Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

저자는 이 작업에 대한 지원과 지원에 대해 감염 및 면역 학교 내의 Flow Core Facility와 Glasgow Imaging Facility(GIF)에 감사드립니다.

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

시험관 내에서 많은 수의 기능적 OC를 쉽게 배양하고 분리하는 것은 뼈 생물학 및 OC 매개 질환에 대한 이해를 높이는 데 중요합니다. 고전적으로, OC는 조골세포 또는 기질 세포 및 비장 또는 골수로부터의 조혈 세포와의 공동 배양에서 생성되었다38,39. 파골세포 형성에 대한 이해에서 중요한 돌파구는 RANKL이 OC 형성, 분화 및 생존의 주요 조절자임을 확인한 것입니다40. RANKL 의존성 배양 시스템의 초기 프로토콜은 OC 생성 21,41,42를 위해 PBMC를 활용했습니다. 그러나 이러한 혼합 배양은 길고 OC 분화 및 기능에 대한 직접적인 효과를 테스트하는 능력을 제한하는 많은 교란 요인을 나타냅니다. 이 프로토콜은 7일 이내에 최적의 파골세포 형성을 얻을 수 있는 인간 말초 CD14+ 단핵구로부터의 파골세포 형성의 효율적이고 신뢰할 수 있는 시험관 내 모델을 설명하며(그림 1 및 그림 2), 이는 일부 다른 프로토콜과 비교할 때 상당히 빠릅니다43,44,45,46. 이 프로토콜의 주요 특징은 (1) 정제된 CD14+ 단핵구의 사용, (2) RANKL에 노출되기 전에 M-CSF로 단핵구의 프라이밍, (3) 배양 기간(<7일), (4) 억제제를 사용한 OC 형성 억제(TRAP 염색) 및 기능(재흡수, ATP 생산, 액틴 고리 재구성)의 신뢰할 수 있는 검출입니다. 
방법론을 최적화하는 동안 몇 가지 중요한 점이 확인되었습니다. OC의 시험관 내 분화는 CD14+ 단핵구의 파종 밀도에 크게 의존하는 것으로 관찰되었습니다. 따라서 이 프로토콜에서 세포는 고밀도(96웰 플레이트의 1 x 105 세포/웰, 배지 100μL)로 파종되며, 이는 세포가 서로 상호 작용할 수 있고 융합에 근접하여 성숙한 OC가 되는 것이 필수적이기 때문입니다. 유사하게, 너무 높은 밀도의 파종 세포는 배지 제한과 필요한 공간 부족으로 인해 분화 및 성장을 제한합니다. 또한, 이 프로토콜로 최대한의 성공을 거두려면 밀도 구배 분리를 신중하게 수행하고 CD14+ 세포의 농축된 집단이 가능한 한 순수한지 확인하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 부적절한 세척 단계는 혈소판 제거의 부족을 초래하며, 이는 결과적으로 OC 분화를 억제한다47,48. 유사하게, M-CSF 단독으로 자극된 분리된 CD14+ 제제에서 경미한 T 세포 오염의 존재는 잠재적으로 T 세포에 의한 RANKL 분비를 통해 OC 분화를 초래할 수 있다49. 따라서 모든 실험에 M-CSF 대조군을 포함하는 것이 중요합니다. 특히 새로운 분리 키트를 사용할 때 샘플의 순도를 보장하기 위해 일상적인 순도 검사도 권장됩니다.
최적의 OC 수(범위: ~200-1,600 OC/웰)는 뉴클레오사이드와 L-글루타민이 풍부한 α-MEM 배지를 사용하여 달성됩니다. Dulbecco's modified eagle medium(DMEM) 및 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지를 포함한 다른 기존 배양 배지는 OC 수율에 영향을 미칩니다. FBS의 근원은 또한 파골세포 형성에 영향을 미칠 수 있습니다. FBS의 다른 배치는 RANK-L 유래 파골세포 형성을 감소시킬 수 있을 뿐만 아니라 M-CSF 대조군에서 적은 수의 TRAP+ 다핵 세포의 출현을 유발할 수 있습니다(보충 그림 3). 따라서 일관된 결과를 얻으려면 사용하기 전에 새로운 FBS 배치를 테스트하고 실험 전반에 걸쳐 동일한 배치를 계속 사용하여 분화 과정의 변화를 최소화하는 것이 좋습니다. 또한, 종료 시점에서 얻은 차별화된 OC의 총 수 측면에서 기증자 대 기증자 가변성은 예를 들어 건강한 기증자와 환자를 비교하기 위해 이 프로토콜을 사용할 때 제한을 구성합니다. 이러한 경우 정확히 동일한 조건과 동일한 로트의 배지, FBS 및 기타 시약을 사용하는 것이 필수적입니다.
