht.Osteoklasten sind für die Knochenzerstörung bei allen Formen von Arthritis verantwortlich, und diese Methode bietet die Werkzeuge, um neue therapeutische Verbindungen zu untersuchen, die ihre Differenzierung und/oder Funktionen modulieren können. Patricia Riedlova, Doktorandin aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren. Isolieren Sie zunächst die PBMCs, indem Sie das Blut in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen überführen.Verdünnen Sie es mit sterilem PBS in gleicher Menge für frisches Blut oder im Verhältnis 1:3 für Leukozytenzapfen und Buffy-Mäntel. Mischen Sie das Blut vorsichtig durch Umkehrung. Bereiten Sie 15-Milliliter-Röhrchen mit drei Millilitern Dichtegradientenmedium vor und schichten Sie langsam acht bis 10 Milliliter verdünntes Blut auf das Dichtegradientenmedium, um ein Mischen zu vermeiden.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 x g für 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Bremse. Anschließend die oberste Schicht vorsichtig mit einer Pasteurpipette entsorgen. Sammeln Sie die darunter liegende Interphasenschicht, die die PBMCs enthält, und übertragen Sie diese Schicht in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen.Suspendieren Sie die Zellen bis zu 50 Milliliter mit sterilem PBS und waschen Sie das Restdichtegradientenmedium ab, indem Sie bei 300 x g für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Vollbremse zentrifugieren. Um Restplättchen zu entfernen, wiederholen Sie den Zentrifugationsprozess wie im Manuskript beschrieben, resuspendieren Sie die isolierten und gereinigten PBMCs in 20 Millilitern PBS und zählen Sie sie mit einem Hämazytometer nach der Standardmethode. Um CD14+-Monozyten anzureichern, übertragen Sie 1 x 10 auf die siebten PBMCs in ein geeignetes Polystyrol-Rundbodenröhrchen und pelletieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 300 x g.Nachdem Sie den Überstand verworfen und das Zellpellet im Zelltrennpuffer resuspendiert haben, inkubieren Sie die Zellen 10 Minuten lang mit 10 Mikrolitern Antikörpercocktail pro 100 Mikroliter bei geschlossenem Deckel. Fügen Sie am Ende der Inkubation 10 Mikroliter der magnetischen Nanopartikelkügelchen pro 100 Mikroliter hinzu und inkubieren Sie sie drei Minuten lang mit geschlossenem Deckel. Füllen Sie das Volumen mit dem Zelltrennpuffer auf 2,5 Milliliter auf.Legen Sie das Röhrchen in einen Magneten und inkubieren Sie es drei Minuten lang bei geschlossenem Deckel. Verwerfen Sie nun die negative Zellpopulation mit einer kontinuierlichen Bewegung durch Umkehrung, während sich die Röhre noch im Magneten befindet. Entfernen Sie das Röhrchen vom Magneten, waschen Sie die angereicherten CD14+-Monozyten, die an den magnetischen Kügelchen befestigt sind, indem Sie sie in 2,5 Millilitern des Zellsuspensionspuffers resuspendieren, und setzen Sie das Röhrchen wieder in den Magneten ein.Zählen Sie die isolierten Zellen wie zuvor gezeigt. Zentrifugieren Sie die gesammelten Zellen fünf Minuten lang bei 300 x g. Nach dem Verwerfen des Überstandes werden die Zellen bei 1 Million Zellen pro Milliliter in einem vollständigen Alpha-Minimum Essential Medium mit 10 % FBS resuspendiert.Um den Osteoklasten zu differenzieren, fügen Sie der Zellsuspension M-CSF in einer Endkonzentration von 25 Nanogramm pro Milliliter hinzu und mischen Sie sie durch gründliches Pipettieren, um die Zellsuspension zu homogenisieren. Platte 100 Mikroliter der Suspension pro Well in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter steriles destilliertes Wasser pro Vertiefung um die plattierten Zellen hinzu, um eine Verdunstung des Mediums und Kanteneffekte im Kultursystem zu vermeiden.Inkubieren Sie die Zellen über Nacht für ca. 18 bis 20 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie frische Medien vor, die mit M-CSF und RANK-Liganden ergänzt werden. Nach der Inkubation wird die Hälfte des Mediums vorsichtig durch Aspiration mit einer P200-Pipette entfernt und durch frisches, warmes Komplettmedium ersetzt, das mit M-CSF und RANK-Liganden in einer Endkonzentration von 25 Nanogramm pro Milliliter ergänzt wird.Differenzieren Sie die Zellen sieben bis 14 Tage lang in Osteoklasten, wobei alle drei Tage ein vollständiger Austausch des Mediums erfolgt. Nach dem Entfernen des Mediums fixieren Sie die differenziert adhärenten Osteoklasten mit 100 Mikrolitern der hergestellten Fixierlösung pro Well und inkubieren Sie sie eine Minute lang. Berühren Sie nicht den Boden der Vertiefungen, um Kratzer an den adhärenten Zellen zu vermeiden.Sobald die Vertiefungen dreimal mit 300 Mikrolitern sterilem destilliertem Wasser gewaschen wurden, klopfen Sie die Platten trocken und geben Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete Färbelösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius im Dunkeln für 20 Minuten. Entfernen Sie nach der Inkubation die Färbelösung durch Inversion und waschen Sie die Platte dreimal mit 300 Mikrolitern destilliertem Wasser pro Welle.Entfernen Sie das überschüssige Wasser, indem Sie die Teller auf Papiertücher klopfen, und lassen Sie die Teller offen und lichtgeschützt über