Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Os autores agradecem ao Flow Core Facility e ao Glasgow Imaging Facility (GIF) dentro da Escola de Infecção e Imunidade por seu apoio e assistência neste trabalho.

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

A fácil cultura e o isolamento de um grande número de CO funcionais in vitro são importantes para o avanço da compreensão da biologia óssea e das doenças mediadas por CO. Classicamente, as CO eram geradas em coculturas com osteoblastos ou células estromais e células hematopoéticas do baço ou da medula óssea38,39. Um avanço significativo no entendimento da osteoclastogênese foi a identificação do RANKL como o principal regulador da formação, diferenciação e sobrevida do CO40. Os primeiros protocolos de sistemas de cultura dependentes de RANKL utilizavam CMSP para geração de CO21,41,42. No entanto, essas culturas mistas são longas e apresentam muitos fatores de confusão que limitam a capacidade de testar os efeitos diretos sobre a diferenciação e função do CO. Este protocolo descreve um modelo in vitro eficiente e confiável de osteoclastogênese a partir de monócitos CD14+ periféricos humanos, no qual a osteoclastogênese ótima pode ser obtida em até 7 dias (Figura 1 e Figura 2), o que é consideravelmente mais rápido quando comparado a alguns outros protocolos43,44,45,46. As principais características distintivas deste protocolo são (1) o uso de monócitos CD14+ purificados, (2) o priming dos monócitos com M-CSF antes da exposição ao RANKL, (3) o comprimento da cultura (<7 dias) e (4) a detecção confiável da inibição da formação de OC (coloração TRAP) e função (reabsorção, produção de ATP, reorganização do anel de actina) com inibidores. 
Durante a otimização da metodologia, vários pontos críticos foram identificados. Tem sido observado que a diferenciação in vitro de CO é amplamente dependente da densidade de semeadura dos monócitos CD14+. Assim, neste protocolo, as células são semeadas em alta densidade (1 x 105 células/poço de uma placa de 96 poços, em 100 μL de meio), pois é essencial que as células possam interagir entre si e estar próximas de se fundir e se tornarem OCs maduras. Da mesma forma, semear células em uma densidade muito alta limita sua diferenciação e crescimento devido a limitações médias e à falta do espaço necessário. Além disso, para obter o máximo sucesso com este protocolo, é importante realizar a separação do gradiente de densidade cuidadosamente e garantir que a população enriquecida de células CD14+ seja a mais pura possível. Por exemplo, etapas inadequadas de lavagem resultam na falta de remoção de plaquetas, o que, consequentemente, inibe a diferenciação das CO47,48. Da mesma forma, a presença de menor contaminação de células T em preparações CD14+ isoladas estimuladas apenas com M-CSF pode resultar em diferenciação de CO, potencialmente via secreção de RANKL por células T49. Portanto, é importante incluir um controle M-CSF para cada experimento. Uma verificação de pureza de rotina, especialmente ao usar um novo kit de isolamento, também é recomendada para garantir a pureza da amostra.
Os números ótimos de OC (intervalo: ~200-1.600 OCs/poço) são obtidos usando meio α-MEM enriquecido com nucleosídeos e L-glutamina. Outros meios de cultura convencionais, incluindo o meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM) e o meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, afetam a produção de CO. A fonte de SFB também pode influenciar a osteoclastogênese. Diferentes lotes de SFB podem levar à redução da osteoclastogênese derivada do RANK-L, bem como ao aparecimento de baixo número de células multinucleadas TRAP+ nos controles M-CSF (Figura 3 Suplementar). Portanto, para obter resultados consistentes, recomenda-se testar novos lotes de FBS antes do uso e continuar com o mesmo lote ao longo dos experimentos para minimizar as variações no processo de diferenciação. Além disso, a variabilidade doador-doador, em termos do número total de CO diferenciados obtidos no ponto de tempo final, constitui uma limitação ao usar esse protocolo para comparar, por exemplo, doadores saudáveis com pacientes. Nesses casos, é imprescindível usar exatamente as mesmas condições e o mesmo lote de meio, FBS e outros reagentes.
