Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Gli autori ringraziano con gratitudine la Flow Core Facility e la Glasgow Imaging Facility (GIF) all'interno della School of Infection and Immunity per il loro supporto e assistenza in questo lavoro.

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

La facile coltura e l'isolamento di un gran numero di OC funzionali in vitro sono importanti per far progredire la comprensione della biologia ossea e delle malattie mediate da OC. Classicamente, gli OC sono stati generati in co-colture con osteoblasti o cellule stromali e cellule ematopoietiche dalla milza o dal midollo osseo38,39. Un significativo passo avanti nella comprensione dell'osteoclastogenesi è stata l'identificazione di RANKL come il principale regolatore della formazione, differenziazione e sopravvivenza dell'OC40. I primi protocolli dei sistemi di coltura dipendenti da RANKL utilizzavano PBMC per la generazione di OC21,41,42. Tuttavia, queste colture miste sono lunghe e presentano molti fattori confondenti che limitano la capacità di testare gli effetti diretti sulla differenziazione e sulla funzione OC. Questo protocollo descrive un modello in vitro efficiente e affidabile di osteoclastogenesi da monociti CD14+ periferici umani in cui l'osteoclastogenesi ottimale può essere ottenuta entro 7 giorni (Figura 1 e Figura 2), che è considerevolmente più veloce rispetto ad altri protocolli43,44,45,46. Le principali caratteristiche distintive di questo protocollo sono (1) l'uso di monociti CD14+ purificati, (2) l'adescamento dei monociti con M-CSF prima dell'esposizione a RANKL, (3) la durata della coltura (<7 giorni) e (4) il rilevamento affidabile dell'inibizione della formazione di OC (colorazione TRAP) e della funzione (riassorbimento, produzione di ATP, riorganizzazione dell'anello di actina) con inibitori. 
Durante l'ottimizzazione della metodologia sono stati identificati diversi punti critici. È stato osservato che la differenziazione in vitro degli OC dipende in gran parte dalla densità di semina dei monociti CD14+. Pertanto, in questo protocollo, le cellule sono seminate ad alta densità (1 x 105 cellule / pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, in 100 μL di mezzo), poiché è essenziale che le cellule siano in grado di interagire tra loro e di essere in prossimità di fondersi e diventare OC maturi. Allo stesso modo, la semina di cellule a una densità troppo elevata limita la loro differenziazione e crescita a causa delle limitazioni medie e della mancanza dello spazio richiesto. Inoltre, per ottenere il massimo successo con questo protocollo, è importante eseguire attentamente la separazione del gradiente di densità e garantire che la popolazione arricchita di cellule CD14+ sia il più pura possibile. Ad esempio, fasi di lavaggio inadeguate provocano una mancanza di rimozione delle piastrine, che di conseguenza inibisce la differenziazione OC47,48. Allo stesso modo, la presenza di contaminazione minore delle cellule T in preparati CD14+ isolati stimolati con M-CSF da solo può provocare la differenziazione OC, potenzialmente attraverso la secrezione di RANKL da parte delle cellule T49. Pertanto, è importante includere un controllo M-CSF per ogni esperimento. Si raccomanda inoltre un controllo di purezza di routine, soprattutto quando si utilizza un nuovo kit di isolamento, per garantire la purezza del campione.
I numeri OC ottimali (intervallo: ~200-1.600 OC/pozzetto) sono ottenuti utilizzando mezzo α-MEM arricchito con nucleosidi e L-glutammina. Altri terreni di coltura convenzionali, tra cui il terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) e il terreno di coltura 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), influenzano la resa OC. La fonte di FBS può anche influenzare l'osteoclastogenesi. Diversi lotti di FBS possono portare a una riduzione dell'osteoclastogenesi derivata da RANK-L, nonché alla comparsa di un basso numero di cellule multinucleate TRAP+ nei controlli M-CSF (Figura 3 supplementare). Pertanto, per ottenere risultati coerenti, si consiglia di testare nuovi lotti FBS prima dell'uso e di continuare con lo stesso lotto durante gli esperimenti per ridurre al minimo le variazioni nel processo di differenziazione. Inoltre, la variabilità da donatore a donatore, in termini di numero totale di OC differenziati ottenuti al punto temporale finale, costituisce una limitazione quando si utilizza questo protocollo per confrontare, ad esempio, donatori sani con pazienti. In questi casi, è imperativo utilizzare esattamente le stesse condizioni e lo stesso lotto di mezzo, FBS e altri reagenti.