최적의 OC 분화 및 성숙을 위한 또 다른 필요한 단계는 RANKL 첨가 전에 M-CSF로 단핵구를 프라이밍하는 것입니다. RANKL 전에 M-CSF 18-24h에 세포를 노출시키면 단핵구가 RANK 발현15,26을 상향 조절하도록 프라이밍됩니다. 이 시점에서 RANKL을 추가하면 용량 의존적 방식으로 최적의 OC 분화가 보장됩니다. OC 분화의 정도는 기증자마다 다릅니다. 그러나 25ng/mL RANKL은 일반적으로 대부분의 기증자에서 많은 수의 OC를 구별하기에 충분합니다. 또한 25ng/mL RANKL은 테스트 화합물의 강화 및 억제 효과의 평가를 용이하게 하기 때문에 화합물의 초기 스크리닝을 위한 분석에 사용할 수 있습니다. 다른 배양 시스템은 RANKL 첨가 전에 더 긴 M-CSF 사전 배양 시간을 사용했지만, 이는 파골세포 형성을 위한 더 긴 배양 시간을 초래한다50. 또한, 프라이밍 된 단핵구를 밤새 배양하도록 두면 완전히 부착 된 상태는 아니지만 플레이트에 부착 할 수 있습니다. 따라서 RANKL을 처음 도입할 때 프라이밍된 단핵구의 박리 및 손실을 방지하기 위해 배지를 완전히 교체하기보다는 매우 조심스럽게 반쯤 교체해야 합니다. 또한 배지 고갈을 방지하고 세포 사멸을 방지하기 위해 배지를 3-4일마다 새로 고쳐야 합니다. 또한, 이 분석에 사용되는 부피가 적기 때문에(96웰 플레이트에서 100μL/웰), 분석 웰 주위에 수용액(즉, 멸균 증류된 H2O또는 PBS)으로 채워진 빈 웰 프레임을 갖는 것이 가장 중요합니다. 이렇게 하면 매체 증발 및 가장자리 효과를 방지할 수 있습니다.
마지막으로, 대사 분석(예: ATP 분석)의 경우, 세포가 복제 간의 큰 표준 편차를 피할 수 있어야 합니다(그림 5). 세포의 높은 생존율은 세포를 분류하고 분류된 OC의 추가 배양에도 중요합니다(그림 4). 그러나 이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 완전히 성숙한 OC는 접착력이 매우 뛰어나 플레이트에서 분리하기 어렵습니다. 더 큰 OC는 분리가 불가능한 경우가 많으며, 이로 인해 세포 수율이 낮아질 수 있습니다. 따라서 셀은 분류 후 필요한 농도로 도금하기 전에 계수해야 합니다. 또한, 본 프로토콜에서는 OC를 분리하는 비효소적 방법(accutase)을 사용하여 유세포 분석을 위한 다운스트림 표면 염색에서 막 변경을 방지합니다. 세포 스크레이퍼 (소프트 엔드 또는 하드 엔딩 모두)의 사용도 테스트되었으며 높은 세포 사멸을 초래했습니다. 0.05% 트립신/EDTA 용액을 사용한 효소 분리는 다운스트림 응용 분야에서 멤브레인 무결성이 필요하지 않을 때 분리된 OC의 더 높은 수율에 사용할 수 있습니다. 또한 OC가 함께 뭉치는 것을 방지하기 위해 세포 분리 후 모든 완충액에서 고농도의 EDTA를 사용하고 유세포 분석 전에 적절한 필터링을 수행하는 것이 좋습니다. OC 배양은 성숙한 OC, OC 전구체 및 대식세포로 구성된 이질적인 세포 집단이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 대식세포는 OC와 쉽게 구별할 수 있지만, 단핵 pre-OC와 다핵 OC는 모두 OSCAR를 발현하며 현재 방법으로는 구별할 수 없습니다(그림 4). 실제로 이 후자의 문제가 이 방법의 주요 한계를 구성합니다. 또한, OSCAR의 낮은 발현은 M-CSF 배양에도 존재하며(그림 4B) OC 계통 투입을 위해 준비된 대식세포를 나타낼 수 있습니다. 그림 4B와 같이 FMO 염색 신호를 기반으로 OSCAR+ 세포에 대한 게이트를 설정하는 것이 중요합니다.
요약하면, 이 프로토콜은 순환하는 1차 인간 단핵구로부터 활성 및 기능적으로 성숙한 OC의 효율적인 생산을 위한 최적화되고 강력한 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 강점은 짧은 시간 내에 OC를 생성하고 많은 수의 차별화된 OC를 생성할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 OC 분화 및 기능의 기본 메커니즘을 조사하는 길을 열어줍니다.

