Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

המחברים מודים בהכרת תודה למתקן Flow Core ולמתקן ההדמיה של גלזגו (GIF) בתוך בית הספר לזיהום וחסינות על תמיכתם ועזרתם בעבודה זו.

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

התרבית הקלה והבידוד של מספר גדול של OCs פונקציונליים במבחנה חשובים לקידום ההבנה של ביולוגיה של העצם ומחלות בתיווך OC. באופן קלאסי, OCs נוצרו בתרביות משותפות עם אוסטאובלסטים או תאי סטרומה ותאים המטופויטיים מהטחול או מח העצם38,39. פריצת דרך משמעותית בהבנת אוסטאוקלסטוגנזה הייתה זיהויו של RANKL כמווסת העיקרי של היווצרות, התמיינות והישרדותOC 40. פרוטוקולים מוקדמים של מערכות תרבות תלויות RANKL השתמשו במרכזיות עבור דור OC21,41,42. עם זאת, תרבויות מעורבות אלה הן ארוכות ומציגות גורמים מבלבלים רבים המגבילים את היכולת לבחון את ההשפעות הישירות על התמיינות OC ותפקודו. פרוטוקול זה מתאר מודל יעיל ואמין במבחנה של אוסטאוקלסטוגנזה ממונוציטים היקפיים אנושיים CD14+ שבו ניתן להשיג אוסטאוקלסטוגנזה אופטימלית תוך 7 ימים (איור 1 ואיור 2), שהוא מהיר משמעותית בהשוואה לפרוטוקולים אחרים43,44,45,46. המאפיינים העיקריים של פרוטוקול זה הם (1) השימוש במונוציטים מטוהרים CD14+, (2) הקדמת המונוציטים עם M-CSF לפני החשיפה ל- RANKL, (3) אורך התרבית (<7 ימים), ו- (4) זיהוי אמין של עיכוב היווצרות OC (צביעת TRAP) ותפקוד (ספיגה מחדש, ייצור ATP, ארגון מחדש של טבעת אקטין עם מעכבים. 
במהלך אופטימיזציה של המתודולוגיה זוהו מספר נקודות קריטיות. נצפה כי התמיינות במבחנה של OCs תלויה במידה רבה בצפיפות הזריעה של מונוציטים CD14+. לכן, בפרוטוקול זה, התאים נזרעים בצפיפות גבוהה (1 x 105 תאים / באר של צלחת 96 באר, ב 100 μL של תווך), כפי שהוא חיוני עבור התאים להיות מסוגלים לתקשר אחד עם השני ולהיות בקרבת נתיך ולהיות OCs בוגרים. באופן דומה, זריעה של תאים בצפיפות גבוהה מדי מגבילה את התמוותם וצמיחתם בשל מגבלות בינוניות ומחסור במקום הנדרש. יתר על כן, כדי להשיג הצלחה מרבית עם פרוטוקול זה, חשוב לבצע את הפרדת שיפוע הצפיפות בזהירות ולהבטיח כי האוכלוסייה המועשרת של תאי CD14+ היא טהורה ככל האפשר. לדוגמה, שלבי שטיפה לא מספקים גורמים לחוסר הסרה של טסיות, מה שכתוצאה מכך מעכב התמיינות OC47,48. באופן דומה, נוכחות של זיהום תאי T מינורי בתכשירי CD14+ מבודדים המעוררים עם M-CSF בלבד יכולה לגרום להתמיינות OC, אולי באמצעות הפרשת RANKL על ידי תאי T49. לכן, חשוב לכלול בקרת M-CSF לכל ניסוי. בדיקת טוהר שגרתית, במיוחד בעת שימוש בערכת בידוד חדשה, מומלצת גם היא כדי לוודא את טוהר הדגימה.
מספרי OC אופטימליים (טווח: ~200-1,600 OCs / באר) מושגים באמצעות מדיום α-MEM מועשר בנוקלאוזידים ו- L-גלוטמין. אמצעי תרבות קונבנציונליים אחרים, כולל מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) ומדיום הזיכרון של רוזוול פארק (RPMI) 1640, משפיעים על תפוקת OC. המקור של FBS יכול גם להשפיע על osteoclastogenesis. אצוות שונות של FBS יכולות להוביל לירידה באוסטאוקלסטוגנזה שמקורה ב-RANK-L, כמו גם להופעה של מספר נמוך של תאים מרובי גרעינים מסוג TRAP+ בפקדי M-CSF (איור משלים 3). לכן, כדי להשיג תוצאות עקביות, מומלץ לבדוק אצוות FBS חדשות לפני השימוש ולהמשיך עם אותה אצווה לאורך כל הניסויים כדי למזער שינויים בתהליך ההתמיינות. בנוסף, השונות בין תורם לתורם, במונחים של המספר הכולל של OCs מובחנים המתקבלים בנקודת זמן הסיום, מהווה מגבלה בעת שימוש בפרוטוקול זה כדי להשוות, למשל, תורמים בריאים לחולים. במקרים אלה, זה הכרחי להשתמש בדיוק באותם תנאים ואת אותו הרבה של בינוני, FBS, ריאגנטים אחרים.
