Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Авторы выражают благодарность Flow Core Facility и Glasgow Imaging Facility (GIF) в Школе инфекций и иммунитета за их поддержку и помощь в этой работе.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Легкое культивирование и выделение большого количества функциональных ОК in vitro важны для углубления понимания биологии костей и ОК-опосредованных заболеваний. Классически ОК генерировались в кокультурах с остеобластами или стромальными клетками и кроветворными клетками селезенки или костного мозга38,39. Значительным прорывом в понимании остеокластогенеза стало выделение RANKL как основного регулятора образования, дифференцировки и выживаемости ОК40. Ранние протоколы RANKL-зависимых культуральных систем использовали PBMC для генерацииOC 21,41,42. Тем не менее, эти смешанные культуры являются длительными и представляют множество смешанных факторов, которые ограничивают способность проверять прямое влияние на дифференцировку и функцию ОК. Этот протокол описывает эффективную и надежную модель остеокластогенеза in vitro из периферических моноцитов CD14+ человека, в которой оптимальный остеокластогенез может быть получен в течение 7 дней (рис. 1 и рис. 2), что значительно быстрее по сравнению с некоторыми другими протоколами43,44,45,46. Основными отличительными особенностями этого протокола являются: (1) использование очищенных CD14+ моноцитов, (2) праймирование моноцитов М-КСФ перед воздействием RANKL, (3) продолжительность посева (<7 дней) и (4) достоверное обнаружение ингибирования образования ОК (окрашивание TRAP) и функции (резорбция, продукция АТФ, реорганизация актинового кольца) ингибиторами. 
В ходе оптимизации методики было выявлено несколько критических моментов. Было замечено, что дифференцировка ОК in vitro в значительной степени зависит от плотности посева моноцитов CD14+. Таким образом, в этом протоколе клетки засеваются с высокой плотностью (1 x 105 ячеек / лунка 96-луночной пластины, в 100 мкл среды), так как важно, чтобы клетки могли взаимодействовать друг с другом и находиться в непосредственной близости к слиянию и превращению в зрелые OC. Точно так же посев клеток при слишком высокой плотности ограничивает их дифференцировку и рост из-за ограничений среды и нехватки необходимого пространства. Кроме того, для достижения максимального успеха с этим протоколом важно тщательно выполнять разделение градиента плотности и следить за тем, чтобы обогащенная популяция клеток CD14+ была как можно более чистой. Например, неадекватные стадии промывки приводят к отсутствию удаления тромбоцитов, что, следовательно, ингибирует дифференцировку ОК47,48. Аналогичным образом, наличие незначительного загрязнения Т-клетками в изолированных препаратах CD14+, стимулированных только M-CSF, может привести к дифференцировке OC, потенциально через секрецию RANKL Т-клетками49. Поэтому важно включать элемент управления M-CSF для каждого эксперимента. Также рекомендуется регулярная проверка чистоты, особенно при использовании нового комплекта для изоляции, чтобы убедиться в чистоте образца.
Оптимальные числа ОК (диапазон: ~200-1,600 ОКс/лунка) достигаются с использованием среды α-MEM, обогащенной нуклеозидами и L-глютамином. Другие традиционные питательные среды, в том числе модифицированная среда орла Дульбекко (DMEM) и среда Мемориального института Розуэлл-Парка (RPMI) 1640, влияют на выход OC. Источник FBS также может влиять на остеокластогенез. Различные партии FBS могут привести к снижению остеокластогенеза, полученного из RANK-L, а также к появлению небольшого количества многоядерных клеток TRAP + в контрольной группе M-CSF (дополнительный рисунок 3). Поэтому для достижения стабильных результатов рекомендуется тестировать новые партии FBS перед использованием и продолжать использовать одну и ту же партию на протяжении всех экспериментов, чтобы свести к минимуму изменения в процессе дифференциации. Кроме того, вариабельность от донора к донору с точки зрения общего количества дифференцированных ОК, полученных в конечный момент времени, представляет собой ограничение при использовании этого протокола для сравнения, например, здоровых доноров с пациентами. В этих случаях обязательно нужно использовать точно такие же условия и одинаковую партию среды, ФБС и других реагентов.