Outra etapa necessária para a diferenciação e maturação ótima do CO é o condicionamento dos monócitos com M-CSF antes da adição de RANKL. A exposição das células ao M-CSF 18-24 h antes do RANKL prepara os monócitos para upregulation da expressão de RANK15,26. A adição de RANKL neste momento garante a diferenciação ideal do OC de forma dose-dependente. O grau de diferenciação das CO varia de doador para doador; no entanto, 25 ng/mL de RANKL geralmente é suficiente para diferenciar um alto número de CO na maioria dos doadores. Adicionalmente, 25 ng/mL de RANKL podem ser utilizados em ensaios para a triagem inicial de compostos, pois facilita a avaliação dos efeitos potencializadores e inibitórios dos compostos teste. Outros sistemas de cultura utilizaram tempos mais longos de pré-incubação do M-CSF antes da adição de RANKL, mas isso resulta em um tempo de cultivo mais longo para osteoclastogênese50. Além disso, deixar os monócitos preparados incubarem durante a noite permite que eles se fixem à placa, embora não em um estado totalmente aderente. Portanto, quando o RANKL é introduzido pela primeira vez, o meio deve ser trocado pela metade com muito cuidado, em vez de completamente trocado para evitar o desprendimento e a perda dos monócitos primados. O meio também precisa ser atualizado a cada 3-4 dias para evitar a depleção do meio e evitar a morte celular. Além disso, devido ao baixo volume utilizado neste ensaio (100 μL/poço em uma placa de 96 poços), é de extrema importância ter uma estrutura de poços vazios que sejam preenchidos com uma solução aquosa (isto é, destilado estéril H2O ou PBS) ao redor dos poços de ensaio. Isso evita a evaporação média e os efeitos de borda.
Finalmente, para ensaios metabólicos (por exemplo, ensaios de ATP), é imperativo que as células sejam viáveis para evitar grandes desvios-padrão entre réplicas (Figura 5). A alta viabilidade das células também é importante para a classificação das células e para a posterior cultura dos COs triados (Figura 4). Esse método, no entanto, tem várias limitações. OCs totalmente maduros são muito aderentes e difíceis de se desprender das placas. Os OCs maiores são muitas vezes impossíveis de destacar, o que pode levar a um menor rendimento celular. Portanto, as células precisam ser contadas após a triagem e antes do plaqueamento na concentração necessária. Além disso, no presente protocolo, um método não enzimático (accutase) para desprender os COs é usado para prevenir alterações de membrana na coloração da superfície a jusante para citometria de fluxo. O uso de raspadores celulares (com terminações macias ou duras) também foi testado e levou à alta morte celular. O descolamento enzimático usando soluções de tripsina/EDTA a 0,05% pode ser usado para um maior rendimento de OCs destacados quando a integridade da membrana não é necessária para aplicações a jusante. Além disso, para evitar que os COs se agrupem, o uso de uma alta concentração de EDTA em todos os tampões após o desprendimento celular, bem como a filtragem apropriada antes da aquisição por citometria de fluxo, são altamente recomendados. É importante notar que as culturas de CO são uma população heterogênea de células consistindo de COs maduros, precursores de CO e macrófagos. Macrófagos podem ser facilmente distinguidos de COs, embora tanto pré-OCs mononucleares quanto COs multinucleares expressem OSCAR e não possam ser distinguidos com o presente método (Figura 4). De fato, esta última questão constitui a principal limitação desse método. Além disso, uma baixa expressão de OSCAR também está presente em culturas de M-CSF (Figura 4B) e pode indicar macrófagos preparados para o comprometimento da linhagem OC. É importante definir a porta para as células OSCAR+ com base no sinal de coloração FMO, como mostrado na Figura 4B.
Em resumo, este protocolo descreve um método otimizado e robusto para a produção eficiente de CO ativos e funcionalmente maduros a partir de monócitos humanos primários circulantes. O ponto forte deste protocolo é sua capacidade de gerar OCs em um curto período de tempo e produzir um alto número de OCs diferenciados. Este método abre caminho para a investigação dos mecanismos básicos subjacentes à diferenciação e função dos CO.

Os osteoclastos (OCs) são células gigantes multinucleadas de linhagem hematopoética com capacidade única de reabsorção óssea. São responsáveis pelo desenvolvimento e remodelação contínua do esqueleto1,2. Nas fases esqueléticas do desenvolvimento, os CO e macrófagos residentes no tecido são derivados de progenitores eritro-mieloides e colonizam o nicho ósseo e os tecidos orgânicos. Em condições fisiológicas, progenitores eritromieloides são necessários para o desenvolvimento ósseo normal e erupção dentária, enquanto o influxo de monócitos sanguíneos circulantes para o nicho ósseo proporciona manutenção pós-natal dos COs, da massa óssea e da cavidade da medula óssea3. Em condições patológicas, monócitos são recrutados para locais de inflamação ativa e podem contribuir para a destruição óssea patológica 4,5.
Pacientes com várias formas de artrite experimentam inflamação articular, levando à destruição articular progressiva causada por CO6. Por exemplo, na artrite reumatoide (AR), as CO superativadas são responsáveis pela erosão óssea patológica e destruiçãoarticular7,8, e os tratamentos atuais muitas vezes não melhoram ou interrompem o dano ósseo9,10,11. Alterações nos monócitos circulantes, tanto em termos de distribuição populacional quanto de assinaturas transcriptômicas e epigenéticas, têm sido relatadas em pacientes com AR12,13,14. Além disso, tem sido relatado que respostas alteradas de monócitos à estimulação inflamatória afetam a osteoclastogênese em pacientes com AR com doença ativa15,16,17.