Un altro passo necessario per la differenziazione e la maturazione ottimale dell'OC è l'adescamento dei monociti con M-CSF prima dell'aggiunta di RANKL. L'esposizione delle cellule a M-CSF 18-24 ore prima di RANKL prepara i monociti a sovraregolare l'espressione di RANK15,26. L'aggiunta di RANKL in questo momento garantisce una differenziazione OC ottimale in modo dose-dipendente. Il grado di differenziazione OC varia da donatore a donatore; tuttavia, 25 ng/mL RANKL sono di solito sufficienti per differenziare un numero elevato di OC nella maggior parte dei donatori. Inoltre, 25 ng/mL RANKL possono essere utilizzati nei saggi per lo screening iniziale dei composti, in quanto facilita la valutazione degli effetti potenzianti e inibitori dei composti in esame. Altri sistemi di coltura hanno utilizzato tempi di pre-incubazione M-CSF più lunghi prima dell'aggiunta di RANKL, ma ciò si traduce in un tempo di coltura più lungo per l'osteoclastogenesi50. Inoltre, lasciare i monociti innescati per incubare durante la notte consente loro di attaccarsi alla piastra, anche se non in uno stato completamente aderente. Pertanto, quando RANKL viene introdotto per la prima volta, il terreno deve essere cambiato a metà con molta attenzione piuttosto che completamente cambiato per prevenire il distacco e la perdita dei monociti innescati. Il terreno deve anche essere rinfrescato ogni 3-4 giorni per evitare l'esaurimento del mezzo e prevenire la morte cellulare. Inoltre, a causa del basso volume utilizzato in questo test (100 μL/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti), è della massima importanza disporre di una struttura di pozzetti vuoti riempiti con una soluzione acquosa (cioè H2O o PBS distillato sterile) attorno ai pozzetti di analisi. Ciò impedisce l'evaporazione media e gli effetti dei bordi.
Infine, per i saggi metabolici (ad esempio, i saggi ATP), è imperativo che le cellule siano vitali per evitare un'enorme deviazione standard tra le repliche (Figura 5). Un'elevata vitalità delle cellule è importante anche per la selezione delle cellule e per l'ulteriore coltura degli OC selezionati (Figura 4). Questo metodo, tuttavia, ha diverse limitazioni. Gli OC completamente maturi sono molto aderenti e difficili da staccare dalle piastre. Gli OC più grandi sono spesso impossibili da staccare, il che può portare a una minore resa cellulare. Pertanto, le cellule devono essere contate dopo la selezione e prima della placcatura alla concentrazione richiesta. Inoltre, nel presente protocollo, viene utilizzato un metodo non enzimatico (accutasi) per staccare gli OC per prevenire alterazioni della membrana nella colorazione superficiale a valle per la citometria a flusso. Anche l'uso di raschiatori cellulari (sia con terminazioni morbide che dure) è stato testato e ha portato a un'elevata morte cellulare. Il distacco enzimatico con soluzioni di tripsina/EDTA allo 0,05% può essere utilizzato per una maggiore resa di OC distaccati quando l'integrità della membrana non è richiesta per applicazioni a valle. Inoltre, per evitare che gli OC si aggreghino, l'uso di un'alta concentrazione di EDTA in tutti i tamponi dopo il distacco della cellula, nonché un appropriato filtraggio prima dell'acquisizione della citometria a flusso, sono altamente raccomandati. È importante notare che le colture OC sono una popolazione eterogenea di cellule costituite da OC maturi, precursori OC e macrofagi. I macrofagi possono essere facilmente distinti dagli OC, sebbene sia i pre-OC mononucleati che gli OC multinucleari esprimano OSCAR e non possano essere distinti con il presente metodo (Figura 4). In effetti, quest'ultima questione costituisce il principale limite di questo metodo. Inoltre, una bassa espressione di OSCAR è presente anche nelle colture M-CSF (Figura 4B) e potrebbe indicare macrofagi che sono pronti per l'impegno del lignaggio OC. È importante impostare il gate per le celle OSCAR+ in base al segnale di colorazione FMO, come mostrato nella Figura 4B.
In sintesi, questo protocollo descrive un metodo ottimizzato e robusto per la produzione efficiente di OC attivi e funzionalmente maturi da monociti umani primari circolanti. Il punto di forza di questo protocollo è la sua capacità di generare OC in una breve durata di tempo e produrre un numero elevato di OC differenziati. Questo metodo apre la strada allo studio dei meccanismi di base alla base della differenziazione e della funzione OC.

Gli osteoclasti (OC) sono cellule giganti multinucleate di linea ematopoietica con una capacità unica di riassorbire l'osso. Sono responsabili dello sviluppo e del continuo rimodellamento dello scheletro 1,2. Nelle fasi scheletriche dello sviluppo, gli OC e i macrofagi residenti nei tessuti derivano da progenitori eritro-mieloidi e colonizzano la nicchia ossea e i tessuti degli organi. In condizioni fisiologiche, i progenitori eritromieloidi sono necessari per il normale sviluppo osseo e l'eruzione dei denti, mentre l'afflusso di monociti circolanti nella nicchia ossea fornisce il mantenimento postnatale degli OC, della massa ossea e della cavità del midollo osseo3. In condizioni patologiche, i monociti vengono reclutati in siti di infiammazione attiva e possono contribuire alla distruzione ossea patologica 4,5.