파골세포(OC)는 뼈를 재흡수하는 독특한 능력을 가진 조혈 계통의 다핵 거대 세포입니다. 그들은 골격 1,2의 개발과 지속적인 리모델링을 담당합니다. 발달의 골격 단계에서 OC와 조직에 상주하는 대식세포는 적혈구-골수 전구체에서 파생되며 뼈 틈새와 장기 조직을 식민지화합니다. 생리학적 조건에서 정상적인 뼈 발달과 치아 맹출을 위해서는 적혈구-골수 전구체가 필요하며, 순환하는 혈액 단핵구가 뼈 틈새로 유입되면 OC, 골량 및 골수강이 출생 후 유지된다3. 병리학 적 조건 하에서, 단핵구는 활동성 염증 부위로 모집되어 병리학 적 뼈 파괴에 기여할 수 있습니다 4,5.
여러 형태의 관절염 환자는 관절 염증을 경험하여 OC로 인한 점진적인 관절 파괴를 유발합니다6. 예를 들어, 류마티스 관절염(RA)에서 과활성화된 OC는 병적인 뼈 침식과 관절 파괴의 원인이 되며7,8, 현재의 치료법은 종종 뼈 손상을 개선하거나 중지시키지 않습니다9,10,11. 집단 분포와 전사체 및 후성유전학적 시그니처 측면에서 순환 단핵구의 변화가 RA 환자에서 보고되었습니다12,13,14. 더욱이, 염증 자극에 대한 변경된 단핵구 반응이 활동성 질환을 갖는 RA 환자에서 파골세포 형성에 영향을 미친다고 보고되었다15,16,17.
OC의 분화는 골수 전구체 세포가 OC 전구체로 분화하는 것을 포함하는 복잡한 다단계 과정입니다. 파골세포 형성 동안 OC는 세포-세포 융합, 불완전한 사이토키네시스, 핵분열 및 융합으로 설명되는 핵 재활용 과정을 통해 거대해지고 다핵화됩니다18,19,20. 시험관 내에서 OC를 구별하는 능력은 뼈 생물학에 대한 이해에 상당한 발전을 가져왔다21. OC는 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF) 및 핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성화제(RANKL)에 노출되면 전구체와 구별됩니다. 후자는 염증 상태 하에서도 시험관 내 및 생체 내에서 OC의 정상적인 발달 및 기능에 필수적입니다 6,22,23. RANKL은 조골세포 및 골세포뿐만 아니라 염증이 있는 RA 활막 2,24,25에서 활성화된 T 세포 및 섬유아세포에 의해 제시된다. OC 분화 과정에서 M-CSF에 노출된 단핵구는 세포막에서 핵 인자 카파-B(RANK) 발현의 수용체 활성화제를 상향 조절하고, RANKL에 의한 후속 자극 하에서 타르타르산염 내성 산 포스파타제(TRAP) 양성 단핵 pre-OC로 분화한 다음 다핵 OC15,26. OC는 여러 효소를 생성하며, 그 중 가장 중요한 것은 TRAP으로, 뼈27 내에서 인단백질을 분해할 수 있습니다. OC 분화의 조절자 및 마커는 OC 관련 수용체(OSCAR)입니다. OC 계통에 전념하는 전구체 세포 초기에 상향 조절됩니다28. 성숙한 거대 다핵 OC는 주름진 경계21,29,30을 둘러싸는 액틴 고리로 만들어진 큰 밀봉 영역을 생성함으로써 골격 매트릭스를 분해(재흡수)할 수 있습니다. OC의 골 흡수 능력은 세포 골격 재구성과 그에 따른 분극 및 소위 주름진 경계인 나선형 막의 형성을 필요로 합니다. 주름진 테두리는 액틴 링 또는 밀봉 영역인 F-액틴이 풍부한 구조의 큰 원형 밴드로 둘러싸여 있습니다. 액틴 고리 무결성은 OC가 시험관 내 및 생체 내에서 뼈를 재흡수하는 데 필수적이며, 결함이 있는 주름진 경계 형성은 하부 액포 아데노신 트리포스파타제(V-ATPase) 발현과 관련이 있습니다31,32,33. 또한, OC는 미토콘드리아가 풍부한 세포이며, 아데노신 삼인산(ATP)은 주름진 경계31,32,33에 국한된 OC에서 미토콘드리아 유사 구조와 결합합니다. 로테논은 미토콘드리아 복합체 I의 강력한 억제제로 작용하여 ATP 생산에 영향을 미칩니다. 로테논은 또한 OC 분화와 기능을 억제하는 것으로 나타났다34.
이 프로토콜은 인간 말초 혈액 샘플에서 시험관내 파골세포 형성의 효율적이고 최적화된 방법을 설명합니다. 인간 말초 혈액에서 CD14+ 단핵구는 OC15,35,36의 주요 공급원입니다. 이 프로토콜에서 노출 동역학과 M-CSF 및 RANKL의 농도는 최적의 파골세포 형성을 위해 조정되었습니다. 단핵 세포는 먼저 밀도 구배에 의해 전혈에 존재하는 적혈구 및 과립구로부터 분리됩니다. 그런 다음 자성 비드에 의한 양성 선택을 사용하여 CD14+ 단핵구에 대해 농축됩니다. 그런 다음 분리된 CD14+ 단핵구를 M-CSF와 함께 밤새 배양합니다. 이것은 단핵구가 RANK15,26의 발현을 상향 조절하도록 프라이밍합니다. RANKL의 후속 추가는 시간 의존적 방식으로 파골세포 형성 및 다핵 형성을 유도합니다. 활성 흡수 OC는 세포막30,32의 가장자리에서 F-액틴 고리의 특징적인 분포와 TRAP에 대한 염색을 보여줍니다. 성숙한 OC는 TRAP+ 다핵(3개 이상의 핵) 세포를 정량화하여 분석합니다. 성숙한 OC의 기능적 능력은 흡수, 액틴 고리 무결성 및 ATP 생성으로 평가할 수 있습니다. 또한, 차별화된 CD14- OSCAR+ OC를 농축하여 미네랄(또는 상아질) 흡수 및 F-액틴 조직을 통해 OC 기능에 대한 특정 화합물의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 연구에서, 알려진 OC 억제제인 로테논은 OC의 기능에 영향을 미치는 화합물의 예시로서 사용된다. 로테논 하에서 감소된 OC 흡수 활성은 감소된 ATP 생산 및 액틴 고리 단편화와 관련이 있습니다. 결론적으로, 이 프로토콜은 시험관 내에서 OC 분화 및 기능의 여러 생물학적 측면을 연구하기 위한 참조 방법으로 사용할 수 있는 강력한 분석을 설정합니다.
이 방법론은 (1) 건강 및 질병에서 OC로 분화할 수 있는 순환 단핵구의 가능성과 (2) OC 분화 및 기능에 대한 치료 후보의 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 강력한 파골세포 형성 프로토콜을 사용하면 전구체 세포로부터의 OC 분화와 성숙한 OC의 기능 모두에 대한 뼈 표적 치료의 효능과 메커니즘을 결정할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