A diferenciação de COs é um processo complexo de várias etapas que compreende o comprometimento das células precursoras mieloides com a diferenciação em precursores de CO. Durante a osteoclastogênese, os CO tornam-se gigantes e multinucleados através da fusão célula-célula, citocinese incompleta e um processo de reciclagem nuclear descrito como fissão e fusão18,19,20. A capacidade de diferenciar CO in vitro tem permitido avanços significativos no entendimento da biologiaóssea21. Os OCs diferenciam-se dos precursores após exposição ao fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e ao receptor ativador do ligante do fator nuclear kappa-B (RANKL). Esta última é essencial para o desenvolvimento e função normais dos CO in vitro e in vivo, mesmo em condições inflamatórias6,22,23. O RANKL é apresentado por osteoblastos e osteócitos, bem como por células T ativadas e fibroblastos na sinóvia da AR inflamada2,24,25. Durante o processo de diferenciação do CO, monócitos expostos ao receptor M-CSF upregulate ativador da expressão do fator nuclear kappa-B (RANK) em sua membrana celular e, sob estimulação subsequente com RANKL, diferenciam-se em pré-OCs mononucleares positivos para fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) e, em seguida, em OCs multinucleados15,26. Os CO produzem várias enzimas, sendo a principal delas a TRAP, que possibilita a degradação de fosfoproteínas no interior do osso27. Um regulador e marcador de diferenciação de OC é o receptor associado ao OC (OSCAR). É upregulated precocemente em células precursoras que se comprometem com a linhagem OC28. OCs gigantes multinucleados maduros podem degradar (reabsorver) a matriz esquelética gerando uma grande zona de vedação, que é feita de um anel de actina ao redor de uma borda babada21,29,30. A capacidade de reabsorção óssea dos CO requer a reorganização do citoesqueleto e a consequente polarização e formação de uma membrana contorcida, que é a chamada borda babada. A borda babada é cercada por uma grande faixa circular de uma estrutura rica em F-actina, que é o anel de actina ou zona de vedação. A integridade do anel de actina é essencial para que os COs reabsorvam osso tanto in vitro quanto in vivo, e a formação defeituosa de bordas babadas está associada à menor expressão vacuolar de adenosina trifosfatase (V-ATPase)31,32,33. Além disso, os CO são células ricas em mitocôndrias, e o trifosfato de adenosina (ATP) associa-se a estruturas mitocondriais semelhantes às CO localizadas na borda babada31,32,33. A rotenona atua como um forte inibidor do complexo mitocondrial I e afeta a produção de ATP. Também foi demonstrado que a rotenona inibe a diferenciação e a função da CO34.
Este protocolo descreve um método eficiente e otimizado de osteoclastogênese in vitro a partir de amostras de sangue periférico humano. No sangue periférico humano, os monócitos CD14+ são a principal fonte de FO15,35,36. Neste protocolo, a cinética de exposição e as concentrações de M-CSF e RANKL foram ajustadas para osteoclastogênese ótima. As células mononucleares são primeiramente separadas dos eritrócitos e granulócitos presentes no sangue total por gradiente de densidade; eles são então enriquecidos para monócitos CD14+ usando seleção positiva por esferas magnéticas. Os monócitos CD14+ isolados são então incubados durante a noite com M-CSF. Isso prepara os monócitos para upregulation da expressão de RANK15,26. A adição subsequente de RANKL induz osteoclastogênese e multinucleação de forma tempo-dependente. Os OCs de reabsorção ativa mostram a distribuição característica dos anéis de actina F na borda da membrana celular30,32 e coloração para TRAP. Os CO maduros são analisados quantificando-se as células multinucleadas (mais de três núcleos) TRAP+. A capacidade funcional de CO maduros pode ser avaliada por sua reabsorção, integridade do anel de actina e produção de ATP. Além disso, OCs CD14− OSCAR+ diferenciados podem ser enriquecidos e usados para avaliar os efeitos de certos compostos na funcionalidade do OC via reabsorção mineral (ou dentina) e organização da F-actina. Além disso, neste trabalho, um conhecido inibidor de CO, a rotenona, é usado como um exemplo de um composto que afeta a funcionalidade de COs. A redução da atividade de reabsorção de CO sob rotenona está associada à redução da produção de ATP e fragmentação do anel de actina. Em conclusão, este protocolo estabelece um ensaio robusto que pode ser usado como um método de referência para estudar vários aspectos biológicos da diferenciação e função dos CO in vitro. 