I pazienti con diverse forme di artrite sperimentano infiammazione articolare, che porta alla progressiva distruzione articolare causata da OCs6. Ad esempio, nell'artrite reumatoide (RA), gli OC iperattivati sono responsabili dell'erosione ossea patologica e della distruzione articolare 7,8 e i trattamenti attuali spesso non migliorano o arrestano il danno osseo 9,10,11. Alterazioni dei monociti circolanti sia in termini di distribuzione della popolazione che di firme trascrittomiche ed epigenetiche sono state riportate nei pazienti con AR12,13,14. Inoltre, è stato riportato che le risposte alterate dei monociti alla stimolazione infiammatoria influenzano l'osteoclastogenesi nei pazienti con AR con malattia attiva15,16,17.
La differenziazione delle OC è un complesso processo a più fasi che comprende l'impegno delle cellule precursori mieloidi nella differenziazione in precursori OC. Durante l'osteoclastogenesi, gli OC diventano giganti e multinucleati attraverso la fusione cellula-cellula, citochinesi incompleta e un processo di riciclaggio nucleare descritto come fissione e fusione18,19,20. La capacità di differenziare gli OC in vitro ha permesso progressi significativi nella comprensione della biologia ossea21. Gli OC si differenziano dai precursori dopo esposizione al fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e all'attivatore del recettore del ligando kappa-B del fattore nucleare (RANKL). Quest'ultimo è essenziale per il normale sviluppo e funzione delle OC in vitro e in vivo, anche in condizioni infiammatorie 6,22,23. RANKL è presentato da osteoblasti e osteociti, nonché da cellule T attivate e fibroblasti nella sinovia infiammata RA 2,24,25. Durante il processo di differenziazione OC, i monociti esposti a M-CSF sovraregolano l'attivatore del recettore dell'espressione del fattore nucleare kappa-B (RANK) sulla loro membrana cellulare e, sotto successiva stimolazione con RANKL, si differenziano in pre-OC mononucleati positivi alla fosfatasi acida resistente ai tartrati (TRAP) e quindi in OC multinucleati15,26. Gli OC producono diversi enzimi, il principale tra questi è TRAP, che consente la degradazione delle fosfoproteine all'interno dell'osso27. Un regolatore e marcatore della differenziazione OC è il recettore associato all'OC (OSCAR). È sovraregolata precocemente nelle cellule precursori che si impegnano nella linea OC28. Gli OC multinucleati giganti maturi possono degradare (riassorbire) la matrice scheletrica generando una grande zona di tenuta, che è costituita da un anello di actina che circonda un bordo arruffato21,29,30. La capacità di riassorbimento osseo degli OC richiede la riorganizzazione del citoscheletro e la conseguente polarizzazione e formazione di una membrana contorta, che è il cosiddetto bordo arruffato. Il bordo arruffato è circondato da una grande fascia circolare di una struttura ricca di F-actina, che è l'anello di actina o zona di sigillatura. L'integrità dell'anello di actina è essenziale per gli OC per riassorbire l'osso sia in vitro che in vivo, e la formazione difettosa del bordo arruffato è associata a una minore espressione vacuolare di adenosina trifosfatasi (V-ATPasi)31,32,33. Inoltre, gli OC sono cellule ricche di mitocondri e l'adenosina trifosfato (ATP) si associa a strutture simili ai mitocondri negli OC localizzati sul bordo arruffato31,32,33. Il rotenone agisce come un forte inibitore del complesso mitocondriale I e influisce sulla produzione di ATP. Rotenone ha anche dimostrato di inibire la differenziazione OC e la funzione34.
Questo protocollo descrive un metodo efficiente e ottimizzato di osteoclastogenesi in vitro da campioni di sangue periferico umano. Nel sangue periferico umano, i monociti CD14+ sono la principale fonte di OCs15,35,36. In questo protocollo, la cinetica di esposizione e le concentrazioni di M-CSF e RANKL sono state regolate per un'osteoclastogenesi ottimale. Le cellule mononucleate vengono prima separate dagli eritrociti e dai granulociti presenti nel sangue intero per gradiente di densità; vengono quindi arricchiti per i monociti CD14+ utilizzando la selezione positiva mediante sfere magnetiche. I monociti CD14+ isolati vengono quindi incubati durante la notte con M-CSF. Questo prepara i monociti a sovraregolare l'espressione di RANK15,26. La successiva aggiunta di RANKL induce osteoclastogenesi e multinucleazione in modo dipendente dal tempo. Gli OC a riassorbimento attivo mostrano la distribuzione caratteristica degli anelli F-actina sul bordo della membrana cellulare30,32 e la colorazione per TRAP. Gli OC maturi vengono analizzati quantificando le cellule multinucleate TRAP+ (più di tre nuclei). La capacità funzionale degli OC maturi può essere valutata dal loro riassorbimento, dall'integrità dell'anello di actina e dalla produzione di ATP. Inoltre, gli OC CD14− OSCAR+ differenziati possono essere arricchiti e utilizzati per valutare gli effetti di alcuni composti sulla funzionalità OC attraverso il riassorbimento minerale (o dentinale) e l'organizzazione F-actina. Inoltre, in questo lavoro, un noto inibitore OC, rotenone, viene utilizzato come esempio di un composto che influenza la funzionalità degli OC. La ridotta attività di riassorbimento OC sotto rotenone è associata a una ridotta produzione di ATP e alla frammentazione dell'anello di actina. In conclusione, questo protocollo stabilisce un saggio robusto che può essere utilizzato come metodo di riferimento per studiare diversi aspetti biologici del differenziamento e della funzione OC in vitro. 