צעד הכרחי נוסף להתמיינות והבשלה אופטימלית של OC הוא הכנת המונוציטים עם M-CSF לפני הוספת RANKL. חשיפת התאים ל-M-CSF 18-24 שעות לפני RANKL גורמת למונוציטים לווסת את ביטוי RANK15,26. התוספת של RANKL בנקודת זמן זו מבטיחה התמיינות אופטימלית של OC באופן תלוי מינון. מידת התמיינות OC משתנה מתורם לתורם; עם זאת, 25 ננוגרם/מ"ל רנקל בדרך כלל מספיקים כדי להבדיל בין מספר גבוה של OCs ברוב התורמים. בנוסף, ניתן להשתמש ב- 25 ng/mL RANKL בבדיקות לסינון ראשוני של תרכובות, מכיוון שהוא מאפשר הערכה של ההשפעות המשפרות והמעכבות של תרכובות הבדיקה. מערכות תרבית אחרות השתמשו בזמני M-CSF ארוכים יותר לפני הדגירה לפני הוספת RANKL, אך התוצאה היא זמן גידול ארוך יותר עבור אוסטאוקלסטוגנזה50. בנוסף, השארת מונוציטים דרוכים לדגור לילה מאפשר להם להתחבר לצלחת, אם כי לא במצב דבק לחלוטין. לכן, כאשר RANKL הוא הציג בפעם הראשונה, המדיום חייב להיות חצי שונה בזהירות רבה ולא שונה לחלוטין כדי למנוע ניתוק ואובדן של מונוציטים דרוך. המדיום גם צריך להיות רענן כל 3-4 ימים כדי למנוע דלדול בינוני ולמנוע מוות תאי. יתר על כן, בשל הנפח הנמוך המשמש בבדיקה זו (100 μL / באר בצלחת 96 בארות), יש חשיבות עליונה למסגרת של בארות ריקות המלאות בתמיסה מימית (כלומר, H2O או PBS מזוקק סטרילי) סביב בארות הבדיקה. זה מונע אידוי בינוני ואפקטים בקצוות.
לבסוף, עבור בדיקות מטבוליות (למשל, מבחני ATP), הכרחי שהתאים יהיו בני קיימא כדי להימנע מסטיית תקן עצומה בין עותקים משוכפלים (איור 5). כדאיות גבוהה של התאים חשובה גם למיון התאים ולהמשך ההתרבות של OCs ממוינים (איור 4). עם זאת, לשיטה זו מספר מגבלות. OCs בוגרים לחלוטין הם מאוד דבקים וקשה לנתק מן הצלחות. לעתים קרובות לא ניתן לנתק את הOCs הגדולים יותר, מה שעלול להוביל לתפוקת תאים נמוכה יותר. לכן, יש לספור את התאים לאחר מיון ולפני ציפוי בריכוז הנדרש. יתר על כן, בפרוטוקול הנוכחי, שיטה לא אנזימטית (accutase) לניתוק OCs משמשת למניעת שינויים בממברנות בצביעת פני השטח במורד הזרם עבור ציטומטריית זרימה. השימוש במגרדי תאים (שניהם בעלי קצוות רכים או קשים) נבדק גם הוא והוביל למוות תאי גבוה. ניתן להשתמש בניתוק אנזימטי באמצעות תמיסות טריפסין/EDTA של 0.05% לקבלת תפוקה גבוהה יותר של OCs מנותקים כאשר שלמות הממברנה אינה נדרשת עבור יישומים במורד הזרם. בנוסף, כדי למנוע מהOCs להתגבש יחד, מומלץ מאוד להשתמש בריכוז גבוה של EDTA בכל המאגרים לאחר ניתוק התא, כמו גם סינון מתאים לפני רכישת ציטומטריית זרימה. חשוב לציין כי תרביות OC הן אוכלוסייה הטרוגנית של תאים המורכבת מOCs בוגרים, מבשרי OC ומקרופאגים. ניתן להבחין בקלות בין מקרופאגים לבין OCs, אף על פי שגם קדם-OCs חד-גרעיניים וגם OCs רב-גרעיניים מבטאים OSCAR ולא ניתן להבחין ביניהם בשיטה הנוכחית (איור 4). אכן, סוגיה אחרונה זו מהווה את המגבלה העיקרית של שיטה זו. נוסף על כך, ביטוי נמוך של OSCAR קיים גם בתרביות M-CSF (איור 4B), והוא עשוי להצביע על מקרופאגים שמוכנים למחויבות לשושלת OC. חשוב להגדיר את השער לתאי OSCAR+ בהתבסס על אות הצביעה של FMO, כפי שמוצג באיור 4B.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית וחזקה לייצור יעיל של OCs פעילים ובשלים מבחינה תפקודית ממונוציטים אנושיים ראשוניים במחזור. חוזקו של פרוטוקול זה הוא ביכולתו לייצר OCs בפרק זמן קצר ולהניב מספר גבוה של OCs מובחנים. שיטה זו פותחת את הדרך לחקר המנגנונים הבסיסיים העומדים בבסיס התמיינות OC ותפקודו.

אוסטאוקלסטים (OCs) הם תאי ענק מרובי גרעינים של שושלת המטופויטית עם יכולת ייחודית לספוח עצם. הם אחראים על פיתוח ושיפוץ מתמשך של השלד 1,2. בשלבי ההתפתחות של השלד, OCs ומקרופאגים שוכני רקמות נגזרים מאבות אריתרו-מיאלואידים ומאכלסים את נישת העצם ורקמות האיברים. במצבים פיזיולוגיים, אבות אריתרו-מיאלואידים נדרשים להתפתחות עצם תקינה ולבקיעת שיניים, בעוד שזרם מונוציטים במחזור הדם לתוך נישת העצם מספק תחזוקה לאחר הלידה של OCs, מסת העצם וחלל מח העצם3. בתנאים פתולוגיים, מונוציטים מגויסים לאתרים של דלקת פעילה ויכולים לתרום להרס עצם פתולוגי 4,5.
