Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner takknemlig Flow Core Facility og Glasgow Imaging Facility (GIF) innen School of Infection and Immunity for deres støtte og assistanse i dette arbeidet.

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.

Den enkle dyrkingen og isoleringen av et stort antall funksjonelle p-piller in vitro er viktig for å fremme forståelsen av beinbiologi og OC-medierte sykdommer. Klassisk ble p-piller generert i kokulturer med osteoblaster eller stromale celler og hematopoietiske celler fra milten eller benmargen38,39. Et signifikant gjennombrudd i forståelsen av osteoklastogenese var identifiseringen av RANKL som den viktigste regulatoren for OC-dannelse, differensiering og overlevelse40. Tidlige protokoller av RANKL-avhengige kultursystemer benyttet PBMC for OC generasjon21,41,42. Imidlertid er disse blandede kulturene lange og presenterer mange forstyrrende faktorer som begrenser evnen til å teste de direkte effektene på OC differensiering og funksjon. Denne protokollen beskriver en effektiv og pålitelig in vitro-modell for osteoklastogenese fra humane perifere CD14+-monocytter der optimal osteoklastogenese kan oppnås innen 7 dager (figur 1 og figur 2), noe som er betydelig raskere sammenlignet med noen andre protokoller43,44,45,46. De viktigste kjennetegnene ved denne protokollen er (1) bruk av rensede CD14+-monocytter, (2) priming av monocyttene med M-CSF før eksponering for RANKL, (3) lengden på kulturen (<7 dager) og (4) pålitelig påvisning av hemming av OC-dannelse (TRAP-farging) og funksjon (resorpsjon, ATP-produksjon, aktinringreorganisering) med inhibitorer. 
Under optimaliseringen av metodikken ble flere kritiske punkter identifisert. Det har blitt observert at in vitro-differensieringen av p-piller i stor grad er avhengig av såtettheten til CD14+-monocyttene. I denne protokollen blir cellene sådd med høy tetthet (1 x 105 celler / brønn av en 96-brønnsplate, i 100 μL medium), da det er viktig for cellene å kunne samhandle med hverandre og være i nærheten av å smelte sammen og bli modne OC. På samme måte begrenser såceller med en tetthet som er for høy deres differensiering og vekst på grunn av middels begrensninger og mangel på nødvendig plass. Videre, for å oppnå maksimal suksess med denne protokollen, er det viktig å utføre tetthetsgradientseparasjonen nøye og for å sikre at den berikede populasjonen av CD14 + -celler er så ren som mulig. For eksempel resulterer utilstrekkelige vasketrinn i mangel på fjerning av blodplater, noe som følgelig hemmer OC-differensiering47,48. På samme måte kan tilstedeværelsen av mindre T-cellekontaminering i isolerte CD14+-preparater stimulert med M-CSF alene resultere i OC-differensiering, potensielt via RANKL-sekresjon av T-celler49. Derfor er det viktig å inkludere en M-CSF-kontroll for hvert eksperiment. En rutinemessig renhetskontroll, spesielt ved bruk av et nytt isolasjonssett, anbefales også for å sikre prøvens renhet.
Optimale OC-tall (område: ~ 200-1,600 OC / brønn) oppnås ved bruk av α-MEM-medium beriket med nukleosider og L-glutamin. Andre konvensjonelle kulturmedier, inkludert Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) og Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium, påvirker OC-utbyttet. Kilden til FBS kan også påvirke osteoklastogenese. Ulike partier av FBS kan føre til redusert RANK-L-derivert osteoklastogenese, samt utseendet på lavt antall TRAP + multinukleerte celler i M-CSF-kontrollene (tilleggsfigur 3). Derfor, for å oppnå konsistente resultater, anbefales det å teste nye FBS-batcher før bruk og fortsette med samme batch gjennom forsøkene for å minimere variasjoner i differensieringsprosessen. I tillegg utgjør variasjon fra donor til donor, i form av totalt antall differensierte p-piller oppnådd ved slutttidspunktet, en begrensning når man bruker denne protokollen til å sammenligne for eksempel friske donorer med pasienter. I disse tilfellene er det viktig å bruke nøyaktig de samme forholdene og samme masse medium, FBS og andre reagenser.