Essa metodologia pode ser usada para avaliar (1) o potencial dos monócitos circulantes para se diferenciarem em CO na saúde e na doença, bem como (2) o impacto de candidatos terapêuticos na diferenciação e função dos CO. Este robusto protocolo de osteoclastogênese permite determinar a eficácia e os mecanismos das terapias-alvo ósseas tanto na diferenciação de CO de células precursoras quanto na função de COs maduros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Os osteoclastos (COs) são células reabsorvedoras de osso que desempenham um papel fundamental no desenvolvimento esquelético e na remodelação óssea do adulto. Vários distúrbios ósseos são causados pelo aumento da diferenciação e ativação dos CO, de modo que a inibição dessa patobiologia é um princípio terapêutico fundamental. Dois fatores-chave direcionam a diferenciação de OCs de precursores mieloides: fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) e ativador do receptor do ligante do fator nuclear kappa-B (RANKL). Os monócitos CD14+ circulantes humanos são conhecidos por se diferenciarem em CO in vitro. Entretanto, o tempo de exposição e a concentração de RANKL influenciam na eficiência da diferenciação. De fato, protocolos para a geração de CO humanos in vitro têm sido descritos, mas muitas vezes resultam em um processo de diferenciação pobre e demorado. Aqui, um protocolo robusto e padronizado para gerar OCs humanos maduros funcionalmente ativos em tempo hábil é fornecido. Os monócitos CD14+ são enriquecidos a partir de células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs) e preparados com M-CSF para upregulation RANK. A exposição subsequente ao RANKL gera CO de maneira dose-dependente e tempo-dependente. Os CO são identificados e quantificados por coloração com fosfatase resistente ao ácido tartarato (TRAP) e análise por microscopia óptica. A coloração por imunofluorescência de núcleos e F-actina é usada para identificar OCs funcionalmente ativos. Além disso, os OCs maduros OSCAR+CD14− são ainda mais enriquecidos por meio da classificação celular por citometria de fluxo e funcionalidade do OC quantificada por ensaios de reabsorção mineral (ou dentina/osso) e formação de anéis de actina. Finalmente, um conhecido inibidor de CO, a rotenona, é usado em CO maduros, demonstrando que a produção de trifosfato de adenosina (ATP) é essencial para a integridade do anel de actina e função do CO. Em conclusão, um ensaio robusto para diferenciar altos números de CO é estabelecido neste trabalho, que em combinação com a coloração com anel de actina e um ensaio de ATP fornece um modelo in vitro útil para avaliar a função dos CO e selecionar novos compostos terapêuticos que possam modular o processo de diferenciação.

Geração de OC a partir de monócitos CD14+ Este método visou diferenciar facilmente um grande número de CO de monócitos CD14+ do sangue periférico humano in vitro, tipicamente em 1 semana. Primeiramente, monócitos CD14+ foram enriquecidos a partir de CMSP e preparados com M-CSF durante a noite para upregulation RANK, como relatado anteriormente15. Após o condicionamento de monócitos, para determinar a concentração ótima de RANKL para diferenciação e maturação de CO, foram utilizadas concentrações de RANKL de 1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL e 100 ng/mL, juntamente com 25ng/mL M-CSF. A adição de RANKL produziu um número crescente de grandes OCs multinucleados positivos para TRAP de maneira dose-dependente, e isso foi avaliado usando a coloração TRAP. OCs maduros são definidos como células positivas para TRAP com múltiplos núcleos (tipicamente mais de três; Figura 2A,B e Figura Suplementar 1). Além disso, a cinética de diferenciação de CO de monócitos foi investigada usando coloração TRAP e microscopia de luz durante um período de cultura de 2-14 dias. Neste caso, a diferenciação de CO usando uma concentração intermediária de 50 ng/mL RANKL foi escolhida para avaliar quão rapidamente os CO se diferenciaram em cultura. Nessas condições de cultura, os CO multinucleados foram visíveis a partir do 5º dia, e a diferenciação ótima foi alcançada no 7º dia (Figura 2C). A incubação prolongada das culturas além de 10 dias em plásticos resultou em células fundidas anormalmente gigantes. Neste protocolo, os dias 6-8 são geralmente usados como o ponto final ideal da geração de CO. Os CO podem ser quantificados ou utilizados para ensaios a jusante.