חולים עם מספר צורות של דלקת פרקים חווים דלקת מפרקים, המובילה להרס מפרקים מתקדם הנגרם על ידי OCs6. לדוגמה, בדלקת מפרקים שגרונית (RA), OCs מופעלים יתר על המידה אחראים לשחיקת עצם פתולוגית והרס מפרקים7,8, והטיפולים הנוכחיים לעתים קרובות אינם משפרים או עוצרים את הנזק לעצם9,10,11. שינויים במונוציטים במחזור הן מבחינת התפלגות האוכלוסייה והן מבחינת חתימות שעתוק ואפיגנטיות דווחו בחולי RA12,13,14. יתר על כן, דווח כי תגובות מונוציטים משתנות לגירוי דלקתי משפיעות על אוסטאוקלסטוגנזה בחולי RA עם מחלה פעילה15,16,17.
התמיינות של OCs היא תהליך מורכב ורב-שלבי הכולל את המחויבות של תאים מקדימים מיאלואידים להתמיין למבשרי OC. במהלך אוסטאוקלסטוגנזה, OCs הופכים לענקים ומרובי גרעינים באמצעות איחוי תאים, ציטוקינזיס לא שלם, ותהליך מחזור גרעיני המתואר כביקוע ואיחוי18,19,20. היכולת להבדיל בין OCs במבחנה אפשרה התקדמות משמעותית בהבנת הביולוגיה של העצם21. OCs נבדלים מקודמנים בחשיפה לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) ומפעיל קולטן של גורם גרעיני קאפה-B ליגנד (RANKL). האחרון חיוני להתפתחות ותפקוד תקין של OCs במבחנה ו in vivo, גם בתנאים דלקתיים 6,22,23. RANKL מוצג על ידי אוסטאובלסטים ואוסטיאוציטים, כמו גם על ידי תאי T פעילים ופיברובלסטים בסינוביום RA מודלק 2,24,25. במהלך תהליך התמיינות OC, מונוציטים שנחשפו ל-M-CSF משפרים את מפעיל הקולטן של ביטוי גורם גרעיני קאפה-B (RANK) על קרום התא שלהם, ותחת גירוי עוקב עם RANKL, מתמיינים לקדם-OCs חד-גרעיניים חד-גרעיניים עמידים לטרטרט (TRAP) ולאחר מכן ל-OCs15,26 מרובי גרעינים. OCs מייצרים מספר אנזימים, העיקרי שבהם הוא TRAP, המאפשר פירוק של פוספופרוטאינים בתוך עצם27. וסת וסמן של התמיינות OC הוא קולטן הקשור ל-OC (OSCAR). הוא מווסת בשלב מוקדם בתאים מקדימים המתחייבים לשושלת OC28. OCs מרובי גרעינים ענקיים בוגרים יכולים לפרק (לספוג מחדש) את מטריצת השלד על ידי יצירת אזור איטום גדול, העשוי מטבעת אקטין המקיפה גבול פרוע21,29,30. יכולת ספיגת העצם של OCs דורשת ארגון מחדש של השלד הציטו-שלד וכתוצאה מכך קיטוב והיווצרות של קרום מפותל, שהוא מה שנקרא גבול פרוע. הגבול הפרוע מוקף ברצועה עגולה גדולה של מבנה עשיר באקטין F, שהוא טבעת האקטין או אזור האיטום. שלמות טבעת אקטין חיונית עבור OCs כדי לספוח מחדש את העצם הן במבחנה והן in vivo, והיווצרות גבול פרועה פגומה קשורה לביטוי אדנוזין טריפוספטאז ואקולרי תחתון (V-ATPase)31,32,33. יתר על כן, OCs הם תאים עשירים במיטוכונדריה, ואדנוזין טריפוספט (ATP) קשור למבנים דמויי מיטוכונדריה בOCs הממוקמים בגבול הפרוע31,32,33. רוטנון פועל כמעכב חזק של קומפלקס המיטוכונדריה I ומשפיע על ייצור ATP. רוטנון הוכח גם כמעכב התמיינות OC ותפקוד34.
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה ואופטימלית של אוסטאוקלסטוגנזה חוץ גופית מדגימות דם היקפיות אנושיות. בדם היקפי אנושי, מונוציטים CD14+ הם המקור העיקרי של OCs15,35,36. בפרוטוקול זה, הקינטיקה של החשיפה והריכוזים של M-CSF ו-RANKL הותאמו לאוסטאוקלסטוטנזה אופטימלית. תאים חד-גרעיניים מופרדים תחילה מן אריתרוציטים גרנולוציטים נוכח דם שלם על ידי שיפוע צפיפות; לאחר מכן הם מועשרים עבור מונוציטים CD14+ באמצעות ברירה חיובית על ידי חרוזים מגנטיים. המונוציטים המבודדים CD14+ מודגרים למשך הלילה עם M-CSF. זה מכין את המונוציטים כדי לווסת את הביטוי של דרגה15,26. התוספת הבאה של RANKL גורמת לאוסטאוקלסטוגנזה ורב-גרעינים באופן תלוי זמן. OCs סופגים פעילים מראים את הפיזור האופייני של טבעות F-actin בקצה קרום התא30,32 ואת הצביעה עבור TRAP. OCs בוגרים מנותחים על ידי כימות תאים מרובי גרעינים TRAP+ (יותר משלושה גרעינים). ניתן להעריך את היכולת התפקודית של OCs בוגרים על ידי ספיגתם, שלמות טבעות האקטין וייצור ATP. יתר על כן, ניתן להעשיר OCs CD14-OSCAR+ מובחנים ולהשתמש בהם כדי להעריך את ההשפעות של תרכובות מסוימות על פונקציונליות OC באמצעות ספיגת מינרלים (או דנטין) וארגון F-actin. בנוסף, בעבודה זו, מעכב OC ידוע, רוטנון, משמש כדוגמה לתרכובת המשפיעה על הפונקציונליות של OCs. פעילות ספיגת OC מופחתת תחת רוטנון קשורה לייצור ATP מופחת ולפיצול טבעת אקטין (actin ring). לסיכום, פרוטוקול זה קובע בדיקה חזקה שיכולה לשמש כשיטת התייחסות לחקר מספר היבטים ביולוגיים של התמיינות OC ותפקוד במבחנה. 
מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי להעריך (1) את הפוטנציאל של מונוציטים במחזור להתמיין לOCs בבריאות ובמחלות, כמו גם (2) את ההשפעה של מועמדים טיפוליים על התמיינות OC ותפקוד. פרוטוקול אוסטאוקלסטוגנזה חזק זה מאפשר לקבוע את היעילות והמנגנונים של טיפולים ממוקדי עצם הן על התמיינות OC מתאים מקדימים והן על תפקודם של OCs בוגרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

אוסטאוקלסטים (OCs) הם תאים סופחי עצם הממלאים תפקיד מרכזי בהתפתחות השלד ובעיצוב מחדש של עצמות בוגרות. מספר הפרעות עצם נגרמות על ידי התמיינות מוגברת והפעלה של OCs, ולכן עיכוב של פתולוגיה זו הוא עיקרון טיפולי מרכזי. שני גורמים עיקריים מניעים את ההבחנה של OCs ממבשרי מיאלואידים: גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) ומפעיל קולטן של ליגנד קאפה-B (RANKL). מונוציטים CD14+ במחזור אנושי ידועים מזה זמן רב כמתמיינים לOCs במבחנה. עם זאת, זמן החשיפה וריכוז ה- RANKL משפיעים על יעילות הבידול. אכן, תוארו פרוטוקולים ליצירת OCs אנושיים במבחנה , אך לעתים קרובות הם גורמים לתהליך בידול גרוע וממושך. בזאת, מסופק פרוטוקול חזק וסטנדרטי ליצירת OCs אנושיים בוגרים פעילים פונקציונלית בזמן. מונוציטים CD14+ מועשרים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) ודרוכים עם M-CSF כדי לווסת את RANK. חשיפה עוקבת ל- RANKL יוצרת OCs באופן תלוי מינון וזמן. OCs מזוהים ומכומתים על ידי צביעה עם phosphatase עמיד חומצה טרטרט (TRAP) וניתוח מיקרוסקופ אור. צביעה אימונופלואורסצנטית של גרעינים ו-F-actin משמשת לזיהוי OCs פעילים מבחינה תפקודית. בנוסף, OCs בוגרים של OSCAR+CD14− מועשרים עוד יותר באמצעות מיון תאי ציטומטריה של זרימה, ופונקציונליות OC המכומתת על ידי מבחני ספיגה מינרליים (או דנטין/עצם) והיווצרות טבעות אקטינים. לבסוף, מעכב OC ידוע, רוטנון, משמש על OCs בוגרים, מה שמוכיח כי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) חיוני לשלמות טבעת האקטין ולתפקוד OC. לסיכום, במחקר זה נקבע מבחן חזק להבחנה בין מספר גבוה של OCs, אשר בשילוב עם צביעת טבעת אקטין ובדיקת ATP מספק מודל שימושי במבחנה להערכת תפקוד OC ולסינון תרכובות טיפוליות חדשניות שיכולות לווסת את תהליך ההתמיינות.

יצירת המהרה ממונוציטים CD14+ שיטה זו נועדה להבדיל בקלות בין מספר רב של OCs לבין מונוציטים CD14+ בדם היקפי אנושי במבחנה, בדרך כלל בשבוע אחד. ראשית, מונוציטים CD14+ הועשרו מ-PBMCs והוכשרו עם M-CSF בן לילה כדי להעלות את רמת ה-RANK, כפי שדווח בעבר15. לאחר פריימינג מונוציטים, כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של RANKL עבור התמיינות OC והבשלה, נעשה שימוש בריכוזי RANKL של 1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL ו-100 ng/mL, יחד עם 25ng/mL M-CSF. התוספת של RANKL יצרה מספר גדל והולך של OCs מרובי גרעינים חיוביים גדולים ל-TRAP באופן תלוי מינון, וזה הוערך באמצעות צביעת TRAP. OCs בוגרים מוגדרים כתאים חיוביים למלכודת עם גרעינים מרובים (בדרך כלל יותר משלושה; איור 2A,B ואיור משלים 1). יתר על כן, הקינטיקה של התמיינות OC ממונוציטים נחקרה באמצעות צביעת TRAP ומיקרוסקופ אור במשך תקופת תרבית של 2-14 ימים. במקרה זה, התמיינות OC באמצעות ריכוז ביניים של 50 ng/mL RANKL נבחרה כדי להעריך באיזו מהירות OCs התמידו בתרבית. בתנאי התרבית האלה, OCs מרובי גרעינים נראו מהיום ה-5 ואילך, וההתמיינות האופטימלית הושגה ביום ה-7 (איור 2C). הדגירה הממושכת של תרביות מעבר ל-10 ימים על פלסטיק הביאה לאיחוי תאים ענקיים באופן חריג. בפרוטוקול זה, ימים 6-8 משמשים בדרך כלל כנקודת הקצה האופטימלית של יצירת OC. ניתן לכמת את הOCs או להשתמש בהם לבדיקות במורד הזרם.