Questa metodologia può essere utilizzata per valutare (1) il potenziale dei monociti circolanti di differenziarsi in OC in salute e malattie, nonché (2) l'impatto dei candidati terapeutici sulla differenziazione e sulla funzione OC. Questo robusto protocollo di osteoclastogenesi consente di determinare l'efficacia e i meccanismi delle terapie mirate all'osso sia sulla differenziazione OC dalle cellule precursori che sulla funzione delle OC mature.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Gli osteoclasti (OC) sono cellule che riassorbono l'osso e svolgono un ruolo fondamentale nello sviluppo scheletrico e nel rimodellamento osseo adulto. Diversi disturbi ossei sono causati da una maggiore differenziazione e attivazione degli OC, quindi l'inibizione di questa patobiologia è un principio terapeutico chiave. Due fattori chiave guidano la differenziazione degli OC dai precursori mieloidi: il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e l'attivatore del recettore del ligando kappa-B del fattore nucleare (RANKL). I monociti CD14+ circolanti umani sono noti da tempo per differenziarsi in OC in vitro. Tuttavia, il tempo di esposizione e la concentrazione di RANKL influenzano l'efficienza di differenziazione. In effetti, sono stati descritti protocolli per la generazione di OC umani in vitro , ma spesso si traducono in un processo di differenziazione scarso e lungo. Qui viene fornito un protocollo robusto e standardizzato per generare OC umani maturi funzionalmente attivi in modo tempestivo. I monociti CD14+ sono arricchiti da cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) e innescati con M-CSF per sovraregolare RANK. La successiva esposizione a RANKL genera OC in modo dipendente dalla dose e dal tempo. Gli OC sono identificati e quantificati mediante colorazione con fosfatasi resistente agli acidi tartrati (TRAP) e analisi al microscopio ottico. La colorazione a immunofluorescenza dei nuclei e della F-actina viene utilizzata per identificare OC funzionalmente attivi. Inoltre, gli OC maturi OSCAR+CD14− sono ulteriormente arricchiti attraverso la selezione delle cellule di citometria a flusso e la funzionalità OC quantificata mediante saggi di riassorbimento minerale (o dentina/osso) e formazione di anelli di actina. Infine, un noto inibitore OC, il rotenone, viene utilizzato su OC maturi, dimostrando che la produzione di adenosina trifosfato (ATP) è essenziale per l'integrità dell'anello di actina e la funzione OC. In conclusione, in questo lavoro viene stabilito un robusto saggio per differenziare un numero elevato di OC, che in combinazione con la colorazione dell'anello di actina e un test ATP fornisce un utile modello in vitro per valutare la funzione OC e per lo screening di nuovi composti terapeutici in grado di modulare il processo di differenziazione.

Generazione di OC da monociti CD14+ Questo metodo mirava a differenziare facilmente un gran numero di OC dai monociti CD14+ del sangue periferico umano in vitro, tipicamente in 1 settimana. In primo luogo, i monociti CD14+ sono stati arricchiti da PBMC e innescati con M-CSF durante la notte per sovraregolare RANK, come precedentemente riportato15. Dopo l'adescamento dei monociti, per determinare la concentrazione ottimale di RANKL per la differenziazione e la maturazione OC, sono state utilizzate concentrazioni RANKL di 1 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL e 100 ng / mL, insieme a 25ng / mL M-CSF. L'aggiunta di RANKL ha prodotto un numero crescente di grandi OC multinucleati TRAP-positivi in modo dose-dipendente, e questo è stato valutato utilizzando la colorazione TRAP. Gli OC maturi sono definiti come cellule TRAP-positive con nuclei multipli (tipicamente più di tre; Figura 2A, B e figura supplementare 1). Inoltre, la cinetica della differenziazione OC dai monociti è stata studiata utilizzando la colorazione TRAP e la microscopia ottica per un periodo di coltura di 2-14 giorni. In questo caso, è stata scelta la differenziazione OC utilizzando una concentrazione intermedia di 50 ng/mL RANKL per valutare la velocità con cui gli OC si differenziano in coltura. In queste condizioni di coltura, gli OC multinucleati erano visibili dal giorno 5 in poi e la differenziazione ottimale è stata raggiunta il giorno 7 (Figura 2C). L'incubazione prolungata di colture oltre i 10 giorni sulla plastica ha portato a cellule fuse anormalmente giganti. In questo protocollo, i giorni 6-8 vengono solitamente utilizzati come endpoint ottimale della generazione di OC. Gli OC possono essere quantificati o utilizzati per saggi a valle.