Другим необходимым этапом для оптимальной дифференцировки и созревания ОК является праймирование моноцитов М-КСФ перед добавлением RANKL. Воздействие на клетки M-CSF за 18-24 ч до RANKL подготавливает моноциты к усилению экспрессии RANK15,26. Добавление RANKL в этот момент времени обеспечивает оптимальную дифференцировку ОК дозозависимым образом. Степень дифференциации ОК варьируется от донора к донору; однако 25 нг/мл RANKL обычно достаточно для дифференциации большого числа ОК у большинства доноров. Кроме того, 25 нг/мл RANKL можно использовать в анализах для первоначального скрининга соединений, поскольку он облегчает оценку как усиливающего, так и ингибирующего эффектов тестируемых соединений. В других культуральных системах использовалось более длительное время предварительной инкубации M-CSF до добавления RANKL, но это приводит к более длительному времени культивирования остеокластогенеза50. Кроме того, оставление праймированных моноцитов для инкубации на ночь позволяет им прикрепляться к пластине, хотя и не в полностью адгезивном состоянии. Поэтому, когда RANKL вводится впервые, среда должна быть наполовину изменена очень осторожно, а не полностью изменена, чтобы предотвратить отслоение и потерю праймированных моноцитов. Среду также необходимо обновлять каждые 3-4 дня, чтобы избежать истощения среды и предотвратить гибель клеток. Кроме того, из-за небольшого объема, используемого в этом анализе (100 мкл / лунка в 96-луночном планшете), крайне важно иметь рамку из пустых лунок, заполненных водным раствором (т.е. стерильным дистиллированным H2O или PBS) вокруг пробирных скважин. Это предотвращает испарение среды и краевые эффекты.
Наконец, для метаболических анализов (например, анализов АТФ) крайне важно, чтобы клетки были жизнеспособными, чтобы избежать огромного стандартного отклонения между репликами (рис. 5). Высокая жизнеспособность клеток также важна для сортировки клеток и для дальнейшего культивирования отсортированных ОК (рис. 4). Этот метод, однако, имеет несколько ограничений. Полностью зрелые ОК очень прилипают и их трудно отделить от пластин. Более крупные OC часто невозможно отделить, что может привести к снижению выхода клеток. Поэтому клетки нужно подсчитывать после сортировки и перед нанесением покрытия в необходимой концентрации. Кроме того, в настоящем протоколе неферментативный способ (аккутаза) для отделения ОК используется для предотвращения изменений мембраны при окрашивании поверхности ниже по течению для проточной цитометрии. Использование клеточных скребков (как с мягкими, так и с твердыми окончаниями) также было протестировано и привело к высокой гибели клеток. Ферментативная отслойка с использованием 0,05% растворов трипсина/ЭДТА может быть использована для более высокого выхода отделенных ОК, когда целостность мембраны не требуется для последующих применений. Кроме того, для предотвращения слипания ОК настоятельно рекомендуется использовать высокую концентрацию ЭДТА во всех буферах после отслоения клеток, а также соответствующую фильтрацию перед получением проточной цитометрии. Важно отметить, что культуры ОК представляют собой гетерогенную популяцию клеток, состоящую из зрелых ОК, предшественников ОК и макрофагов. Макрофаги можно легко отличить от ОК, хотя как мононуклеарные пре-ОК, так и многоядерные ОК экспрессируют ОСКАР и не могут быть дифференцированы с помощью настоящего метода (рис. 4). Действительно, этот последний вопрос представляет собой основное ограничение этого метода. Кроме того, низкая экспрессия OSCAR также присутствует в культурах M-CSF (рис. 4B) и может указывать на макрофаги, которые подготовлены к приверженности линии OC. Важно установить затвор для ячеек OSCAR+ на основе сигнала окрашивания FMO, как показано на рисунке 4B.
Таким образом, этот протокол описывает оптимизированный и надежный метод эффективного производства активных и функционально зрелых ОК из циркулирующих первичных моноцитов человека. Сильной стороной этого протокола является его способность генерировать OC за короткий промежуток времени и давать большое количество дифференцированных OC. Этот метод открывает путь к исследованию основных механизмов, лежащих в основе дифференциации и функционирования ОК.