הערכה תפקודית של OCs מובחנים כדי לקבוע את הפעילות התפקודית של OCs שנוצרו, בחנו את פעילות הספיגה שלהם על ידי הבחנה בין OCs על משטח מינרלי. מכיוון שOCs גדולים נוצרים רק לאחר תקופת תרבית של 7 ימים, וכדי לאפשר מספיק זמן לספוג מחדש את מצע המינרלים, התרביות נשמרו עד היום ה-10. היווצרות חורים עגולים, או בורות ספיגה, נצפתה רק על משטחים מינרליים של בארות המכילות תאים שטופלו גם ב-M-CSF וגם ב-RANKL (איור 3). לפיכך, אחוז משטח מינרלי מומס (בורות ספיגה) מאפשר לקבוע את יכולת ספיגת OC. נוסף על כך, ה-OCs שהתבדלו בעקבות פרוטוקול זה עד ליום ה-7, הן בשקופיות פלסטיק והן בשקופיות של תאי זכוכית, הציגו מבנה טבעתי אקטין מאורגן היטב שניתן היה להמחיש באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית (איור משלים 2).
השפעת מעכב על תפקוד OC בוגר תנאי ההתרבות שהוזכרו לעיל נוצלו כדי לקבוע את היכולת התפקודית של OCs שנוצרו במבחנה בנוכחות מעכב OC ידוע, רוטנון34. OCs היו מובחנים במשך 6-8 ימים, CD14-OSCAR+ OCs ומבשרי OC הועשרו באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 4). התאים המועשרים צופו ב-50,000 תאים/לבאר על צלחת מצופה מינרלים בת 96 בארות בתווך פרו-אוסטאוקלסטוגני (25 ננוגרם/מ"ל, M-CSF ורנקל) למשך 3 ימים. טיפול ברוטנון (איור 5A,B) עיכב באופן תלוי מינון את ספיגת המשטח המינרלי בהשוואה לבאר הבקרה שלא טופלה, בהתאם למחקרים קודמים34. בנוסף, פונקציונליות OC הוערכה באמצעות ייצור ATP ויצירת טבעות אקטין (actin ring). עיכוב תלוי רוטנון של ספיגת OC היה קשור לעיכוב ייצור ATP (איור 5C). OCs סופגים מחדש הם תאים מקוטבים מאוד המווסתים את יכולת הספיגה שלהם על ידי קידום ארגון השלד הציטו-שלד. פלואידין מצומד Alexa fluor 647 שימש לסימון שלד ציטוקלטון F-actin של OCs בוגרים שגודלו בתרבית בנוכחות או היעדר רוטנון. רוטנון גרם לפיצול טבעת האקטין שמקורה ב-RANKL של OCs בוגרים (איור 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> איור 2: OCs מבדילים ביעילות ממבשרי מונוציטים CD14+ . מונוציטים CD14+ הועשרו מגנטית, צופו ב 1 x 105 תאים / באר בלוחות 96 בארות, והודגרו בן לילה עם 25 ng / ml m-CSF. (A) מונוציטים מוקפצים M-CSF עוררו בריכוזים הולכים וגדלים של RANKL (1 ננוגרם/מ"ל, 25 נ"ג/מ"ל, 50 נ"ג/מ"ל ו-100 נ"ג/מ"ל), תוקנו ונצבעו ל-TRAP ביום השביעי. התמונות נרכשו, והתאים מרובי הגרעינים (MNCs) של TRAP+ נספרו. תמונות מייצגות של צביעת TRAP מוצגות באיור משלים 1. קווי השגיאה מציגים ממוצע ± SD (n = 3). הנתונים נותחו באמצעות מבחן השוואות מרובות חד-כיווני של ANOVA והולם-סידאק עבור נתונים זוגיים; * P ≤ 0.05 ו- ** P ≤ 0.005. (B) תמונה מייצגת של באר מוכתמת ב-TRAP של לוח בעל 96 בארות המראה את הכמות האופיינית של OCs/באר צפויה ואת המורפולוגיה שלהם מתחת ל-25 ng/mL RANK-L בהשוואה למקרופאגים שמקורם ב-M-CSF ביום 7. פסי קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (C) תמונות מייצגות של היווצרות OC מתחת ל-50 ננוגרם/מ"ל RANKL שהוערכו באמצעות צביעת TRAP מהיום השני עד היום ה-14. OCs נראים מהיום החמישי ואילך. OCs ענקיים שהתמזגו באופן חריג נמצאים לאחר 10 ימים. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> איור 3: OCs סופגים נבדלים ממונוציטים CD14+ . תאי CD14+ שבודדו מ-PBMCs התמינו במשך 10 ימים ל-OCs בנוכחות 25 ננוגרם/מ"ל, M-CSF (M) ו-RANKL (R) על פני השטח של בדיקת מינרלים (אוסטאו-אסאי). (A) תמונות של בארות ייצוגיות משוחזרות שצולמו בהגדלה של פי 10 כדי לנתח את הספיגה ביום ה-10 (מצע מינרלי באפור; בורות ספיגה בלבן). פסי קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (B) כימות אחוז השטח שנספג. נתוני הספיגה נותחו באמצעות ניתוח זוגי של Wilcoxon. קווי השגיאה מציגים ממוצע ± SD (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> איור 4: העשרת ציטומטריה של זרימה של OCs CD14-OSCAR+. מונוציטים CD14+ הועשרו מ-PBMCs, וה-OCs נבדלו כפי שתואר קודם לכן. תרביות OC דבקות נותקו עם אקוטאז ונצבעו עבור ציטומטריית זרימה. (א-ג) OCs ביום 8 מוינו על בסיס CD14 וביטוי OSCAR. (א) אסטרטגיית מיון מייצגת. התאים גודרו כסינגלטים, שליליים לכתמים מתים, ותת-הקבוצות CD14+ OSCAR+ (אדום) ו-CD14-OSCAR+ (כחול) מוינו. (B) תרשימים מייצגים המראים את צביעת OSCAR החופפת של OCs הנגזרים מ-RANKL (ציאן) ומקרופאגים שמקורם ב-M-CSF (כתום). באדום נמצאת הבקרה המוכתמת באיזוטיפ OSCAR של OCs הנגזרים מ-RANKL. (C) האוכלוסיות הממוינות צופו על פלסטיק והורשו להיצמד במשך שעתיים בתווך פרו-OC (25 ננוגרם/מ"ל M-CSF ו-50 ננוגרם/מ"ל RANKL), ולאחר