Avaliação funcional de COs diferenciados Para determinar a atividade funcional dos COs gerados, examinamos sua atividade reabsortiva diferenciando os COs em uma superfície mineralizada. Como os grandes COs só são gerados após um período de 7 dias de cultivo, e para permitir tempo suficiente para reabsorver o substrato mineral, as culturas foram mantidas até o 10º dia. A formação de orifícios redondos, ou cavas de reabsorção, foi observada apenas nas superfícies mineralizadas dos poços contendo células tratadas com M-CSF e RANKL (Figura 3). Assim, a porcentagem de superfície mineralizada dissolvida (poços de reabsorção) permite determinar a capacidade reabsortiva do CO. Além disso, os COs diferenciados seguindo esse protocolo até o 7º dia, tanto em lâminas de plástico quanto em câmaras de vidro, apresentaram uma estrutura de anel de actina bem organizada que pôde ser visualizada pela coloração por imunofluorescência (Figura 2 Suplementar).
Efeito de um inibidor na função madura do CO As condições de cultivo acima mencionadas foram utilizadas para determinar a capacidade funcional dos CO gerados in vitro na presença do conhecido inibidor de CO, a rotenona34. Os COs foram diferenciados por 6-8 dias, e os CD14−OSCAR+ OCs e precursores de OC foram enriquecidos por citometria de fluxo (Figura 4). As células enriquecidas foram então plaqueadas a 50.000 células/poço em uma placa de 96 poços revestida com minerais em meio pró-osteoclastogênico (25 ng/mL, M-CSF e RANKL) por 3 dias. O tratamento com rotenona (Figura 5A,B) inibiu dose-dependente a reabsorção da superfície mineralizada em comparação com o poço controle não tratado, consistente com estudos prévios34. Adicionalmente, a funcionalidade do CO foi avaliada através da produção de ATP e formação de anéis de actina. A inibição da reabsorção de CO dependente de rotenona foi associada à inibição da produção de ATP (Figura 5C). As OCs reabsorvedoras são células altamente polarizadas que regulam sua capacidade reabsortiva promovendo a organização do citoesqueleto. A faloidina conjugada Alexa fluor 647 foi usada para marcar o citoesqueleto de actina F dos COs maduros cultivados na presença ou ausência de rotenona. A rotenona causou a fragmentação do anel de actina derivado de RANKL dos CO maduros (Figura 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> Figura 2: OCs diferenciando-se eficientemente dos precursores de monócitos CD14+ . Os monócitos CD14+ foram enriquecidos magneticamente, plaqueados a 1 x 105 células/poço em placas de 96 poços e incubados durante a noite com 25 ng/mL M-CSF. (A) Monócitos com priming M-CSF foram estimulados com concentrações crescentes de RANKL (1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL e 100 ng/mL), fixados e corados para TRAP no dia 7. As imagens foram adquiridas e as células multinucleadas (CMN) TRAP+ foram contadas. Imagens representativas da coloração TRAP são mostradas na Figura Suplementar 1. As barras de erro mostram a média ± DP (n = 3). Os dados foram analisados com ANOVA one-way e teste de comparações múltiplas de Holm-Sidak para dados pareados; * P ≤ 0,05 e ** P ≤ 0,005. (B) Imagem representativa de um poço corado com TRAP de uma placa de 96 poços mostrando a quantidade típica de OCs/poço esperado e sua morfologia abaixo de 25 ng/mL RANK-L em comparação com macrófagos derivados de M-CSF no dia 7. Barras de escala: 1000 μm. (C) Imagens representativas da formação de CO sob RANKL de 50 ng/mL avaliadas pela coloração TRAP do dia 2 ao dia 14. Os OCs são visíveis a partir do dia 5. OCs gigantes anormalmente fundidos estão presentes após 10 dias. Barras de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> Figura 3: OCs reabsortivos diferenciados de monócitos CD14+ . Células CD14+ isoladas de CMSP foram diferenciadas por 10 dias em CO na presença de 25 ng/mL M-CSF (M) e RANKL (R) em placas de superfície de ensaio mineral (osteoensaio). (A) Imagens de poços reconstruídos representativos captadas em aumento de 10x para análise da reabsorção no 10º dia (substrato mineral na cor cinza; fossas de reabsorção na cor branca). Barras de escala: 1000 μm. (B) Quantificação da porcentagem de área reabsorvida. Os dados de reabsorção foram analisados com análise pareada de Wilcoxon. As barras de erro mostram a média ± DP (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> Figura 4: Enriquecimento por citometria de fluxo de CD14−OSCAR+ OCs. Os monócitos CD14+ foram enriquecidos a partir de CMSP, e os CO foram diferenciados conforme descrito anteriormente. Culturas de CO aderentes foram destacadas com acutase e coradas para citometria de fluxo. (A-C) Os CO no 8º dia foram classificados com base na expressão de CD14 e OSCAR. (A) Estratégia representativa de triagem. As células foram fechadas como singletes, negativas para coloração morta, e os subgrupos CD14+ OSCAR+ (vermelho) e CD14− OSCAR+ (azul) foram classificados. (B) Gráficos representativos mostrando a sobreposição de coloração OSCAR de OCs