파골세포(OC)는 골격 발달과 성인 뼈 리모델링에 중추적인 역할을 하는 뼈 흡수 세포입니다. 여러 뼈 질환은 OC의 분화 및 활성화 증가로 인해 발생하므로 이 병리학의 억제가 핵심 치료 원리입니다. 골수 전구체에서 OC의 분화를 유도하는 두 가지 핵심 요인은 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF)와 핵 인자 카파-B 리간드의 수용체 활성화제(RANKL)입니다. 인간 순환 CD14+ 단핵구는 시험관 내에서 OC로 분화하는 것으로 오랫동안 알려져 왔습니다. 그러나 노출 시간과 RANKL의 농도는 분화 효율에 영향을 미칩니다. 실제로, 시험관 내에서 인간 OC를 생성하기 위한 프로토콜이 설명되었지만 종종 열악하고 긴 분화 과정을 초래합니다. 여기서, 기능적으로 활성인 성숙한 인간 OC를 적시에 생성하기 위한 견고하고 표준화된 프로토콜이 제공된다. CD14+ 단핵구는 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 농축되고 M-CSF로 프라이밍되어 RANK를 상향 조절합니다. RANKL에 대한 후속 노출은 용량 및 시간 의존적 방식으로 OC를 생성합니다. OC는 타르타르산염 내산성 포스파타제(TRAP) 및 광학 현미경 분석으로 염색하여 식별 및 정량화합니다. 핵 및 F-액틴의 면역형광 염색은 기능적으로 활성인 OC를 식별하는 데 사용됩니다. 또한 OSCAR+CD14- 성숙 OC는 유세포 분석 세포 분류 및 광물(또는 상아질/뼈) 흡수 분석 및 액틴 고리 형성으로 정량화된 OC 기능을 통해 더욱 풍부해집니다. 마지막으로, 알려진 OC 억제제인 로테논이 성숙한 OC에 사용되어 아데노신 삼인산(ATP) 생성이 액틴 고리 무결성 및 OC 기능에 필수적임을 보여줍니다. 결론적으로, 많은 수의 OC를 감별하기 위한 강력한 분석법이 이 연구에서 확립되었으며, 이는 액틴 고리 염색 및 ATP 분석과 함께 OC 기능을 평가하고 분화 과정을 조절할 수 있는 새로운 치료 화합물을 스크리닝하는 데 유용한 시험관 내 모델을 제공합니다.