מכן צביעה והדמיה של TRAP. התמונות המייצגות מראות מחסור בתאי TRAP+ בתת-הקבוצה CD14+ (אדום) ובתת-קבוצה מונו-וגרעינית של TRAP+ קדם-OCs ו-OCs בתת-הקבוצה CD14− (כחול). פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> איור 5: בדיקות להערכת תפקודם של OCs בוגרים. כדי להעריך את תפקודם של OCs בוגרים, תאי CD14+ שבודדו מ- PBMCs גודלו בתרבית עם M-CSF (M) בלבד או בשילוב עם RANKL (R) במשך 7 ימים, OCs הועשרו באמצעות ציטומטריית זרימה, ולאחר מכן OCs טופלו עם רוטנון מעכב במשך 24 שעות. (A) OCs בוגרים מוינו באמצעות ציטומטריית זרימה (CD14−OSCAR+) וגודלו בתרבית על משטח בדיקת מינרלים בנוכחות או היעדר רוטנון במשך 3 ימים, ולאחר מכן התאים הולבנו וצולמו במהירות של פי 10 כדי לחשוף את האזור שנספג מחדש (בורות ספיגה בלבן). (A) תמונות משוחזרות מייצגות של בארות. פסי קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (B) כימות אחוז השטח שנספג. הנתונים ב-(B) נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם מבחן ההשוואות המרובות של דאן (n = 7); * P ≤ 0.05 ו** P ≤ 0.01. פסי השגיאה מציגים את הממוצע ± SD. (C) תכולת ATP תוך-תאית כוללת של OCs בוגרים לא מובחנים ויום 7 מובחנים עם RANKL ומטופלים ברכב או ברוטנון (10 ננומטר ו-30 ננומטר). כאן, 2DG ואוליגומיצין שימשו כבקרות חיוביות לבדיקה ונוספו 30 דקות לפני ליזה התאית וכימות ATP. קווי השגיאה מציגים את הממוצע ± SD (n = 4). הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני ומבחן השוואה מרובה של Dunnett עבור נתונים זוגיים. ** P ≤ 0.01. (D) תמונה מייצגת של 20x OCs בוגרים מוכתמת להיווצרות טבעת אקטין (אדום) וגרעינים (כחול), המראה את אובדן טבעת האקטין עם המעכב. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>פורמט צלחת</td>
			<td>96 צלחת באר</td>
			<td>48 צלחת באר</td>
			<td>24 צלחת באר</td>
			<td>12 צלחת באר</td>
			<td>6 צלחת באר</td>
		</tr><tr><td>נפח</td>
			<td>100 מיקרוליטר</td>
			<td>225–250 מיקרוליטר</td>
			<td>450–500 מיקרוליטר</td>
			<td>0.8–1 מ"ל</td>
			<td>1.8–2 מ"ל</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: נפח מתלה התא עבור תבניות לוחות שונות. אמצעי האחסון מחושבים החל מתמיסת 1 x 106 תאים/מ"ל ומספקים צפיפות אופטימלית לאיחוי תאים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>פלואורופור, שיבוט</td>
			<td>נפח (μL) לכל 106 תאים</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/ציאנין7, הידרוכלוריד14</td>
			<td>5 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>אוסקר</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>מאגר מיון תאים</td>
			<td></td>
			<td>80 מיקרוליטר</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: תמיסת תערובת אב נוגדנים. 
איור משלים 1: צביעת TRAP של תגובת מינון RANKL. מונוציטים CD14+ הועשרו מגנטית, צופו ב-1 x 105 תאים/באר בלוחות של 96 בארות, והודגרו בן לילה עם 25 ננוגרם/מ"ל m-csf, כמו באיור 2. תמונות מייצגות של צביעת TRAP מראות מונוציטים מוקצים MCSF עם ריכוזים הולכים וגדלים של RANKL (1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL ו-100 ng/mL), קבועים ומוכתמים עבור TRAP ביום השביעי. פסי קנה מידה: 400 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים 2: צביעת טבעות משחק ב-OCs מובחנים לחלוטין. (A) הגדלה של OCs פי 10 המובחנת על פלסטיק TC ומוכתמת בפלואידין AF647 (באדום). סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. (B) הגדלה של OCs פי 40 המובחנת בשקופיות תא זכוכית ומוכתמת בפלואידין AF488 (בצהוב). סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר.הגרעינים מוכתמים ב-DAPI, מוצגים בכחול ב-(A) ובציאן ב-(B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 3: ההשפעה של אצוות FBS שונות על יעילות התמיינות OC. OCs נבדלו מונוציטים CD14+ בנוכחות 25 ng / mL M-CSF ו 50 ng / mL RANKL (MR) במשך 7 ימים. בארות הבקרה היו M-CSF בלבד (M). (A) הגדלות מייצגות של 10x (פסי קנה מידה: 400 מיקרומטר) ו-(B) כימות של OCs מוכתמים במלכודת המובחנים מתורם אחד בשתי קבוצות שונות של FBS. קווי השגיאה מציגים את ממוצע ± SD של שלושה עותקים טכניים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

אוסטאוקלסטים הם תאי מפתח סופחי עצם בגוף. פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה להבחנה חוץ גופית של אוסטאוקלסטים ממונוציטים של דם היקפי אנושי. שיטה זו יכולה לשמש ככלי חשוב להבנה נוספת של הביולוגיה של אוסטאוקלסטים בהומאוסטזיס ובמחלות.