Et annet nødvendig skritt for optimal OC-differensiering og modning er priming av monocyttene med M-CSF før RANKL-tillegget. Eksponeringen av cellene til M-CSF 18-24 timer før RANKL primer monocyttene for å oppregulere RANK-uttrykk15,26. Tillegg av RANKL på dette tidspunktet sikrer optimal OC-differensiering på en doseavhengig måte. Graden av OC-differensiering varierer fra donor til donor; Imidlertid er 25 ng / ml RANKL vanligvis tilstrekkelig til å skille et høyt antall OCs i de fleste givere. I tillegg kan 25 ng / ml RANKL brukes i analyser for den første screeningen av forbindelser, da det letter evalueringen av både de forbedrende og hemmende effektene av testforbindelsene. Andre dyrkningssystemer har brukt lengre M-CSF preinkubasjonstid før RANKL-tillegg, men dette resulterer i lengre dyrkingstid for osteoklastogenese50. I tillegg forlater de primede monocyttene å inkubere over natten, slik at de kan feste seg til platen, om enn ikke i en fullt adherent tilstand. Derfor, når RANKL introduseres for første gang, må mediet halvskiftes veldig forsiktig i stedet for helt endret for å forhindre løsrivelse og tap av de primede monocyttene. Mediet må også oppdateres hver 3-4 dager for å unngå middels uttømming og forhindre celledød. Videre, på grunn av det lave volumet som brukes i denne analysen (100 μL / brønn i en 96-brønnplate), er det av største betydning å ha en ramme av tomme brønner som er fylt med en vandig løsning (dvs. steril destillert H2O eller PBS) rundt analysebrønnene. Dette forhindrer middels fordampning og kanteffekter.
Til slutt, for metabolske analyser (f.eks. ATP-analyser), er det viktig at cellene er levedyktige for å unngå stort standardavvik mellom replikater (figur 5). Høy levedyktighet av cellene er også viktig for sortering av cellene og for videre dyrking av de sorterte p-pillene (figur 4). Denne metoden har imidlertid flere begrensninger. Fullt modne OC-er er svært vedheftende og vanskelige å løsne fra platene. De større OC-ene er ofte umulige å løsne, noe som kan føre til et lavere celleutbytte. Derfor må cellene telles etter sortering og før plating ved ønsket konsentrasjon. Videre brukes i denne protokollen en ikke-enzymatisk metode (accutase) for å løsne p-pillene for å forhindre membranendringer i nedstrøms overflatefarging for flowcytometri. Bruken av celleskrapere (både med myke eller harde endinger) ble også testet og førte til høy celledød. Enzymatisk løsrivelse ved bruk av 0,05 % Trypsin/EDTA-løsninger kan brukes for et høyere utbytte av frittliggende OC-er når membranintegritet ikke er nødvendig for nedstrømsapplikasjoner. I tillegg, for å forhindre at p-pillene klumper seg sammen, anbefales det sterkt å bruke en høy konsentrasjon av EDTA i alle bufferne etter celleløsrivelse, samt passende filtrering før flowcytometrioppkjøp. Det er viktig å merke seg at OC-kulturer er en heterogen populasjon av celler som består av modne OC, OC-forløpere og makrofager. Makrofager kan lett skilles fra OCer, selv om både mononukleære pre-OCs og multinukleære OCs uttrykker OSCAR og ikke kan skilles med dagens metode (figur 4). Faktisk utgjør dette siste problemet hovedbegrensningen for denne metoden. I tillegg er et lavt uttrykk for OSCAR også til stede i M-CSF-kulturer (figur 4B) og kan indikere makrofager som er primet for OC-avstamningsforpliktelse. Det er viktig å stille inn porten for OSCAR+ -celler basert på FMO-fargesignalet, som vist i figur 4B.
Oppsummert beskriver denne protokollen en optimalisert og robust metode for effektiv produksjon av aktive og funksjonelt modne p-piller fra sirkulerende primære humane monocytter. Styrken til denne protokollen er dens evne til å generere OC-er på kort tid og gi et høyt antall differensierte OC-er. Denne metoden åpner for å undersøke de grunnleggende mekanismene som ligger til grunn for OC-differensiering og funksjon.

Osteoklaster (OC) er multinukleerte gigantiske celler av hematopoietisk avstamning med en unik evne til å resorbere bein. De er ansvarlige for utvikling og kontinuerlig ombygging av skjelettet 1,2. I skjelettfasene av utvikling er OCs og vevsbosatte makrofager avledet fra erytro-myeloide progenitorer og koloniserer beinnisjen og organvevet. Under fysiologiske forhold kreves erytro-myeloide progenitorer for normal beinutvikling og tannutbrudd, mens tilstrømningen av sirkulerende blodmonocytter inn i beinnisjen gir postnatalt vedlikehold av OCs, benmasse og benmarghule3. Under patologiske forhold rekrutteres monocytter til steder med aktiv betennelse og kan bidra til patologisk bein ødeleggelse 4,5.
Pasienter med flere former for leddgikt opplever leddbetennelse, noe som fører til progressiv felles ødeleggelse forårsaket av OCs6. For eksempel, i revmatoid artritt (RA), er overaktiverte OCs ansvarlige for patologisk beinerosjon og felles ødeleggelse 7,8, og nåværende behandlinger forbedrer eller stopper ofte ikke beinskader9,10,11. Endringer i sirkulerende monocytter både med hensyn til populasjonsfordeling og transkriptomiske og epigenetiske signaturer er rapportert hos RA-pasienter12,13,14. Videre er det rapportert at endret monocytrespons på inflammatorisk stimulering påvirker osteoklastogenese hos RA-pasienter med aktiv sykdom15,16,17.