CD14+ 단핵구에서 OC 생성 이 방법은 일반적으로 1주일 내에 시험관 내에서 많은 수의 OC를 인간 말초 혈액 CD14+ 단핵구와 쉽게 구별하는 것을 목표로 했습니다. 첫째, CD14+ 단핵구는 PBMC에서 농축되었고 이전에 보고된 바와 같이 RANK를 상향 조절하기 위해 밤새 M-CSF로 프라이밍되었습니다15. 단핵구 프라이밍 후, OC 분화 및 성숙을 위한 RANKL의 최적 농도를 결정하기 위해 1ng/mL, 25ng/mL, 50ng/mL 및 100ng/mL의 RANKL 농도와 25ng/mL M-CSF를 사용했습니다. RANKL의 추가는 용량 의존적 방식으로 증가하는 수의 큰 TRAP 양성 다핵 OC를 생성했으며 이는 TRAP 염색을 사용하여 평가되었습니다. 성숙한 OC는 여러 핵(일반적으로 3개 이상; 그림 2A, B 및 보충 그림 1). 또한, 단핵구로부터의 OC 분화의 동역학은 2-14일 배양 기간 동안 TRAP 염색 및 광학 현미경을 사용하여 조사되었습니다. 이 경우, 50ng/mL RANKL의 중간 농도를 사용한 OC 분화는 배양에서 OC가 얼마나 빨리 분화되는지 평가하기 위해 선택되었습니다. 이러한 배양 조건에서 다핵 OC는 5일째부터 볼 수 있었고 7일째에 최적의 분화에 도달했습니다(그림 2C). 플라스틱에 대한 배양을 10일 이상 장기간 배양하면 비정상적으로 거대한 융합 세포가 생성되었습니다. 이 프로토콜에서 6-8일은 일반적으로 OC 생성의 최적 종점으로 사용됩니다. OC는 정량화하거나 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.
차별화된 OC의 기능적 평가 생성된 OC의 기능적 활성을 결정하기 위해 광물화된 표면에서 OC를 구별하여 흡수 활성을 조사했습니다. 큰 OC는 7일의 배양 기간 후에만 생성되므로, 미네랄 기질을 재흡수하기에 충분한 시간을 허용하기 위해, 배양은 10일까지 유지되었다. 둥근 구멍 또는 흡수 구덩이의 형성은 M-CSF와 RANKL로 처리된 세포를 포함하는 웰의 광물화된 표면에서만 관찰되었습니다(그림 3). 따라서, 용해된 광물화된 표면(흡수 구덩이)의 백분율은 OC 흡수 능력을 결정할 수 있게 한다. 또한, 플라스틱 및 유리 챔버 슬라이드 모두에서 7일까지 이 프로토콜에 따라 분화된 OC는 면역형광 염색으로 시각화할 수 있는 잘 조직화된 액틴 고리 구조를 나타냈습니다(보충 그림 2).
성숙한 OC 기능에 대한 억제제의 효과 위에서 언급한 배양 조건은 공지된 OC 억제제인 로테논34의 존재 하에서 시험관 내에서 생성된 OC의 기능적 능력을 결정하기 위해 활용되었습니다. OC는 6-8일 동안 분화되었고 CD14-OSCAR+ OC 및 OC 전구체는 유세포 분석을 통해 농축되었습니다(그림 4). 그런 다음 농축된 세포를 3일 동안 pro-파골세포 형성 배지(25ng/mL, M-CSF 및 RANKL)에서 미네랄 코팅된 96웰 플레이트에 웰당 50,000개의 세포로 도말했습니다. 로테논(그림 5A,B)으로 처리하면 치료되지 않은 대조군과 비교하여 용량 의존적으로 광물화된 표면의 재흡수가 억제되었으며, 이는 이전 연구와 일치합니다34. 또한 OC 기능은 ATP 생산 및 액틴 고리 형성을 통해 평가되었습니다. OC 흡수의 로테논 의존성 억제는 ATP 생산의 억제와 관련이 있었습니다(그림 5C). 재흡수 OC는 세포골격 조직을 촉진하여 흡수 능력을 조절하는 고도로 분극된 세포입니다. Alexa fluor 647 conjugated phalloidin은 로테논의 존재 또는 부재 하에 배양된 성숙 OC의 F-액틴 세포골격을 표지하는 데 사용되었습니다. 로테논은 성숙한 OC의 RANKL 유래 액틴 고리의 단편화를 일으켰습니다(그림 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> 그림 2: CD14+ 단핵구 전구체와 효율적으로 구별되는 OC. CD14+ 단핵구는 자기적으로 농축되었고, 96웰 플레이트에서 1 x 105 세포/웰로 플레이팅되었고, 25 ng/mL M-CSF 와 함께 밤새 배양되었다. (A) M-CSF 프라이밍 단핵구를 RANKL(1ng/mL, 25ng/mL, 50ng/mL 및 100ng/mL)의 농도 증가로 자극하고 고정하고 7일째에 TRAP에 대해 염색했습니다. 이미지를 획득하고 TRAP+ 다핵 세포(MNC)를 계수했습니다. TRAP 염색의 대표적인 이미지는 보충 그림 1에 나와 있습니다. 오차 막대는 평균 ± SD(n = 3)를 나타냅니다. 데이터는 쌍을 이루는 데이터에 대한 일원 분산 분석과 Holm-Sidak의 다중 비교 테스트로 분석되었습니다. * P ≤ 0.05 및 ** P ≤ 0.005. (B) 7일째 M-CSF 유래 대식세포와 비교하여 예상되는 OC/웰의 일반적인 양과 25ng/mL RANK-L 미만의 형태를 보여주는 96웰 플레이트의 TRAP 염색 웰의 대표 이미지. 스케일 바: 1000μm. (C) 2일부터 14일까지 TRAP 염색을 통해 평가한 50ng/mL RANKL 하에서 OC 형성의 대표 이미지. OC는 5일차부터 볼 수 있습니다. 거대하고 비정상적으로 융합된 OC는 10일 후에 존재합니다. 스케일 바: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> 그림 3: CD14+ 단핵구와 분화된 재흡수성 OC. PBMC에서 분리된 CD14+ 세포는 광물 분석(osteo-assay) 플레이트에서 25ng/mL M-CSF(M) 및 RANKL(R)의 존재 하에 10일 동안 OC로 분화되었습니다. (A) 10일째 재흡수를 분석하기 위해 10배 배율로 촬영한 대표적인 재건된 우물의 이미지(회색의 광물 기질, 흰색의 재흡수 구덩이). 스케일 바: 1000 μm. (B) 재흡수된 면적의 백분율의 정량화. 재흡수 데이터는 Wilcoxon 쌍 분석으로 분석되었습니다. 오차 막대는 평균 ± SD(n = 7)를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> 그림 4: CD14−OSCAR+ OC의 유세포 분석 농축. CD14+ 단핵구는 PBMC로부터 농축되었고, OC는 이전에 기술된 바와 같이 분화되었다. 