Valutazione funzionale dei CO differenziati Per determinare l'attività funzionale degli OC generati, abbiamo esaminato la loro attività di riassorbimento differenziando gli OC su una superficie mineralizzata. Poiché i grandi OC vengono generati solo dopo un periodo di coltura di 7 giorni e per consentire un tempo sufficiente per riassorbire il substrato minerale, le colture sono state mantenute fino al giorno 10. La formazione di fori rotondi, o pozzi di riassorbimento, è stata osservata solo sulle superfici mineralizzate di pozzetti contenenti cellule che erano state trattate sia con M-CSF che con RANKL (Figura 3). Pertanto, la percentuale di superficie mineralizzata disciolta (pozzi di riassorbimento) consente di determinare la capacità di riassorbimento OC. Inoltre, gli OC differenziati seguendo questo protocollo fino al giorno 7, sia su vetrini in plastica che in vetro, hanno mostrato una struttura ad anello di actina ben organizzata che potrebbe essere visualizzata mediante colorazione immunofluorescente (Figura supplementare 2).
Effetto di un inibitore sulla funzione OC matura Le condizioni di coltura sopra menzionate sono state utilizzate per determinare la capacità funzionale degli OC generati in vitro in presenza del noto inibitore OC, rotenone34. Le OC sono state differenziate per 6-8 giorni e le OC CD14-OSCAR+ e i precursori OC sono stati arricchiti tramite citometria a flusso (Figura 4). Le cellule arricchite sono state quindi placcate a 50.000 cellule/per pozzetto su una piastra a 96 pozzetti rivestita di minerali in mezzo pro-osteoclastogenico (25 ng/mL M-CSF e RANKL) per 3 giorni. Il trattamento con rotenone (Figura 5A,B) ha inibito in modo dose-dipendente il riassorbimento della superficie mineralizzata rispetto al pozzo di controllo non trattato, coerentemente con gli studi precedenti34. Inoltre, la funzionalità OC è stata valutata tramite la produzione di ATP e la formazione di anelli di actina. L'inibizione rotenone-dipendente del riassorbimento OC è stata associata all'inibizione della produzione di ATP (Figura 5C). Gli OC riassorbenti sono cellule altamente polarizzate che regolano la loro capacità di riassorbimento promuovendo l'organizzazione citoscheletrica. La falloidina coniugata Alexa fluor 647 è stata utilizzata per marcare il citoscheletro F-actina degli OC maturi coltivati in presenza o assenza di rotenone. Il rotenone ha causato la frammentazione dell'anello di actina derivato da RANKL degli OC maturi (Figura 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> Figura 2: OC che si differenziano efficacemente dai precursori dei monociti CD14+ . I monociti CD14+ sono stati arricchiti magneticamente, placcati a 1 x 105 cellule/pozzetto in piastre a 96 pozzetti e incubati durante la notte con 25 ng/mL M-CSF. (A) I monociti M-CSF-innescati sono stati stimolati con concentrazioni crescenti di RANKL (1 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL e 100 ng / mL), fissati e colorati per TRAP il giorno 7. Sono state acquisite immagini e sono state contate le cellule multinucleate (MNC) TRAP+ . Le immagini rappresentative della colorazione TRAP sono mostrate nella Figura supplementare 1. Le barre di errore mostrano la media ± SD (n = 3). I dati sono stati analizzati con un test unidirezionale di confronto multiplo di ANOVA e Holm-Sidak per i dati accoppiati; * P ≤ 0,05 e ** P ≤ 0,005. (B) Immagine rappresentativa di un pozzetto colorato con TRAP di una piastra a 96 pozzetti che mostra la quantità tipica di OC/pozzo atteso e la loro morfologia inferiore a 25 ng/mL RANK-L rispetto ai macrofagi derivati da M-CSF al giorno 7. Barre della scala: 1000 μm. (C) Immagini rappresentative della formazione di OC sotto 50 ng/mL RANKL valutate tramite colorazione TRAP dal giorno 2 al giorno 14. Gli OC sono visibili dal giorno 5 in poi. OC giganti anormalmente fusi sono presenti dopo 10 giorni. Barre di scala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> Figura 3: OC di riassorbimento differenziati dai monociti CD14+ . Le cellule CD14+ isolate dalle PBMC sono state differenziate per 10 giorni in OC in presenza di 25 ng/mL M-CSF (M) e RANKL (R) su piastre di superficie di saggio minerale (osteo-assay). (A) Immagini di pozzi rappresentativi ricostruiti presi a ingrandimento 10x per analizzare il riassorbimento il giorno 10 (substrato minerale in grigio; pozzi di riassorbimento in bianco). Barre della scala: 1000 μm. (B) Quantificazione della percentuale di area riassorbita. I dati di riassorbimento sono stati analizzati con un'analisi accoppiata di Wilcoxon. Le barre di errore mostrano la media ± SD (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> Figura 4: Arricchimento citometrico a flusso di OC CD14−OSCAR+. I monociti CD14+ sono stati arricchiti dalle PBMC e gli OC sono stati differenziati come descritto in precedenza. Le colture OC aderenti sono state staccate con accutasi e colorate per citometria a flusso. (A-C) Gli OC al giorno 8 sono stati ordinati in base all'espressione CD14 e OSCAR. (A) Strategia di smistamento rappresentativa. Le cellule sono state contrassegnate come singoletto, negative per la colorazione morta, e sono stati ordinati i sottogruppi CD14+ OSCAR+ (rosso) e CD14− OSCAR+ (blu). (B) Grafici rappresentativi