הבחנה של אוסטאוקלסטים פונקציונליים ממונוציטים של דם היקפי אנושי CD14+

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0. הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה אופטימלית וניתנת לשחזור ליצירת אוסטאוקלסט במבחנה שניתן להשתמש בה כדי לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס תהליך ההבחנה והפונקציונליות שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לייצר מספר גבוה של אוסטאוקלסטים פעילים פונקציונלית בתוך שבוע בלבד. תפוקת התמיינות גבוהה מושגת על ידי שימוש במונוציטים מטוהרים והוספת ציטוקינים בזמן.אוסטאוקלסטים אחראים להרס עצם בכל צורה של דלקת פרקים, ושיטה זו מספקת את הכלים לסנן תרכובות טיפוליות חדשניות שיכולות לווסת את ההתמיינות שלהם, ו / או תפקודים. מי שתדגים את ההליך תהיה פטרישיה רידלובה, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, לבודד את PBMCs על ידי העברת הדם לתוך צינור 50 מיליליטר חדש.לדלל אותו עם PBS סטרילי בנפח שווה עבור דם טרי, או יחס של 1: 3 עבור קונוסים לויקוציטים ומעילים באפי. מערבבים בעדינות את הדם בהיפוך. הכינו צינורות של 15 מיליליטר המכילים שלושה מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות, ולאט לאט שכבו שמונה עד 10 מיליליטר של דם מדולל בחלק העליון של מדיום שיפוע הצפיפות, תוך הימנעות מערבוב.צנטריפוגה את הצינור ב 400 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ללא בלם. לאחר מכן יש להשליך בזהירות את השכבה העליונה עם פיפטה של פסטר. אספו את השכבה הבין-פאזית התחתונה המכילה את ה-PBMC, והעבירו שכבה זו לצינור חדש של 50 מיליליטר.השהה את התאים עד 50 מיליליטר עם PBS סטרילי, ושטוף את מדיום שיפוע הצפיפות השיורית על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם בלימה מלאה. כדי להסיר שאריות טסיות, חזור על תהליך הצנטריפוגה כמתואר בכתב היד, השהה מחדש את ה- PBMCs המבודדים והמטוהרים ב- 20 מיליליטר PBS, וספור אותם באמצעות המציטומטר בשיטה הסטנדרטית. כדי להעשיר CD14+מונוציטים, העבירו 1 x 10 למרכזייה השביעית לתוך צינור פוליסטירן עגול מתאים, ושפכו את התאים ב 300 x גרם במשך חמש דקות.לאחר השלכת הסופרנאטנט והשעיית כדורית התא במאגר הפרדת תאים, יש לדגור על התאים עם קוקטייל נוגדנים של 10 מיקרוליטר לכל 100 מיקרוליטר עם המכסה למשך 10 דקות. בתום הדגירה מוסיפים 10 מיקרוליטר של ננו-חלקיק מגנטי לחרוזים לכל 100 מיקרוליטר, ודגרים במשך שלוש דקות עם המכסה. הגדל את עוצמת הקול ל- 2.5 מיליליטר באמצעות מאגר הפרדת התא.הכניסו את הצינור למגנט, ודגרו במשך שלוש דקות כשהמכסה כבוי. כעת, השליכו את אוכלוסיית התאים השליליים בתנועה רציפה אחת על ידי היפוך כאשר הצינור עדיין נמצא במגנט. הסר את הצינור מהמגנט, שטוף את המונוציטים המועשרים CD14+ המחוברים לחרוזים המגנטיים על ידי השעייתם מחדש ב -2.5 מיליליטר של חיץ תרחיף התא, והחזיר את הצינור למגנט.ספור את התאים המבודדים כפי שהודגם קודם לכן. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 300 x גרם במשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את התאים במיליון תאים למיליליטר בתווך אלפא חיוני מינימלי מלא עם 10% FBS.כדי להבדיל את האוסטאוקלסט, יש להוסיף M-CSF בריכוז סופי של 25 ננוגרם למיליליטר לתרחיף התא, ולערבב על ידי פיפטציה יסודית כדי ליצור הומוגניות בתרחיף התא. צלחת 100 מיקרוליטר של ההשעיה לכל באר בצלחת שטוחה 96 באר. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים לכל באר סביב התאים המצופים כדי למנוע אידוי בינוני והשפעות קצה במערכת התרבית.לדגור על התאים במשך לילה במשך כ 18 עד 20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. הכינו מדיה טרייה בתוספת ליגנד M-CSF ו-RANK. לאחר הדגירה, יש להסיר בזהירות מחצית מהמדיום על ידי שאיפה באמצעות פיפטה P200, ולהחליף אותו בתווך שלם טרי וחם בתוספת ליגנד M-CSF ו-RANK בריכוז סופי של 25 ננוגרם למיליליטר.התמינו את התאים לאוסטאוקלסטים במשך שבעה עד 14 ימים עם החלפה מלאה של מדיום כל שלושה ימים. לאחר הסרת המדיום, לתקן את osteoclasts דבק מובחן עם 100 מיקרוליטר לכל באר של פתרון קיבוע מוכן, לדגור במשך דקה אחת. אין לגעת בתחתית הבארות כדי למנוע שריטה של התאים הדבקים.