derivados de RANKL (ciano) e macrófagos derivados de M-CSF de controle (laranja). Em vermelho está o controle corado pelo isótipo OSCAR dos OCs derivados do RANKL. (C) As populações selecionadas foram plaqueadas em plástico e deixadas aderir por 2 h em meio pró-OC (25 ng/mL M-CSF e 50 ng/mL RANKL), seguido de coloração e visualização por TRAP. As imagens representativas mostram uma falta de células TRAP+ no subconjunto CD14+ (vermelho) e pré-OCs e OCs TRAP+ mono e multinucleados no subconjunto CD14− (azul). Barras de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> Figura 5: Ensaios para avaliar a função de COs maduros. Para avaliar a função de COs maduros, células CD14+ isoladas de CMSP foram cultivadas com M-CSF (M) isoladamente ou combinadas com RANKL (R) por 7 dias, as CO foram enriquecidas por citometria de fluxo e as COs foram então tratadas com o inibidor rotenona por 24 h. (A) Os CO maduros foram selecionados por citometria de fluxo (CD14−OSCAR+) e cultivadas em superfície de ensaio mineral na presença ou ausência de rotenona por 3 dias, após os quais as células foram clareadas e imageadas a 10x para revelar a área reabsorvida (fossas de reabsorção em branco). (A) Imagens representativas reconstruídas de poços. Barras de escala: 1000 μm. (B) A quantificação da porcentagem de área reabsorvida. Os dados em (B) foram analisados com ANOVA one-way com teste de comparações múltiplas de Dunn (n = 7); * P ≤ 0,05 e ** P ≤ 0,01. As barras de erro mostram a média ± DP. (C) Conteúdo de ATP intracelular total de OCs maduros diferenciados indiferenciados e dia 7 diferenciados com RANKL e tratados com veículo ou rotenona (10 nM e 30 nM). Aqui, 2DG e oligomicina foram usados como controles positivos para o ensaio e foram adicionados 30 minutos antes da lise celular e quantificação de ATP. As barras de erro mostram a média ± DP (n = 4). Os dados foram analisados com ANOVA one-way e teste de comparações múltiplas de Dunnett para dados pareados. ** P ≤ 0,01. (D) Imagem representativa de 20x de OCs maduros corados para formação de anel de actina (vermelho) e núcleos (azul), mostrando a perda do anel de actina com o inibidor. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Formato da chapa</td>
			<td>96 placa de poço</td>
			<td>48 placa de poço</td>
			<td>24 placa de poço</td>
			<td>12 placas de poço</td>
			<td>6 placas de poço</td>
		</tr><tr><td>volume</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225–250 μL</td>
			<td>450–500 μL</td>
			<td>0,8–1 mL</td>
			<td>1,8–2 mL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Volume de suspensão celular para diferentes formatos de placa. Os volumes são calculados a partir de uma solução de 1 x 106 células/mL e fornecem uma densidade ótima para a fusão célula-célula.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Fluoróforo, clone</td>
			<td>Volume (μL) por 106 células</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/Cianina7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Buffer de classificação de células</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2 : Solução de mistura mestra de anticorpos. 
Figura suplementar 1: Coloração TRAP da resposta à dose RANKL. Os monócitos CD14+ foram enriquecidos magneticamente, plaqueados a 1 x 105 células/poço em placas de 96 poços e incubados durante a noite com 25 ng/mL M-CSF, como na Figura 2. Imagens representativas da coloração TRAP mostram monócitos primed MCSF estimulados com concentrações crescentes de RANKL (1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL e 100 ng/mL), fixados e corados para TRAP no dia 7. Barras de escala: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar 2: Coloração do anel atuante em OCs totalmente diferenciados. (A) Aumento de 10x dos COs diferenciados em plástico TC e corados com faloidina AF647 (em vermelho). Barra de escala: 400 μm. (B) Aumento de 40x dos COs diferenciados em lâminas de câmara de vidro e corados com faloidina AF488 (em amarelo). Barra de escala: 100 μm.Os núcleos são corados com DAPI, mostrados em azul em (A) e em ciano em (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 3: Efeito de diferentes lotes FBS na eficiência de diferenciação do OC. Os CO foram diferenciados dos monócitos CD14+ na presença de 25 ng/mL M-CSF e 50 ng/mL RANKL (MR) por 7 dias. Os poços controle possuíam apenas M-CSF (M). (A) Aumentos representativos de 10x (barras de escala: 400 μm) e (B) quantificação de CO corados com TRAP diferenciados de um doador em dois lotes diferentes de SFB. As barras de erro mostram o DP médio ± de três réplicas técnicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Os osteoclastos são células-chave de reabsorção óssea no corpo. Este protocolo descreve um método confiável para a diferenciação in vitro de osteoclastos de monócitos de sangue periférico humano. Este método pode ser utilizado como uma importante ferramenta para o entendimento da biologia dos osteoclastos na homeostase e nas doenças.