che mostrano la sovrapposizione della colorazione OSCAR degli OC derivati da RANKL (ciano) e dei macrofagi derivati da M-CSF di controllo (arancione). In rosso è riportato il controllo OSCAR colorato con isotipo degli OC derivati da RANKL. (C) Le popolazioni selezionate sono state placcate su plastica e lasciate aderire per 2 ore in mezzo pro-OC (25 ng / mL M-CSF e 50 ng / mL RANKL), seguite da colorazione e visualizzazione TRAP. Le immagini rappresentative mostrano una mancanza di cellule TRAP+ nel sottogruppo CD14+ (rosso) e pre-OC e OC TRAP+ mono- e multinucleati nel sottogruppo CD14− (blu). Barre di scala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> Figura 5: Saggi per valutare la funzione degli OC maturi. Per valutare la funzione delle OC mature, le cellule CD14+ isolate dalle PBMC sono state coltivate con M-CSF (M) da solo o combinate con RANKL (R) per 7 giorni, le OC sono state arricchite tramite citometria a flusso e le OC sono state quindi trattate con l'inibitore rotenone per 24 ore. (A) Le OC mature sono state selezionate tramite citometria a flusso (CD14-OSCAR+) e sono stati coltivati su una superficie di saggio minerale in presenza o assenza di rotenone per 3 giorni, dopo di che le cellule sono state sbiancate e visualizzate a 10x per rivelare l'area riassorbita (pozzi di riassorbimento in bianco). (A) Immagini rappresentative ricostruite dei pozzi. Barre di scala: 1000 μm. (B) La quantificazione della percentuale di area riassorbita. I dati in (B) sono stati analizzati con un ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Dunn (n = 7); * P ≤ 0,05 e** P ≤ 0,01. Le barre di errore mostrano la media ± DS. (C) Contenuto totale di ATP intracellulare di OC maturi indifferenziati e al giorno 7 differenziati differenziati con RANKL e trattati con veicolo o rotenone (10 nM e 30 nM). Qui, 2DG e oligomicina sono stati utilizzati come controlli positivi per il test e sono stati aggiunti 30 minuti prima della lisi cellulare e della quantificazione dell'ATP. Le barre di errore mostrano la media ± SD (n = 4). I dati sono stati analizzati con un test di confronto multiplo ANOVA unidirezionale e Dunnett per i dati accoppiati. ** P ≤ 0,01. (D) Un'immagine rappresentativa 20x di OC maturi colorati per la formazione dell'anello di actina (rosso) e dei nuclei (blu), che mostra la perdita dell'anello di actina con l'inibitore. Barre di scala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Formato piastra</td>
			<td>96 pozzetti</td>
			<td>48 pozzetti</td>
			<td>24 pozzetti</td>
			<td>12 pozzetti</td>
			<td>6 pozzetti</td>
		</tr><tr><td>volume</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225–250 μL</td>
			<td>450–500 μL</td>
			<td>0,8–1 mL</td>
			<td>1,8–2 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Volume della sospensione di celle per diversi formati di piastre. I volumi sono calcolati a partire da una soluzione 1 x 106 cellule/mL e forniscono una densità ottimale per la fusione cellula-cellula.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Fluoroforo, clone</td>
			<td>Volume (μL) per 106 celle</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/Cianina7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer di ordinamento delle celle</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2 : Soluzione master mix di anticorpi. 
Figura supplementare 1: Colorazione TRAP della risposta alla dose RANKL. I monociti CD14+ sono stati arricchiti magneticamente, placcati a 1 x 105 cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti e incubati durante la notte con 25 ng/mL M-CSF, come in Figura 2. Le immagini rappresentative della colorazione TRAP mostrano monociti MCSF-innescati stimolati con concentrazioni crescenti di RANKL (1 ng / mL, 25 ng / mL, 50 ng / mL e 100 ng / mL), fissi e colorati per TRAP il giorno 7. Barre scala: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2: Colorazione dell'anello ad azione in OC completamente differenziati. (A) Un ingrandimento 10x di OC differenziati su plastica TC e colorati con falloidina AF647 (in rosso). Barra della scala: 400 μm. (B) Ingrandimento 40x di OC differenziati su vetrini a camera di vetro e colorati con falloidina AF488 (in giallo). Barra della scala: 100 μm.I nuclei sono colorati con DAPI, mostrati in blu in (A) e in ciano in (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 3: Effetto di diversi lotti FBS sull'efficienza di differenziazione OC. Gli OC sono stati differenziati dai monociti CD14+ in presenza di 25 ng/mL M-CSF e 50 ng/mL RANKL (MR) per 7 giorni. I pozzi di controllo avevano solo M-CSF (M). (A) Ingrandimenti rappresentativi 10x (barre della scala: 400 μm) e (B) quantificazione degli OC colorati con TRAP differenziati da un donatore in due diversi lotti di FBS. Le barre di errore mostrano la media ± SD di tre repliche tecniche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Gli osteoclasti sono cellule chiave che riassorbono le ossa nel corpo. Questo protocollo descrive un metodo affidabile per la differenziazione in vitro degli osteoclasti dai monociti del sangue periferico umano. Questo metodo può essere utilizzato come uno strumento importante per comprendere ulteriormente la biologia degli osteoclasti nell'omeostasi e nelle malattie.