Differensieringen av p-piller er en kompleks flertrinnsprosess som omfatter myeloide forløpercellers forpliktelse til differensiering i OC-forløpere. Under osteoklastogenese blir p-piller gigantiske og multinukleerte gjennom cellefusjon, ufullstendig cytokinese og en kjernefysisk resirkuleringsprosess beskrevet som fisjon og fusjon18,19,20. Evnen til å differensiere p-piller in vitro har muliggjort betydelige fremskritt i forståelsen av beinbiologi21. OC-er skiller seg fra forløpere ved eksponering for makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og reseptoraktivator av nukleær faktor kappa-B-ligand (RANKL). Sistnevnte er avgjørende for normal utvikling og funksjon av p-piller in vitro og in vivo, selv under inflammatoriske tilstander 6,22,23. RANKL presenteres av osteoblaster og osteocytter, samt av aktiverte T-celler og fibroblaster i betent RA-synovium 2,24,25. Under OC-differensieringsprosessen oppregulerer monocytter eksponert for M-CSF reseptoraktivatoren av nukleær faktor kappa-B (RANK) uttrykk på cellemembranen og, under etterfølgende stimulering med RANKL, differensierer til tartratresistent syrefosfatase (TRAP)-positive mononukleære pre-OCs og deretter til multinukleerte OCs15,26. OC-er produserer flere enzymer, den viktigste blant dem er TRAP, som muliggjør nedbrytning av fosfoproteiner i bein27. En regulator og markør for OC-differensiering er den OC-assosierte reseptoren (OSCAR). Det oppreguleres tidlig i forløperceller som forplikter seg til OC-linjen28. Modne gigantiske multinukleerte OC-er kan nedbryte (resorbere) skjelettmatrisen ved å generere en stor tetningssone, som er laget av en aktinring som omgir en ruffled grense21,29,30. Benresorpsjonsevnen til OC-er krever cytoskjelettomorganisering og den påfølgende polariseringen og dannelsen av en kronglete membran, som er den såkalte ruffled grensen. Den ruffled grensen er omgitt av et stort sirkulært bånd av en F-aktinrik struktur, som er aktinringen eller tetningssonen. Aktinringintegritet er avgjørende for at p-piller skal resorbere ben både in vitro og in vivo, og defekt ruffled border formation er assosiert med lavere vakuolær adenosintrifosfatase (V-ATPase) uttrykk31,32,33. Videre er p-piller mitokondrierrike celler, og adenosintrifosfat (ATP) assosierer med mitokondrielignende strukturer i OC-er lokalisert ved den rufsete grensen31,32,33. Rotenon virker som en sterk hemmer av mitokondriekomplekset I og påvirker ATP-produksjonen. Rotenon har også vist seg å hemme OC differensiering og funksjon34.
Denne protokollen beskriver en effektiv og optimalisert metode for in vitro osteoklastogenese fra humane perifere blodprøver. I humant perifert blod er CD14+-monocytter hovedkilden til p-piller15,35,36. I denne protokollen er kinetikken for eksponering og konsentrasjonen av M-CSF og RANKL justert for optimal osteoklastogenese. Mononukleære celler separeres først fra erytrocytene og granulocytter som er tilstede i fullblod ved tetthetsgradient; de blir deretter beriket for CD14+ monocytter ved hjelp av positivt utvalg av magnetiske perler. De isolerte CD14+-monocyttene inkuberes deretter over natten med M-CSF. Dette primer monocyttene for å oppregulere uttrykket av RANK15,26. Den påfølgende tilsetningen av RANKL induserer osteoklastogenese og multinukleasjon på en tidsavhengig måte. Aktivresorberende p-piller viser den karakteristiske fordelingen av F-aktinringer ved kanten av cellemembranen30,32 og farging for TRAP. Modne OC-er analyseres ved å kvantifisere TRAP+ multinukleerte (mer enn tre kjerner) celler. Den funksjonelle kapasiteten til modne poc-er kan vurderes ved resorpsjon, aktinringintegritet og ATP-produksjon. Videre kan differensierte CD14− OSCAR+ OC-er berikes og brukes til å vurdere effekten av visse forbindelser på OC-funksjonalitet via mineralresorpsjon (eller dentin) og F-aktinorganisasjon. I tillegg, i dette arbeidet, brukes en kjent OC-hemmer, rotenon, som et eksempel på en forbindelse som påvirker funksjonaliteten til OC. Redusert OC-resorpsjonsaktivitet under rotenon er assosiert med redusert ATP-produksjon og aktinringfragmentering. Avslutningsvis etablerer denne protokollen en robust analyse som kan brukes som referansemetode for å studere flere biologiske aspekter ved OC-differensiering og funksjon in vitro. 