לאחר ששטפו את הבארות שלוש פעמים ב-300 מיקרוליטר מים מזוקקים סטריליים, ייבשו את הצלחות והוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעה טרייה לכל באר. דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס בחושך למשך 20 דקות. לאחר הדגירה מסירים את תמיסת הצביעה בהיפוך ושוטפים את הצלחת שלוש פעמים במים מזוקקים של 300 מיקרוליטר לבאר.הסירו את עודפי המים על ידי הקשה על הצלחות על מגבות נייר, והשאירו את הצלחות פתוחות ומוגנות מפני אור לייבוש באוויר למשך הלילה. באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר עם אפשרות אריח, צלם תמונות במהירות של 10x או 20x כדי ללכוד את כל משטח הבאר. ספור ידנית את האוסטאוקלסטים המזוהים כתאים מוכתמים TRAP+סגולים עם יותר משלושה גרעינים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה עם תוסף מונה תאים.צלחת 100 מיקרוליטר של CD14 + מונוציטים מבודדים לכל באר בשקופית תא 18 באר בצפיפות תאים של 1 x 10 לתאים החמישיים לכל באר. להבדיל בין האוסטאוקלסטים בנוכחות ליגנד M-CSF ו-RANK כפי שהודגם קודם לכן עם שינוי מוחלט של מדיום כל שלושה ימים. בנקודת הסיום, הסירו בעדינות את המדיום ושטפו כל באר פעמיים עם 200 מיקרוליטר PBS שחומם מראש ב-pH 7.4.אל תתנו לבארות להתייבש בין השלבים. תקן את הדגימה עם 100 מיקרוליטר לבאר של תמיסת פורמלדהיד 4% ב- PBS, ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית עם ניעור עדין. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר לכל באר של PBS.חדרו את התאים עם 100 מיקרוליטר לבאר של תמיסת טריטון x-100 0.1% מדוללת ב-PBS, ודגרו במשך 10 דקות כפי שהוצג קודם לכן. יש לשטוף פעמיים עם 200 מיקרוליטר לבאר של PBS. כדי לחסום קשירה לא ספציפית ולהגדיל את האות, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת חסימה המיוצרת עם אלבומין בסרום בקר 2% ותמיסת PBS.יש לדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי עם ניעור עדין. לאחר הסרת תמיסת החסימה, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת פלואידין מצומדת פלואורסצנטית מדוללת בתמיסת 2% BSA/PBS לכל באר. יש לשטוף פעמיים עם 200 מיקרוליטר לבאר של PBS.מכתימים את הגרעינים ב-100 מיקרוליטר לבאר של תמיסה של PBS המכילה 300 ננו-טוחן DAPI. לאחר 10 עד 15 דקות, הסר את תמיסת DAPI והחלף אותה ב- PBS של 100 מיקרוליטר לכל באר. דמיינו את הצביעה באמצעות מיקרוסקופים אימונופלואורסצנטיים או קונפוקליים מתאימים פי ארבעה עד 40.האוסטאוקלסטים הבוגרים מוגדרים כ-TRAP+תאי נוקלאט מרובים. התוספת של ליגנד RANK יצרה מספר גדל והולך של אוסטאוקלסטים גדולים מסוג TRAP+multi-nucleated באופן תלוי מינון. הקינטיקה של התמיינות אוסטאוקלסטים ממונוציטים נחקרה במשך תקופת תרבית של יומיים עד 14 ימים.אוסטאוקלסטים מרובי גרעינים נראו מהיום החמישי ואילך, והתמיינות אופטימלית הושגה ביום השביעי. ההבחנה של אוסטאוקלסטים על משטחים מינרליים מאפשרת להעריך את פעילות הספיגה שלהם על ידי ניתוח היווצרות חורים עגולים, או בורות ספיגה. אחוז הספיגה עולה באופן משמעותי בנוכחות ליגנד M-CSF ו- RANK בהשוואה ל- M-CSF בלבד.יתר על כן, טיפול במינון רוטנון תלוי עיכב את ספיגת המשטח המינרלי בהשוואה לבאר הבקרה שלא טופלה. עיכוב תלוי רוטנון של ספיגת אוסטאוקלסטים היה קשור לעיכוב ייצור ATP. הפיצול של טבעת האקטין הנגזרת מליגנד RANK של OCS בוגר נצפה בנוכחות רוטנון.חשוב לוודא כי מונוציטים מועשר אינם מכילים טסיות, כי התאים מצופים בצפיפות הנכונה, וכי הבארות שמסביב מלאים במים כדי למנוע את אפקט הקצה. פרוטוקול זה שימושי במיוחד כדי לחקור באופן מכניסטי כיצד נוצרים אוסטאוקלסטים, ומה משפיע על תפקודם הן במדע בסיסי והן במדע תרגומי. למשל, על ידי שימוש בתרכובות או חלבונים שיכולים לווסת את התהליכים האלה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

הרחבת דם היקפיים האדם γδ T תאים באמצעות Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

הבידוד, בידול, וכימות של האדם נוגדן מפריש תאים B מדם: ELISPOT בתור Readout פונקציונלי של חסינות הלחות

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

בידוד, העברה ותרבות של האדם הראשי המונולוציטים

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...