Differenziazione degli osteoclasti funzionali dai monociti CD14+ del sangue periferico umano

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0.Il nostro protocollo descrive un metodo ottimizzato e riproducibile per generare osteoclasti in vitro che può essere utilizzato per studiare i meccanismi alla base del loro processo di differenziazione e funzionalità. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di generare un numero elevato di osteoclasti funzionalmente attivi in una sola settimana. L'alta resa differenziale si ottiene utilizzando monociti purificati e aggiungendo citochine in tempo.Gli osteoclasti sono responsabili della distruzione ossea in tutte le forme di artrite e questo metodo fornisce gli strumenti per lo screening di nuovi composti terapeutici che possono modulare la loro differenziazione e / o funzioni. A dimostrare la procedura sarà Patricia Riedlova, una dottoranda del nostro laboratorio. Per iniziare, isolare le PBMC trasferendo il sangue in un nuovo tubo da 50 millilitri.Diluirlo con PBS sterile in un volume uguale per il sangue fresco o un rapporto 1: 3 per coni leucocitari e manti buffy. Mescolare delicatamente il sangue per inversione. Preparare tubi da 15 millilitri contenenti tre millilitri di mezzo di gradiente di densità e stratificare lentamente da otto a 10 millilitri di sangue diluito sulla parte superiore del mezzo di gradiente di densità, evitando di mescolare.Centrifugare il tubo a 400 x g per 30 minuti a temperatura ambiente senza freno. Quindi scartare con attenzione lo strato superiore con una pipetta Pasteur. Raccogliere lo strato interfase sottostante contenente le PBMC e trasferire questo strato in un nuovo tubo da 50 millilitri.Sospendere le celle fino a 50 millilitri con PBS sterile e lavare via il mezzo del gradiente di densità residuo centrifugando a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente con freno pieno. Per rimuovere le piastrine residue, ripetere il processo di centrifugazione come descritto nel manoscritto, risospendere le PBMC isolate e purificate in 20 millilitri di PBS e contarle utilizzando un ematocitometro seguendo il metodo standard. Per arricchire i monociti CD14+, trasferire 1 x 10 al settimo PBMC in un tubo di polistirene a fondo rotondo adatto e pellettare le cellule a 300 x g per cinque minuti.Dopo aver scartato il surnatante e risospeso il pellet cellulare nel tampone di separazione cellulare, incubare le cellule con 10 microlitri di cocktail di anticorpi per 100 microlitri con il coperchio acceso per 10 minuti. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 10 microlitri di sfere di nanoparticelle magnetiche per 100 microlitri e incubare per tre minuti con il coperchio. Riempire il volume a 2,5 millilitri con il tampone di separazione cellulare.Posizionare il tubo in un magnete e incubare per tre minuti con il coperchio spento. Ora, scartare la popolazione di cellule negative con un movimento continuo per inversione mentre il tubo è ancora nel magnete. Rimuovere il tubo dal magnete, lavare i monociti CD14+ arricchiti attaccati alle sfere magnetiche risospendendoli in 2,5 millilitri del tampone di sospensione cellulare e riposizionare il tubo nel magnete.Contare le celle isolate come dimostrato in precedenza. Centrifugare le cellule raccolte a 300 x g per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule a 1 milione di cellule per millilitro in mezzo essenziale alfa minimo completo con 10% FBS.Per differenziare l'osteoclasto, aggiungere M-CSF a una concentrazione finale di 25 nanogrammi per millilitro alla sospensione cellulare e mescolare mediante pipettaggio completo per omogeneizzare la sospensione cellulare. Piastra 100 microlitri della sospensione per pozzetto in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere 200 microlitri di acqua distillata sterile per pozzetto attorno alle cellule placcate per prevenire l'evaporazione media e gli effetti del bordo nel sistema di coltura.Incubare le cellule durante la notte per circa 18-20 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Preparare nuovi mezzi integrati con M-CSF e ligando RANK. Dopo l'incubazione, rimuovere con cura metà del terreno mediante aspirazione utilizzando una pipetta P200 e sostituirlo con un mezzo completo fresco e caldo integrato con legante M-CSF e RANK ad una concentrazione finale di 25 nanogrammi per millilitro.Differenziare le cellule in osteoclasti da sette a 14 giorni con una sostituzione completa del terreno ogni tre giorni. Dopo aver rimosso il mezzo, fissare gli osteoclasti aderenti differenziati con 100 microlitri per pozzetto della soluzione fissativa preparata e incubare per un minuto. Non toccare il fondo dei pozzetti per evitare di graffiare le cellule aderenti.Una volta che i pozzetti vengono lavati tre volte con 300 microlitri di acqua distillata sterile, toccare le piastre asciutte e aggiungere 100 microlitri di soluzione colorante appena preparata a ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius al buio per 20 minuti. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione colorante per inversione e lavare la piastra tre volte con 300 microlitri per pozzetto di acqua distillata.Rimuovere l'acqua in eccesso picchiettando i piatti su carta assorbente e lasciare i piatti aperti e protetti dalla luce all'aria per tutta la notte. Utilizzando un microscopio a campo chiaro con un'opzione di piastrelle, scattare immagini a 10x o 20x per catturare l'intera superficie del pozzo. Contare manualmente gli osteoclasti identificati come cellule colorate di TRAP + viola con più di tre nuclei utilizzando un software di analisi delle immagini con un plug-in di contatore cellulare.Piastra 100 microlitri dei monociti CD14 + isolati per pozzetto in una camera a 18 pozzetti con una densità cellulare di 1 x 10 alla quinta cellula per pozzetto. Differenziare gli osteoclasti in presenza di M-CSF e ligando RANK come dimostrato in precedenza con un cambio completo del terreno ogni tre giorni. Al punto temporale finale, rimuovere delicatamente il mezzo e lavare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di PBS preriscaldato a pH 7,4.Non lasciare asciugare i pozzetti tra i gradini. Fissare il campione con 100 microlitri per pozzetto di soluzione di formaldeide al 4% in PBS e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale con agitazione delicata. Dopo l'incubazione, lavare le cellule due volte con 200 microlitri per pozzetto di PBS.Permeabilizzare le cellule con 100 microlitri per pozzetto di soluzione Triton x-100 allo 0,1% diluita in PBS e incubare per 10 minuti come mostrato in precedenza. Lavare due volte con 200 microlitri per pozzetto di PBS. Per bloccare il legame non specifico e aumentare il segnale, aggiungere 100 microlitri di soluzione bloccante fatta con albumina sierica bovina al 2% e soluzione PBS.Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale con leggero scuotimento. Dopo aver rimosso la soluzione bloccante, aggiungere 100 microlitri di soluzione di falloidina coniugata fluorescentmente diluita in soluzione al 2% BSA / PBS a ciascun pozzetto. Lavare due volte con 200 microlitri per pozzetto di PBS.Colorare i nuclei con 100 microlitri per pozzetto di una soluzione di PBS contenente 300 DAPI nanomolari. Dopo 10-15 minuti, rimuovere la soluzione DAPI e sostituirla con PBS da 100 microlitri per pozzetto. Visualizza la colorazione usando microscopi immunofluorescenza o confocali appropriati da quattro a 40x.Gli osteoclasti maturi sono definiti come cellule nucleate multiple TRAP+. L'aggiunta del ligando RANK ha prodotto un numero crescente di grandi osteoclasti TRAP+multi-nucleati in modo dose-dipendente. La cinetica della differenziazione degli osteoclasti dai monociti è stata studiata in un periodo di coltura da due a 14 giorni.Gli osteoclasti multinucleati erano visibili dal quinto giorno in poi e la differenziazione ottimale è stata raggiunta il settimo giorno. La differenziazione degli osteoclasti su superfici mineralizzate permette di valutarne l'attività di riassorbimento analizzando la formazione di fori rotondi, o pozzi di riassorbimento. La percentuale di riassorbimento aumenta significativamente in presenza di M-CSF e ligando RANK rispetto al solo M-CSF.Inoltre, il trattamento con rotenone dose-dipendente ha inibito il riassorbimento della superficie mineralizzata rispetto al pozzo di controllo non trattato. L'inibizione rotenone-dipendente del riassorbimento degli osteoclasti è stata associata all'inibizione della produzione di ATP. La frammentazione dell'anello di actina derivato dal ligando RANK dell'OCS maturo è stata osservata in presenza di rotenone.È importante assicurarsi che i monociti arricchiti non contengano piastrine, che le cellule siano placcate alla giusta densità e che i pozzetti circostanti siano riempiti d'acqua per evitare l'effetto bordo. Questo protocollo è particolarmente utile per interrogare meccanicamente come si formano gli osteoclasti e cosa influenza la loro funzionalità sia nella scienza di base che traslazionale. Ad esempio, utilizzando composti o proteine in grado di modulare questi processi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

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Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Imaging quantitativa di Lineage specifici Toll-like receptor-mediate Signaling in monociti e cellule dendritiche da piccoli campioni di sangue umano

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Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione

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Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

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The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

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La differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati CD34 cellule+

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Isolamento, trasfezione e cultura dei monociti umani primari

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...