Diferenciação de Osteoclastos Funcionais de Monócitos CD14+ do Sangue Periférico Humano

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0.Nosso protocolo descreve um método otimizado e reprodutível para gerar osteoclastos in vitro que pode ser usado para investigar os mecanismos subjacentes ao seu processo de diferenciação e funcionalidade. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de gerar um alto número de osteoclastos funcionalmente ativos em apenas uma semana. Um alto rendimento de diferenciação é obtido usando monócitos purificados e adicionando citocinas a tempo.Os osteoclastos são responsáveis pela destruição óssea em todas as formas de artrite, e este método fornece as ferramentas para selecionar novos compostos terapêuticos que podem modular sua diferenciação e/ou funções. Quem demonstrará o procedimento será Patricia Riedlova, aluna de doutorado do nosso laboratório. Para começar, isole as PBMCs transferindo o sangue para um novo tubo de 50 mililitros.Diluir com PBS estéril em volume igual para sangue fresco ou proporção de 1:3 para cones de leucócitos e pelagens bufantes. Misture suavemente o sangue por inversão. Prepare tubos de 15 mililitros contendo três mililitros de meio de gradiente de densidade e coloque lentamente de oito a 10 mililitros de sangue diluído no topo do meio de gradiente de densidade, evitando misturar.Centrifugar o tubo a 400 x g durante 30 minutos à temperatura ambiente sem travão. Em seguida, descarte cuidadosamente a camada superior com uma pipeta Pasteur. Colete a camada de interfase abaixo que contém os PBMCs e transfira essa camada para um novo tubo de 50 mililitros.Suspender as células até 50 mililitros com PBS estéril e lavar o meio de gradiente de densidade residual centrifugando a 300 x g por 10 minutos à temperatura ambiente com freio completo. Para remover as plaquetas residuais, repita o processo de centrifugação descrito no manuscrito, ressuspenda as CMSP isoladas e purificadas em 20 mililitros de PBS e conte-as usando um hemacitômetro seguindo o método padrão. Para enriquecer os monócitos CD14+, transfira 1 x 10 para o sétimo PBMCs em um tubo de fundo redondo de poliestireno adequado e peletize as células a 300 x g por cinco minutos.Após descartar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em tampão de separação celular, incubar as células com 10 microlitros de coquetel de anticorpos por 100 microlitros com a tampa ligada por 10 minutos. Ao final da incubação, adicionar 10 microlitros das esferas de nanopartículas magnéticas por 100 microlitros e incubar por três minutos com a tampa ligada. Aumente o volume para 2,5 mililitros com o tampão de separação celular.Coloque o tubo em um ímã e incube por três minutos com a tampa desligada. Agora, descarte a população de células negativas com um movimento contínuo por inversão enquanto o tubo ainda está no ímã. Retire o tubo do ímã, lave os monócitos CD14+ enriquecidos ligados às esferas magnéticas, ressuspendendo-os em 2,5 mililitros do tampão de suspensão da célula e coloque o tubo de volta no ímã.Conte as células isoladas conforme demonstrado anteriormente. Centrifugar as células coletadas a 300 x g por cinco minutos. Após descartar o sobrenadante, ressuspenda as células a 1 milhão de células por mililitro em meio essencial alfa mínimo completo com 10% de FBS.Para diferenciar o osteoclasto, adicione M-CSF em uma concentração final de 25 nanogramas por mililitro à suspensão celular e misture pipetando completamente para homogeneizar a suspensão celular. Placa de 100 microlitros da suspensão por poço em uma placa de fundo plano de 96 poços. Em seguida, adicione 200 microlitros de água destilada estéril por poço ao redor das células chapeadas para evitar evaporação do meio e efeitos de borda no sistema de cultura.Incubar as células durante a noite por aproximadamente 18 a 20 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Preparar meios frescos suplementados com M-CSF e ligante RANK. Após a incubação, remova cuidadosamente metade do meio por aspiração usando uma pipeta P200 e substitua-o por meio completo fresco e quente suplementado com M-CSF e ligante RANK em uma concentração final de 25 nanogramas por mililitro.Diferenciar as células em osteoclastos por sete a 14 dias com substituição completa do meio a cada três dias. Após a remoção do meio, fixar os osteoclastos aderentes diferenciados com 100 microlitros por poço da solução fixadora preparada e incubar por um minuto. Não toque no fundo dos poços para evitar arranhar as células aderentes.Depois que os poços forem lavados três vezes com 300 microlitros de água destilada estéril, seque as placas e adicione 100 microlitros de solução corante recém-preparada a cada poço. Incubar a placa a 37 graus Celsius no escuro por 20 minutos. Após a incubação, remova a