Denne metoden kan brukes til å vurdere (1) potensialet for sirkulerende monocytter for å differensiere til OCs i helse og sykdommer, samt (2) virkningen av terapeutiske kandidater på OC differensiering og funksjon. Denne robuste osteoklastogeneseprotokollen gjør det mulig å bestemme effekten og mekanismene til beinmålrettede terapier på både OC-differensiering fra forløperceller og funksjonen til modne OCer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Osteoklaster (OC) er beinresorberende celler som spiller en sentral rolle i skjelettutvikling og remodellering av voksne bein. Flere beinforstyrrelser er forårsaket av økt differensiering og aktivering av OC, så inhiberingen av denne patobiologien er et sentralt terapeutisk prinsipp. To nøkkelfaktorer driver differensieringen av OC fra myeloide forløpere: makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og reseptoraktivator av nukleær faktor kappa-B-ligand (RANKL). Humane sirkulerende CD14+ -monocytter har lenge vært kjent for å differensiere til p-piller in vitro. Eksponeringstiden og konsentrasjonen av RANKL påvirker imidlertid differensieringseffektiviteten. Faktisk har protokoller for generering av humane OCs in vitro blitt beskrevet, men de resulterer ofte i en dårlig og langvarig differensieringsprosess. Her er det gitt en robust og standardisert protokoll for å generere funksjonelt aktive modne humane OC-er i tide. CD14+ monocytter er beriket fra humane mononukleære celler i perifert blod (PBMC) og primet med M-CSF for å oppregulere RANK. Påfølgende eksponering for RANKL genererer p-piller på en dose- og tidsavhengig måte. P-piller identifiseres og kvantifiseres ved farging med syreresistent tartratfosfatase (TRAP) og lysmikroskopianalyse. Immunfluorescensfarging av kjerner og F-aktin brukes til å identifisere funksjonelt aktive OC. I tillegg anrikes OSCAR+CD14− modne p-piller ytterligere via flowcytometricellesortering og OC-funksjonalitet kvantifisert ved mineralske (eller dentin/bein) resorpsjonsanalyser og aktinringdannelse. Endelig brukes en kjent OC-hemmer, rotenon, på modne OC, noe som viser at adenosintrifosfat (ATP) produksjon er avgjørende for aktinringintegritet og OC-funksjon. Avslutningsvis etableres en robust analyse for å differensiere høyt antall OCer i dette arbeidet, som i kombinasjon med aktinringfarging og en ATP-analyse gir en nyttig in vitro-modell for å evaluere OC-funksjonen og å skjerme for nye terapeutiske forbindelser som kan modulere differensieringsprosessen.

OC-generering fra CD14+ monocytter Denne metoden tok sikte på enkelt å skille et stort antall OCs fra humant perifert blod CD14+ monocytter in vitro, vanligvis i løpet av 1 uke. For det første ble CD14+-monocytter beriket fra PBMC og primet med M-CSF over natten for å oppregulere RANK, som tidligere rapportert15. Etter monocyttpriming, for å bestemme den optimale konsentrasjonen av RANKL for OC differensiering og modning, ble RANKL-konsentrasjoner på 1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml og 100 ng / ml, sammen med 25ng / ml m-csf, brukt. Tilsetningen av RANKL ga et økende antall store TRAP-positive multinukleerte p-piller på en doseavhengig måte, og dette ble vurdert ved hjelp av TRAP-farging. Modne OC-er er definert som TRAP-positive celler med flere kjerner (vanligvis mer enn tre; figur 2A,B og tilleggsfigur 1). Videre ble kinetikken til OC-differensiering fra monocytter undersøkt ved hjelp av TRAP-farging og lysmikroskopi over en 2-14 dagers kulturperiode. I dette tilfellet ble OC-differensiering ved bruk av en mellomkonsentrasjon på 50 ng / ml RANKL valgt for å vurdere hvor raskt OCs differensiert i kultur. Under disse dyrkningsbetingelsene var multinukleerte p-piller synlige fra dag 5 og fremover, og optimal differensiering ble nådd dag 7 (figur 2C). Den langvarige inkubasjonen av kulturer utover 10 dager på plast resulterte i unormalt gigantiske smeltede celler. I denne protokollen brukes dag 6-8 vanligvis som det optimale endepunktet for OC-generering. OC-ene kan kvantifiseres eller brukes til nedstrømsanalyser.