부착성 OC 배양물을 아큐타제로 분리하고 유세포 분석을 위해 염색했습니다. (ᄀ씨) 8일째의 OC는 CD14 및 OSCAR 발현에 기초하여 분류되었다. (A) 대표적인 분류 게이팅 전략. 세포를 단일항으로 게이팅하고, 죽은 염색에 대해 음성으로 게이트하고, CD14+ OSCAR+(빨간색) 및 CD14- OSCAR+(파란색) 하위 집합을 분류했습니다. (B) RANKL 유래 OC(청록색)와 대조군 M-CSF 유래 대식세포(주황색)의 중첩 OSCAR 염색을 보여주는 대표적인 플롯. 빨간색은 RANKL 유래 OC의 OSCAR 동형 염색 대조군입니다. (C) 분류된 모집단을 플라스틱에 도말하고 pro-OC 배지(25ng/mL M-CSF 및 50ng/mL RANKL)에서 2시간 동안 부착한 다음 TRAP 염색 및 시각화를 수행했습니다. 대표 이미지는 CD14+ 하위 집합(빨간색)의 TRAP+ 세포 부족과 CD14- 하위 집합(파란색)의 단일 및 다핵 TRAP+ pre-OC 및 OC를 보여줍니다. 스케일 바: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> 그림 5: 성숙한 OC의 기능을 평가하기 위한 분석. 성숙 OC의 기능을 평가하기 위해 PBMC에서 분리된 CD14+ 세포를 M-CSF(M) 단독으로 또는 RANKL(R)과 함께 7일 동안 배양하고, OC를 유세포 분석을 통해 농축한 다음 OC를 억제제 로테논으로 24시간 동안 처리했습니다. (A) 성숙한 OC는 유세포 분석을 통해 분류되었습니다(CD14−OSCAR+) 및 로테논의 존재 또는 부재 하에 광물 분석 표면 상에서 3일 동안 배양한 후, 세포를 표백하고 10x에서 이미지화하여 재흡수된 영역(백색의 흡수 구덩이)을 드러냈다. (A) 우물의 대표적인 재구성 이미지. 스케일 바: 1000 μm. (B) 재흡수된 면적의 백분율의 정량화. (B)의 데이터는 Dunn의 다중 비교 검정(n = 7)을 사용하여 일원 분산 분석으로 분석되었습니다. * P ≤ 0.05 및 ** P ≤ 0.01. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타낸다. (C) RANKL로 분화되고 비히클 또는 로테논(10nM 및 30nM)으로 처리된 미분화 및 7일째 분화된 성숙 OC의 총 세포내 ATP 함량. 여기서, 2DG 및 올리고마이신을 분석에 대한 양성 대조군으로 사용하였고, 세포 용해 및 ATP 정량화 30분 전에 첨가하였다. 오차 막대는 평균 ± SD(n = 4)를 나타냅니다. 데이터는 쌍체 데이터에 대한 일원 분산 분석과 Dunnett의 다중 비교 테스트로 분석되었습니다. ** P ≤ 0.01입니다. (D) 액틴 고리 형성(빨간색) 및 핵(파란색)에 대해 염색된 성숙 OC의 대표적인 20x 이미지로, 억제제로 액틴 고리의 손실을 보여줍니다. 스케일 바: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>플레이트 형식</td>
			<td>96 웰 플레이트</td>
			<td>48 웰 플레이트</td>
			<td>24 웰 플레이트</td>
			<td>12 웰 플레이트</td>
			<td>6 웰 플레이트</td>
		</tr><tr><td>음량</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225–250 μL</td>
			<td>450–500 μL</td>
			<td>0.8–1 mL</td>
			<td>1.8–2 mL</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 다양한 플레이트 형식에 대한 세포 현탁액의 부피. 부피는 1 x 106 cells/mL 용액에서 시작하여 계산되며 세포 간 융합을 위한 최적의 밀도를 제공합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>형광단, 클론</td>
			<td>106 세포 당 부피 (μL)</td>
		</tr><tr><td>CD14 (CD14)</td>
			<td>PE/시아닌7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>오스카</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>셀 정렬 버퍼</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 항체 마스터 믹스 용액. 
보충 그림 1: RANKL 용량 반응의 TRAP 염색. CD14+ 단핵구는 자기적으로 농축되었고, 96웰 플레이트에서 1 x 105 세포/웰로 플레이팅되었고, 그림 2와 같이 25 ng/mL M-CSF 와 함께 밤새 배양되었습니다. TRAP 염색의 대표 이미지는 7일째에 RANKL(1ng/mL, 25ng/mL, 50ng/mL 및 100ng/mL)의 농도가 증가함에 따라 자극된 MCSF 프라이밍 단핵구를 보여주고, 고정하고, TRAP에 대해 염색했습니다. 스케일 바: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 완전히 분화된 OC에서 연기 고리 염색. (A) TC 플라스틱에서 분화되고 AF647 팔로이딘(빨간색)으로 염색된 OC의 10배 배율. 스케일 바: 400μm. (B) 유리 챔버 슬라이드에서 분화되고 AF488 팔로이딘(노란색)으로 염색된 OC의 40배 배율. 스케일 바: 100 μm.핵은 DAPI로 염색되며, (A)에는 파란색으로, (B)에는 청록색으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3: OC 분화 효율에 대한 다양한 FBS 배치의 영향. OC는 7일 동안 25ng/mL M-CSF 및 50ng/mL RANKL(MR)의 존재 하에 CD14+ 단핵구와 분화되었습니다. 대조군 웰은 M-CSF (M) 만 가졌다. (A) 대표적인 10x 배율(스케일 바: 400μm) 및 (B) FBS의 두 가지 다른 배치에서 한 기증자와 구별된 TRAP 염색 OC의 정량화. 오차 막대는 세 번의 기술 반복실험의 평균 ± SD를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