solução corante por inversão e lave a placa três vezes com 300 microlitros por poço de água destilada.Retire o excesso de água batendo os pratos em papel toalha e deixe os pratos abertos e protegidos da luz para secar ao ar durante a noite. Usando um microscópio de campo claro com uma opção de telha, tire imagens em 10x ou 20x para capturar toda a superfície do poço. Conte manualmente os osteoclastos identificados como células coradas com TRAP+roxo com mais de três núcleos usando um software de análise de imagem com um plugin de contador de células.Placa de 100 microlitros dos monócitos CD14+ isolados por poço em uma lâmina de câmara de 18 poços a uma densidade celular de 1 x 10 até a quinta célula por poço. Diferenciar os osteoclastos na presença do ligante M-CSF e RANK, conforme demonstrado anteriormente, com troca completa de meio a cada três dias. No ponto final, remova suavemente o meio e lave cada poço duas vezes com 200 microlitros de PBS pré-aquecido em pH 7,4.Não deixe os poços secarem entre as etapas. Fixar a amostra com 100 microlitros por poço de solução de formaldeído a 4% em PBS e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital com agitação suave. Após a incubação, lavar as células duas vezes com 200 microlitros por poço de PBS.Permeabilizar as células com 100 microlitros por poço de solução de Triton x-100 a 0,1% diluída em PBS e incubar por 10 minutos, como mostrado anteriormente. Lave duas vezes com 200 microlitros por poço de PBS. Para bloquear a ligação inespecífica e aumentar o sinal, adicione 100 microlitros de solução de bloqueio feita com albumina de soro bovino a 2% e solução de PBS.Incubar durante 20 minutos à temperatura ambiente num agitador orbital com agitação suave. Depois de remover a solução de bloqueio, adicionar 100 microlitros de solução de faloidina conjugada fluorescentemente diluída em solução de BSA/PBS a 2% em cada poço. Lave duas vezes com 200 microlitros por poço de PBS.Corar os núcleos com 100 microlitros por poço de uma solução de PBS contendo 300 nanomolares DAPI. Após 10 a 15 minutos, remova a solução DAPI e substitua-a por PBS de 100 microlitros por poço. Visualize a coloração usando imunofluorescência apropriada ou microscópios confocais de quatro a 40x.Os osteoclastos maduros são definidos como TRAP+células nucleadas múltiplas. A adição do ligante RANK produziu um número crescente de grandes osteoclastos TRAP+multinucleados de forma dose-dependente. A cinética de diferenciação dos osteoclastos a partir de monócitos foi investigada durante um período de cultura de dois a 14 dias.Os osteoclastos multinucleados foram visíveis a partir do quinto dia, e a diferenciação ideal foi alcançada no sétimo dia. A diferenciação de osteoclastos em superfícies mineralizadas permite avaliar sua atividade de reabsorção através da análise da formação de orifícios redondos, ou fossas de reabsorção. A porcentagem de reabsorção aumenta significativamente na presença do ligante M-CSF e RANK quando comparado ao M-CSF isoladamente.Além disso, o tratamento com rotenona dose-dependente inibiu a reabsorção da superfície mineralizada em comparação com o poço controle não tratado. A inibição da reabsorção de osteoclastos dependente de rotenona foi associada à inibição da produção de ATP. A fragmentação do anel de actina derivado do ligante RANK do OCS maduro foi observada na presença de rotenona.É importante garantir que os monócitos enriquecidos não contenham plaquetas, que as células sejam plaqueadas na densidade certa e que os poços circundantes sejam preenchidos com água para evitar o efeito de borda. Este protocolo é particularmente útil para interrogar mecanisticamente como os osteoclastos se formam e o que influencia sua funcionalidade tanto na ciência básica quanto na translacional. Por exemplo, usando compostos ou proteínas que podem modular esses processos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansão, Purificação e Avaliação Funcional de Células NK do sangue periférico

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Imunologia e Infecção

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Expansão do sangue periférico humano γδ células T usando zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

O isolamento, a diferenciação e a quantificação de anticorpo humano secretoras de células B de sangue: ELISpot como uma leitura funcional de Imunidade Humoral

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextran aumenta a eficiência de Lentivirus transdução das células NK primário murino e humano

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados CD34 células+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Avaliação da Interface sináptica de células T humano primário do sangue periférico e tecido linfoide

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...