Funksjonsvurdering av differensierte p-piller For å bestemme den funksjonelle aktiviteten til de genererte OC-ene, undersøkte vi deres resorptive aktivitet ved å differensiere OC-ene på en mineralisert overflate. Siden store p-piller bare genereres etter en 7-dagers dyrkningsperiode, og for å gi tilstrekkelig tid til å resorbere mineralsubstratet, ble kulturene opprettholdt til dag 10. Dannelse av runde hull, eller resorpsjonsgroper, ble kun observert på mineraliserte overflater av brønner med celler som var behandlet med både M-CSF og RANKL (figur 3). Dermed tillater prosentandelen av oppløst mineralisert overflate (resorpsjonsgroper) å bestemme OC-resorptivkapasiteten. I tillegg viste p-pillene som ble differensiert etter denne protokollen frem til dag 7, både på plast- og glasskammerlysbilder, en velorganisert aktinringstruktur som kunne visualiseres ved immunfluorescerende farging (tilleggsfigur 2).
Effekt av en inhibitor på moden OC-funksjon De ovennevnte dyrkingsbetingelsene ble benyttet for å bestemme funksjonsevnen til in vitro-genererte OC-er i nærvær av den kjente OC-hemmeren, rotenon34. P-pillene ble differensiert i 6-8 dager, og CD14−OSCAR+ p-piller og OC-forstadier ble anriket via flowcytometri (figur 4). De anrikede cellene ble deretter belagt med 50 000 celler per brønn på en mineralbelagt 96-brønnsplate i pro-osteoklastogent medium (25 ng / ml m-csf og RANKL) i 3 dager. Behandling med rotenon (figur 5A,B) hemmet doseavhengig resorpsjonen av den mineraliserte overflaten sammenlignet med den ubehandlede kontrollbrønnen, i samsvar med tidligere studier34. I tillegg ble OC-funksjonalitet vurdert via ATP-produksjon og aktinringdannelse. Den rotenonavhengige hemmingen av OC-resorpsjon var assosiert med hemming av ATP-produksjon (figur 5C). Resorberende OC-er er svært polariserte celler som regulerer deres resorptive kapasitet ved å fremme cytoskjelettorganisasjon. Alexa fluor 647 konjugert falloidin ble brukt til å merke F-aktin cytoskjelettet av de modne OCs dyrket i nærvær eller fravær av rotenon. Rotenon forårsaket fragmenteringen av den RANKL-deriverte aktinringen til de modne OC-ene (figur 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> Figur 2: OC-er som effektivt skiller seg fra CD14+ monocyttforløpere. CD14+ monocytter ble magnetisk anriket, belagt med 1 x 105 celler/brønn i 96-brønnsplater, og inkubert over natten med 25 ng/ml M-CSF. (A) M-CSF-primede monocytter ble stimulert med økende konsentrasjoner av RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml og 100 ng/ml), fiksert og farget for TRAP på dag 7. Bilder ble samlet inn, og TRAP + multinucleated cells (MNC) ble talt. Representative bilder av TRAP-farging er vist i tilleggsfigur 1. Feilfeltene viser gjennomsnittlig ± SD (n = 3). Dataene ble analysert med en enveis ANOVA og Holm-Sidaks flere sammenligningstest for parede data; * P ≤ 0,05 og ** P ≤ 0,005. (B) Representativt bilde av en TRAP-farget brønn av en 96-brønns plate som viser den typiske mengden OCs/well expected og deres morfologi under 25 ng/ml RANK-L sammenlignet med M-CSF-avledede makrofager på dag 7. Skalastenger: 1000 μm. (C) Representative bilder av OC-dannelse under 50 ng/ml RANKL vurdert ved TRAP-farging fra dag 2 til dag 14. OC-er er synlige fra dag 5 og utover. Giant unormalt smeltet OCs er tilstede etter 10 dager. Skala barer: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> Figur 3: Resorptive p-piller differensiert fra CD14+ -monocytter. CD14+ -celler isolert fra PBMC ble differensiert i 10 dager til p-piller i nærvær av 25 ng/ml m-csf (m) og RANKL (R) på mineralanalyseoverflater (osteo-assay). (A) Bilder av representative rekonstruerte brønner tatt ved 10x forstørrelse for å analysere resorpsjonen på dag 10 (mineralsubstrat i grått; resorpsjonsgroper i hvitt). Skalastenger: 1000 μm. (B) Kvantifisering av prosentandelen av resorbert areal. Resorpsjonsdataene ble analysert med en Wilcoxon-paret analyse. Feilfeltene viser gjennomsnittlig ± SD (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> Figur 4: Flowcytometrianrikning av CD14−OSCAR+ OC. CD14+-monocytter ble anriket fra PBMC, og p-pillene ble differensiert som tidligere beskrevet. Adeherente OC-kulturer ble løsrevet med akkutase og farget for flowcytometri. (AC) POC ved dag 8 ble sortert basert på CD14 og OSCAR-uttrykk. (A) Representativ sorteringsstrategi. Cellene ble gated som singleter, negative for død farging, og CD14 + OSCAR + (rød) og CD14 − OSCAR + (blå) undergrupper ble sortert. (B) Representative plott som viser overlappende OSCAR-farging av RANKL-deriverte OC-er (cyan) og kontroll-M-CSF-deriverte