Nacht an der Luft trocknen. Nehmen Sie mit einem Hellfeldmikroskop mit Kacheloption Bilder mit 10-facher oder 20-facher Vergrößerung auf, um die gesamte Well-Oberfläche zu erfassen. Zählen Sie die Osteoklasten, die als TRAP+violett gefärbte Zellen mit mehr als drei Kernen identifiziert wurden, manuell mit einer Bildanalysesoftware mit einem Zellzähler-Plugin.Platte 100-Mikroliter der isolierten CD14+Monozyten-pro-Well-Kammer in einer 18-Well-Kammer mit einer Zelldichte von 1 x 10 bis zur fünften Zelle pro Well. Differenzieren Sie die Osteoklasten in Gegenwart von M-CSF- und RANK-Liganden, wie bereits gezeigt, mit einem vollständigen Wechsel des Mediums alle drei Tage. Entfernen Sie das Medium am Ende vorsichtig und waschen Sie es zweimal mit 200 Mikrolitern vorgewärmtem PBS bei einem pH-Wert von 7,4.Lassen Sie die Vertiefungen zwischen den Schritten nicht trocknen. Fixieren Sie die Probe mit 100 Mikrolitern 4%iger Formaldehydlösung pro Vertiefung in PBS und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal mit 200 Mikrolitern PBS pro Well.Permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern 0,1%iger Triton x-100-Lösung, die in PBS verdünnt ist, und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang, wie zuvor gezeigt. Zweimal mit 200 Mikrolitern PBS pro Vertiefung waschen. Um die unspezifische Bindung zu blockieren und das Signal zu verstärken, fügen Sie 100 Mikroliter Blockierungslösung hinzu, die mit 2%igem Rinderserumalbumin und PBS-Lösung hergestellt wurde.20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler unter leichtem Schütteln inkubieren. Nachdem Sie die Blockierlösung entfernt haben, geben Sie 100 Mikroliter fluoreszenzkonjugierte Phalloidinlösung, verdünnt in 2%ige BSA/PBS-Lösung, in jede Vertiefung. Zweimal mit 200 Mikrolitern PBS pro Vertiefung waschen.Die Kerne werden mit 100 Mikrolitern einer PBS-Lösung mit 300 nanomolaren DAPI pro Vertiefung gefärbt. Entfernen Sie nach 10 bis 15 Minuten die DAPI-Lösung und ersetzen Sie sie durch PBS mit 100 Mikrolitern pro Well. Visualisieren Sie die Färbung mit geeigneten Immunfluoreszenz- oder konfokalen Mikroskopen bei vier bis 40x.Die reifen Osteoklasten sind definiert als TRAP+multiple nukleäre Zellen. Die Zugabe von RANK-Liganden erzeugte eine zunehmende Anzahl von großen TRAP+mehrkernigen Osteoklasten in dosisabhängiger Weise. Die Kinetik der Differenzierung von Osteoklasten aus Monozyten wurde über einen Kulturzeitraum von zwei bis 14 Tagen untersucht.Mehrkernige Osteoklasten waren ab dem fünften Tag sichtbar, und am siebten Tag wurde eine optimale Differenzierung erreicht. Die Differenzierung von Osteoklasten auf mineralisierten Oberflächen ermöglicht es, deren Resorptionsaktivität durch die Analyse der Bildung von runden Löchern oder Resorptionsgruben zu beurteilen. Der Prozentsatz der Resorption steigt in Gegenwart von M-CSF und RANK-Liganden im Vergleich zu M-CSF allein signifikant an.Weiterhin hemmte die Behandlung mit Rotenon dosisabhängig die Resorption der mineralisierten Oberfläche im Vergleich zur unbehandelten Kontrollbohrung. Die Rotenon-abhängige Hemmung der Osteoklastenresorption war mit der Hemmung der ATP-Produktion assoziiert. Die Fragmentierung des vom RANK-Liganden abgeleiteten Aktinrings des reifen OCS wurde in Gegenwart von Rotenon beobachtet.Es ist wichtig sicherzustellen, dass die angereicherten Monozyten keine Blutplättchen enthalten, dass die Zellen mit der richtigen Dichte plattiert sind und dass die umgebenden Vertiefungen mit Wasser gefüllt sind, um den Kanteneffekt zu vermeiden. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, um mechanistisch zu untersuchen, wie sich Osteoklasten bilden und was ihre Funktionalität sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der translationalen Wissenschaft beeinflusst. Zum Beispiel durch den Einsatz von Verbindungen oder Proteinen, die diese Prozesse modulieren können.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Expansion von humanen peripheren Blut γδ T-Zellen mit Zoledronat

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Quantitative Bildgebung von Lineage-spezifischen Toll-like Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion in Monozyten und dendritischen Zellen aus kleinen Proben des menschlichen Blutes

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Die Isolation, Differenzierung und Quantifizierung von Human-Antikörper-sezernierenden B-Zellen aus Blut: ELISpot als Functional Readout der humoralen Immunität

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran erhöht die Effizienz der Lentivirale Transduktion von murinen und menschliche primäre NK-Zellen

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differenzierung und Thrombozyten-Formation von Human Cord Blood abgeleitet CD34 Zellen+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Bewertung der synaptischen Schnittstelle der primären menschlichen T-Zellen aus peripherem Blut und Lymphgewebe

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Isolation, Transfektion und Kultur der primären menschlichen Monozyten

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...