파골세포는 신체의 주요 뼈 흡수 세포입니다. 이 프로토콜은 인간 말초 혈액 단핵구로부터 파골세포의 시험관내 분화를 위한 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다. 이 방법은 항상성 및 질병에서 파골세포 생물학을 더 깊이 이해하는 데 중요한 도구로 사용될 수 있습니다.

기능성 파골세포와 인간 말초 혈액 CD14+ 단핵구의 분화

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0. 우리의 프로토콜은 분화 과정과 기능의 기초가 되는 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있는 시험관 내에서 파골세포를 생성하는 최적화되고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 단 일주일 만에 많은 수의 기능적으로 활동적인 파골 세포를 생성 할 수 있다는 것입니다. 높은 분화 수율은 정제된 단핵구를 사용하고 제때에 사이토카인을 첨가함으로써 달성됩니다.파골세포는 모든 형태의 관절염에서 뼈 파괴를 담당하며, 이 방법은 분화 및/또는 기능을 조절할 수 있는 새로운 치료 화합물을 스크리닝하는 도구를 제공합니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 박사 과정 학생 인 Patricia Riedlova가 될 것입니다. 시작하려면 혈액을 새로운 50 밀리리터 튜브로 옮겨 PBMC를 분리하십시오.신선한 혈액의 경우 동일한 부피의 멸균 PBS로 희석하거나 백혈구 원뿔과 버피 코트의 경우 1:3 비율로 희석합니다. 반전으로 혈액을 부드럽게 섞는다. 3 밀리리터의 밀도 구배 배지가 들어있는 15 밀리리터 튜브를 준비하고 밀도 구배 배지 위에 8-10 밀리리터의 희석 된 혈액을 천천히 겹쳐서 혼합을 피하십시오.브레이크 없이 실온에서 30분 동안 튜브를 400 x g로 원심분리합니다. 그런 다음 파스퇴르 피펫으로 상단 층을 조심스럽게 버립니다. PBMC를 포함하는 아래의 간기 층을 수집하고 이 층을 새로운 50밀리리터 튜브로 옮깁니다.세포를 멸균 PBS로 최대 50-밀리리터까지 현탁시키고, 완전 브레이크를 이용하여 실온에서 10분 동안 300 x g에서 원심분리함으로써 잔류 밀도 구배 배지를 세척하였다. 잔류 혈소판을 제거하려면 원고에 설명된 대로 원심분리 과정을 반복하고 분리 및 정제된 PBMC를 20밀리리터의 PBS에 재현탁하고 표준 방법에 따라 혈구계를 사용하여 계수합니다. CD14+단핵구를 풍부하게 하려면 1 x 10을 7번째 PBMC에 적절한 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮기고 세포를 300 x g에서 5분 동안 펠릿화합니다.상층액을 버리고 세포 펠릿을 세포 분리 완충액에 재현탁한 후, 뚜껑을 덮은 상태에서 100마이크로리터당 10마이크로리터의 항체 칵테일로 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 100 마이크로 리터 당 10 마이크로 리터의 자성 나노 입자 비드를 추가하고 뚜껑을 덮은 상태에서 3 분 동안 배양합니다. 세포 분리 완충액으로 부피를 2.5 밀리리터까지 보충하십시오.튜브를 자석에 넣고 뚜껑을 연 상태에서 3분 동안 배양합니다. 이제 튜브가 여전히 자석에 있는 동안 반전에 의한 한 번의 연속 이동으로 음의 세포 집단을 버립니다. 자석에서 튜브를 제거하고 자성 비드에 부착된 농축 CD14+단핵구를 세포 현탁액 완충액 2.5밀리리터에 재현탁하여 세척하고 튜브를 다시 자석에 넣습니다.앞에서 설명한 대로 분리된 세포의 수를 계산합니다. 수집된 세포를 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버린 후, 10% FBS를 갖는 완전한 알파 최소 필수 배지에서 밀리리터당 100만 개의 세포로 세포를 재현탁한다.파골 세포를 분화시키기 위해 M-CSF를 밀리리터 당 25 나노 그램의 최종 농도로 세포 현탁액에 첨가하고 피펫 팅으로 완전히 혼합하여 세포 현탁액을 균질화합니다. 플레이트를 100 마이크로리터의 현탁액을 플랫 바닥 96-웰 플레이트에 웰 당 편평하게 한다. 다음으로, 배양 시스템에서 배지 증발 및 가장자리 효과를 방지하기 위해 도양된 세포 주위에 웰당 200마이크로리터의 멸균 증류수를 추가합니다.5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 약 18-20시간 동안 세포를 하룻밤 동안 배양합니다. M-CSF 및 RANK 리간드로 보충된 신선한 배지를 준비합니다. 배양 후 P200 피펫을 사용하여 흡인하여 배지의 절반을 조심스럽게 제거하고 M-CSF 및 RANK 리간드가 보충된 신선하고 따뜻하고 완전한 배지로 교체하고 최종 농도는 밀리리터당 25나노그램입니다.세포를 7-14 일 동안 파골 세포로 분화시키고 3 일마다 배지를 완전히 교체하십시오. 배지를 제거한 후, 분화된 부착성 파골세포를 준비된 고정액의 웰당 100마이크로리터로 고정하고, 1분 동안 배양한다. 부착 세포가 긁히지 않도록 웰 바닥을 만지지 마십시오.웰을 300 마이크로 리터의 멸균 증류수로 3 회 세척 한 후 플레이트를 두드려 건조시키고 새로 준비된 염색 용액 100 마이크로 리터를 각 웰에 첨가합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 어둠 속에서 20분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 염색 용액을 반전으로 제거하고, 플레이트를 웰당 300-마이크로리터의 증류수로 3회 세척한다.종이 타월에 접시를 두드려 여분의 물을 제거하고 접시를 열어 두고 밤새 가벼운 건조로부터 보호합니다. 