makrofager (oransje). I rødt er OSCAR isotypefarget kontroll av RANKL-avledede OC-er. (C) De sorterte populasjonene ble belagt på plast og fikk feste seg i 2 timer i pro-OC medium (25 ng / ml m-csf og 50 ng / ml RANKL), etterfulgt av TRAP-farging og visualisering. De representative bildene viser mangel på TRAP+-celler i CD14+-undergruppen (rød) og mono- og multinukleerte TRAP+ pre-OC-er og OC-er i CD14−-undergruppen (blå). Skala barer: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> Figur 5: Analyser for å vurdere funksjonen til modne OCer. For å evaluere funksjonen til modne OC ble CD14+-celler isolert fra PBMC dyrket enten med M-CSF (M) alene eller kombinert med RANKL (R) i 7 dager, p-pillene ble anriket via flowcytometri, og p-pillene ble deretter behandlet med inhibitorrotenon i 24 timer. (A) Modne p-piller ble sortert via flowcytometri (CD14−OSCAR+) og ble dyrket på en mineralanalyseoverflate i nærvær eller fravær av rotenon i 3 dager, hvoretter cellene ble bleket og avbildet ved 10x for å avsløre det resorberte området (resorpsjonsgroper i hvitt). (A) Representative rekonstruerte bilder av brønner. Skalastenger: 1000 μm. (B) Kvantifiseringen av prosentandelen av resorbert areal. Dataene i (B) ble analysert med en enveis ANOVA med Dunns multiple sammenligningstest (n = 7); * P ≤ 0,05 og ** P ≤ 0,01. Feilfeltene viser gjennomsnittlig ± SD. (C) Totalt intracellulært ATP-innhold av udifferensiert og dag 7 differensierte modne OCer differensiert med RANKL og behandlet med enten vehikkel eller rotenon (10 nM og 30 nM). Her ble 2DG og oligomycin brukt som positive kontroller for analysen og ble tilsatt 30 minutter før cellelyse og ATP-kvantifisering. Feilfeltene viser gjennomsnittet ± SD (n = 4). Dataene ble analysert med en enveis ANOVA og Dunnetts multippel sammenligningstest for parede data. ** P ≤ 0,01. (D) Et representativt 20x bilde av modne p-piller farget for aktinringdannelse (rød) og kjerner (blå), som viser tap av aktinringen med inhibitoren. Skala barer: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Plate format</td>
			<td>96 brønn-plate</td>
			<td>48 brønn-plate</td>
			<td>24 brønn-plate</td>
			<td>12 brønn-plate</td>
			<td>6 brønn-plate</td>
		</tr><tr><td>volum</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225–250 μL</td>
			<td>450–500 μL</td>
			<td>0,8–1 ml</td>
			<td>1,8–2 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Volum av cellesuspensjon for forskjellige plateformater. Volumene beregnes med utgangspunkt i en 1 x 106 celler/ml løsning og gir en optimal tetthet for cellefusjon.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Fluorofor, klon</td>
			<td>Volum (μL) per 106 celler</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/Cyanine7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer for cellesortering</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Antistoff master mix løsning. 
Tilleggsfigur 1: TRAP-farging av RANKL-doseresponsen. CD14+ -monocytter ble magnetisk anriket, belagt med 1 x 105 celler/brønn i 96-brønnsplater og inkubert over natten med 25 ng/ml m-csf, som i figur 2. Representative bilder av TRAP-farging viser MCSF-primede monocytter stimulert med økende konsentrasjoner av RANKL (1 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml og 100 ng/ml), fiksert og farget for TRAP på dag 7. Skala barer: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfigur 2: Fungerende ringfarging i fullt differensierte OC-er. (A) En 10x forstørrelse av OCs differensiert på TC-plast og farget med AF647 phalloidin (i rødt). Skala bar: 400 μm. (B) En 40x forstørrelse av OCs differensiert på glass kammer lysbilder og farget med AF488 phalloidin (i gult). Skala bar: 100 μm.Kjernene er farget med DAPI, vist i blått i (A) og i cyan i (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfigur 3: Effekt av forskjellige FBS-batcher på OC-differensieringseffektivitet. P-piller ble differensiert fra CD14+ monocytter i nærvær av 25 ng/ml m-csf og 50 ng/ml rankl (mr) i 7 dager. Kontrollbrønnene hadde kun M-CSF (M). (A) Representative 10x forstørrelser (skala barer: 400 μm) og (B) kvantifisering av TRAP-farget OCs differensiert fra en donor i to forskjellige partier av FBS. Feilfeltene viser gjennomsnittlig ± SD for tre tekniske replikater. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoklaster er viktige beinresorberende celler i kroppen. Denne protokollen beskriver en pålitelig metode for in vitro differensiering av osteoklaster fra humane perifere blodmonocytter. Denne metoden kan brukes som et viktig verktøy for å forstå osteoklastbiologi i homeostase og i sykdommer.

Differensiering av funksjonelle osteoklaster fra humant perifert blod CD14+ monocytter

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0.Vår protokoll beskriver en optimalisert og reproduserbar metode for å generere osteoklast in vitro som kan brukes til å undersøke mekanismene som ligger til grunn for deres differensieringsprosess og funksjonalitet. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å generere et høyt antall funksjonelt aktive osteoklaster innen bare en uke. Høyt differensieringsutbytte oppnås ved å bruke rensede monocytter og tilsette cytokiner i tide.Osteoklaster er ansvarlige for bein ødeleggelse i alle former for leddgikt, og denne metoden gir verktøy for å skjerme nye terapeutiske forbindelser som kan modulere deres differensiering og / eller funksjoner. Demonstrere prosedyren vil være Patricia Riedlova, en doktorgradsstudent fra vårt laboratorium. For å begynne, isolere PBMCs ved å overføre blodet til et nytt 50 milliliter rør.Fortynn den med steril PBS i like stort volum for friskt blod, eller et 1: 3-forhold for leukocyttkegler og buffy strøk. Bland blodet forsiktig ved inversjon. Forbered 15 milliliter rør som inneholder tre milliliter tetthetsgradientmedium, og legg sakte åtte til 10 milliliter fortynnet blod på toppen av tetthetsgradientmediet, unngå blanding.Sentrifuger røret ved 400 x g i 30 minutter ved romtemperatur uten brems. Kast deretter topplaget forsiktig med en Pasteur-pipette. Samle det underliggende interfaselaget som inneholder PBMCene, og overfør dette laget til et nytt 50 milliliter rør.Suspender cellene opp til 50 milliliter med steril PBS, og vask av restgradientmediet ved sentrifugering ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur med full brems. For å fjerne gjenværende blodplater, gjenta sentrifugeringsprosessen som beskrevet i manuskriptet, resuspender de isolerte og rensede PBMCene i 20 ml PBS, og tell dem ved hjelp av et hemacytometer etter standardmetoden. For å berike CD14 + monocytter, overfør 1 x 10 til den syvende PBMC til et egnet polystyren rundbunnsrør, og pellet cellene ved 300 x g i fem minutter.Etter å ha kastet supernatanten og resuspendert cellepelleten i celleseparasjonsbuffer, inkuber cellene med 10 mikroliter antistoffcocktail per 100 mikroliter med lokket på i 10 minutter. På slutten av inkubasjonen, tilsett 10 mikroliter av magnetiske nanopartikkelperler per 100 mikroliter, og inkuber i tre minutter med lokket på. Fyll opp volumet til 2,5 milliliter med celleseparasjonsbufferen.Plasser røret i en magnet, og rug i tre minutter med lokket av. Kast nå den negative cellepopulasjonen med en kontinuerlig bevegelse ved inversjon mens røret fortsatt er i magneten. Fjern røret fra magneten, vask de berikede CD14 + monocyttene festet til magnetkulene ved å resuspendere dem i 2,5 milliliter av cellesuspensjonsbufferen, og plasser røret tilbake i magneten.Tell de isolerte cellene som vist tidligere. Sentrifuge de oppsamlede cellene ved 300 x g i fem minutter. Etter å ha kastet supernatanten, resuspenderer cellene ved 1 million celler per milliliter i komplett alfa minimum essensielt medium med 10% FBS.For å skille osteoklasten, tilsett M-CSF ved en endelig konsentrasjon på 25 nanogram per milliliter til cellesuspensjonen, og bland ved å pipettere grundig for å homogenisere cellesuspensjonen. Plate 100 mikroliter av suspensjonen per brønn i en flatbunn 96-brønnplate. Deretter tilsettes 200 mikroliter sterilt destillert vann per brønn rundt de belagte cellene for å forhindre middels fordampning og kanteffekter i kultursystemet.Inkuber cellene over natten i omtrent 18 til 20 timer ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Forbered ferske medier supplert med M-CSF og RANK-ligand. Etter inkubasjonen, fjern forsiktig halvparten av mediet ved aspirasjon ved hjelp av en P200-pipette, og erstatt den med friskt, varmt komplett medium supplert med M-CSF og RANK-ligand ved en endelig konsentrasjon på 25 nanogram per milliliter.Differensiere cellene til osteoklaster i syv til 14 dager med en fullstendig erstatning av medium hver tredje dag. Etter å ha fjernet mediet, fikser du de differensierte adherente osteoklastene med 100 mikroliter per brønn av den fremstilte fikseringsløsningen, og inkuberer i ett minutt. Ikke berør bunnen av brønnene for å unngå å skrape de tilhørende cellene.Når brønnene er vasket tre ganger med 300 mikroliter sterilt destillert vann, tapper platene tørre og tilsett 100 mikroliter nylaget fargeløsning til hver brønn. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i mørket i 20 minutter. Etter inkubering, fjern fargeløsningen ved inversjon og vask platen tre ganger med 300 mikroliter per brønn destillert vann.Fjern overflødig vann ved å banke platene på papirhåndklær, og la platene være åpne og beskyttet mot lys til lufttørking over natten. Bruk et lysfeltmikroskop med flisalternativ, og ta bilder ved 10x eller 20x for å fange hele brønnoverflaten. Tell osteoklastene identifisert som TRAP + lilla fargede celler manuelt med mer enn tre kjerner ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare med en celleteller-plugin.Plate 100 mikroliter av de isolerte CD14 + monocytter per brønn i et 18-brønns kammerlysbilde ved en celletetthet på 1 x 10 til den femte cellen per brønn. Differensiere osteoklastene i nærvær av M-CSF og RANK ligand som vist tidligere med en fullstendig endring av medium hver tredje dag. På sluttpunktet, fjern mediet forsiktig og vask hver brønn to ganger med 200 mikroliter forvarmet PBS ved pH 7,4.Ikke la brønnene tørke mellom trinnene. Fest prøven med 100 mikroliter per brønn med 4% formaldehydoppløsning i PBS, og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur på en orbital shaker med forsiktig risting. Etter inkubering, vask cellene to ganger med 200 mikroliter per brønn PBS.Permeabiliser cellene med 100 mikroliter per brønn på 0,1% Triton x-100 oppløsning fortynnet i PBS, og inkuber i 10 minutter som vist tidligere. Vask to ganger med 200 mikroliter per brønn PBS. For å blokkere ikke-spesifikk binding og øke signalet, tilsett 100 mikroliter blokkeringsløsning laget med 2% bovint serumalbumin og PBS-løsning.Inkuber i 20 minutter ved romtemperatur på en orbital shaker med mild risting. Etter fjerning av blokkeringsoppløsningen, tilsett 100 mikroliter fluorescerende konjugert falloidinoppløsning fortynnet i 2% BSA / PBS-oppløsning til hver brønn. Vask to ganger med 200 mikroliter per brønn PBS.Flekk kjernene med 100 mikroliter per brønn av en løsning av PBS inneholdende 300 nanomolar DAPI. Etter 10 til 15 minutter, fjern DAPI-løsningen og erstatt den med 100 mikroliter per brønn PBS. Visualiser fargingen ved hjelp av passende immunfluorescens eller konfokale mikroskoper ved fire til 40x.De modne osteoklastene er definert som TRAP+multiple nukleatceller. Tilsetningen av RANK-ligand produserte et økende antall store TRAP+multinukleerte osteoklaster på en doseavhengig måte. Kinetikken til osteoklastdifferensiering fra monocytter ble undersøkt over en dyrkningsperiode på to til 14 dager.Multinukleerte osteoklaster var synlige fra dag fem og utover, og optimal differensiering ble nådd på dag syv. Differensieringen av osteoklaster på mineraliserte overflater gjør det mulig å vurdere deres resorpsjonsaktivitet ved å analysere dannelsen av runde hull eller resorpsjonsgroper. Prosentandelen av resorpsjon øker signifikant i nærvær av M-CSF og RANK ligand sammenlignet med M-CSF alene.Videre hemmet behandling med rotenondoseavhengig resorpsjonen av den mineraliserte overflaten sammenlignet med den ubehandlede kontrollbrønnen. Den rotenonavhengige hemmingen av osteoklastresorpsjon var assosiert med hemming av ATP-produksjon. Fragmenteringen av RANK-ligandderivert aktinring av den modne OCS ble observert i nærvær av rotenon.Det er viktig å sikre at de anrikede monocyttene ikke inneholder blodplater, at cellene er belagt med riktig tetthet, og at de omkringliggende brønnene er fylt med vann for å unngå kanteffekten. Denne protokollen er spesielt nyttig for mekanistisk å undersøke hvordan osteoklaster dannes, og hva som påvirker deres funksjonalitet både i grunnleggende og translasjonsvitenskap. For eksempel ved å bruke forbindelser eller proteiner som kan modulere disse prosessene.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Kvantitativ Imaging av Lineage-spesifikke Toll-like receptor-mediert signalering i monocytter og dendrittiske celler fra små prøver av Human Blood

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation of Human alloantigen spesifikke T-celler fra perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Den Isolation, Differensiering, og Kvantifisering av humane antistoff-sekresjon B-celler fra blod: ELISPOT som en funksjonell Avlesning av humoral immunitet

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dekstran forbedrer Lentiviral signaltransduksjon effektiviteten av Murine og menneskelig primære NK celler

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte differensiering og blodplater formasjon fra menneske ledningen blod-avledet CD34+ celler

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Vurdering av Synaptic grensesnittet av primære menneskelige T-celler fra perifert blod og lymfoidvev

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Isolasjon, Transfeksjoner, og kultur for Primary Human monocytter

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...