타일 옵션이 있는 명시야 현미경을 사용하여 10x 또는 20x로 이미지를 촬영하여 전체 웰 표면을 캡처합니다. 세포 계수기 플러그인이 있는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 3개 이상의 핵을 가진 TRAP+보라색 염색 세포로 식별된 파골세포를 수동으로 계산합니다.1 x 10의 세포 밀도에서 웰당 5번째 세포까지 18웰 챔버 슬라이드에서 분리된 CD14+단핵구의 100마이크로리터를 웰당 플레이트합니다. 앞서 입증된 바와 같이 M-CSF 및 RANK 리간드가 있는 상태에서 3일마다 배지를 완전히 교체하여 파골세포를 분화합니다. 종료 시점에서, 배지를 부드럽게 제거하고, pH 7.4에서 예열된 PBS의 200 마이크로리터로 각 웰을 2회 세척한다.계단 사이에 우물을 말리지 마십시오. PBS에 4% 포름알데히드 용액의 웰당 100마이크로리터로 샘플을 고정하고 부드럽게 흔들면서 궤도 셰이커에서 실온에서 10분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS의 웰당 200-마이크로리터로 2회 세척한다.PBS에 희석된 0.1%Triton x-100 용액의 웰당 100마이크로리터로 세포를 투과화하고 앞서 표시된 대로 10분 동안 배양합니다. PBS의 웰당 200 마이크로 리터로 두 번 세척하십시오. 비특이적 결합을 차단하고 신호를 증가시키려면 2% 소 혈청 알부민과 PBS 용액으로 만든 차단 용액 100마이크로리터를 추가합니다.부드럽게 흔들면서 궤도 셰이커에서 실온에서 20분 동안 배양합니다. 차단 용액을 제거한 후 2% BSA/PBS 용액에 희석한 형광 공액 팔로이딘 용액 100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. PBS의 웰당 200 마이크로 리터로 두 번 세척하십시오.300 나노몰 DAPI를 함유하는 PBS의 용액의 웰당 100마이크로리터로 핵을 염색한다. 10 내지 15분 후에, DAPI 용액을 제거하고, 이를 웰당 100-마이크로리터-PBS로 교체한다. 적절한 면역형광 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 4-40x에서 염색을 시각화합니다.성숙한 파골세포는 TRAP+다중 핵 세포로 정의됩니다. RANK 리간드의 추가는 용량 의존적 방식으로 증가하는 수의 큰 TRAP+다핵 파골세포를 생성했습니다. 단핵구로부터 파골세포 분화의 동역학을 2일 내지 14일의 배양 기간에 걸쳐 조사하였다.다핵 파골세포는 5일째부터 관찰되었으며 7일째에 최적의 분화에 도달했습니다. 광물화 된 표면으로의 파골 세포의 분화는 둥근 구멍 또는 흡수 구덩이의 형성을 분석하여 흡수 활성을 평가할 수 있습니다. 흡수율은 M-CSF 단독과 비교할 때 M-CSF 및 RANK 리간드가 있는 경우 유의하게 증가합니다.또한, 로테논을 사용한 처리는 용량 의존적으로 처리되지 않은 대조군과 비교하여 미네랄화된 표면의 재흡수를 잘 억제하였다. 파골세포 흡수의 로테논 의존성 억제는 ATP 생산의 억제와 관련이 있었다. 성숙한 OCS의 RANK 리간드 유래 액틴 고리의 단편화가 로테논의 존재 하에서 관찰되었다.농축 된 단핵구가 혈소판을 포함하지 않는지, 세포가 올바른 밀도로 도금되는지, 가장자리 효과를 피하기 위해 주변 우물이 물로 채워져 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 파골세포가 어떻게 형성되는지, 그리고 기초 과학과 번역 과학 모두에서 파골세포의 기능에 영향을 미치는 요인을 기계적으로 조사하는 데 특히 유용합니다. 예를 들어, 이러한 과정을 조절할 수 있는 화합물이나 단백질을 사용합니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

연구

면역학 및 감염병학

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Zoledronate를 사용하는 사람 말초혈의 확장 γδ T 세포

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Monocytes과 인간 혈액의 작은 샘플에서 돌기 세포의 리니지 특정 수신자 같은 수용체 - 매개 시그널링의 정량 이미징

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

요오드 산 쉬프 염색 말초 혈액 단핵 세포에서 글리코겐을 감지

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

말초 혈액에서 인간 Alloantigen 특정 T 세포의 생성

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

분리는 차별화 및 정량화 인간의 혈액에서 B 세포를 항체가 분비 : ELISPOT을 체액 면역의 기능 판독으로

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran Murine 및 인간의 기본 NK 세포의 Lentiviral 변환 효율 향상

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte 차별화와 인간에서 혈소판 형성 코드 혈액 파생 CD34+ 세포

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

말 초 혈액 및 림프 조직에서 기본 인간 T 세포의 시 냅 스 인터페이스의 평가

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

1차 인간 단핵구의 고립, 형질전환 및 문화

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...