Остеокласты (ОК) представляют собой многоядерные гигантские клетки кроветворного происхождения с уникальной способностью рассасываться в кости. Они отвечают за развитие и непрерывное ремоделирование скелета 1,2. В скелетных фазах развития ОК и тканерезидентные макрофаги происходят из эритро-миелоидных предшественников и колонизируют костную нишу и ткани органов. В физиологических условиях эритро-миелоидные предшественники необходимы для нормального развития кости и прорезывания зубов, в то время как приток циркулирующих моноцитов крови в костную нишу обеспечивает постнатальное поддержание ОК, костной массы и полостикостного мозга 3. При патологических состояниях моноциты рекрутируются к местам активного воспаления и могут способствовать патологической деструкции кости 4,5.
Пациенты с несколькими формами артрита испытывают воспаление суставов, что приводит к прогрессирующему разрушению суставов, вызванному OCs6. Например, при ревматоидном артрите (РА) гиперактивированные ОК ответственны за патологическую эрозию костей и разрушение суставов7,8, а современные методы лечения часто не улучшают и не останавливают повреждение костей9,10,11. Изменения в циркулирующих моноцитах как с точки зрения распределения популяции, так и транскриптомных и эпигенетических сигнатур были зарегистрированы у пациентов с РА12,13,14. Кроме того, сообщалось, что измененные реакции моноцитов на воспалительную стимуляцию влияют на остеокластогенез у пациентов с РА с активным заболеванием15,16,17.
Дифференцировка ОК представляет собой сложный многоступенчатый процесс, включающий приверженность миелоидных клеток-предшественников дифференцировке в предшественники ОК. Во время остеокластогенеза ОК становятся гигантскими и многоядерными в результате слияния клеток с клетками, неполного цитокинеза и процесса ядерной рециркуляции, описанного как деление и слияние18,19,20. Способность дифференцировать ОК in vitro позволила добиться значительного прогресса в понимании биологии костей21. ОК дифференцируются от предшественников при воздействии колониестимулирующего фактора макрофагов (М-КСФ) и рецепторного активатора лиганда ядерного фактора каппа-В (RANKL). Последнее необходимо для нормального развития и функционирования ОК in vitro и in vivo, даже при воспалительных состояниях 6,22,23. RANKL представлен остеобластами и остеоцитами, а также активированными Т-клетками и фибробластами в воспаленной синовиальной оболочкеРА 2,24,25. В процессе дифференцировки ОК моноциты, подвергшиеся воздействию M-CSF, активируют рецептор-активатор экспрессии ядерного фактора каппа-В (RANK) на своей клеточной мембране и при последующей стимуляции RANKL дифференцируются в тартрат-резистентную кислую фосфатазу (TRAP)-положительные мононуклеарные пре-ОК, а затем в многоядерные ОК15,26. ОК продуцируют несколько ферментов, главным из которых является TRAP, который обеспечивает деградацию фосфопротеинов в кости27. Регулятором и маркером дифференцировки ОК является ОК-ассоциированный рецептор (OSCAR). Он активируется на ранней стадии в клетках-предшественниках, связывающихся с линиейOC 28. Зрелые гигантские многоядерные ОК могут разрушать (резорбировать) скелетный матрикс, создавая большую зону герметизации, которая состоит из актинового кольца, окружающего взъерошенную границу21,29,30. Способность ОК к резорбции кости требует реорганизации цитоскелета и, как следствие, поляризации и образования извитой мембраны, которая является так называемой взъерошенной границей. Взъерошенная кайма окружена большой круглой полосой структуры, богатой F-актином, которая является актиновым кольцом или зоной уплотнения. Целостность актинового кольца необходима для резорбции ОК кости как in vitro, так и in vivo, а дефектное образование взъерошенной границы связано с более низкой экспрессией вакуолярной аденозинтрифосфатазы (V-АТФазы)31,32,33. Более того, ОК являются клетками, богатыми митохондриями, а аденозинтрифосфат (АТФ) связывается с митохондриальными структурами в ОК, локализованных на взъерошенной границе31,32,33. Ротенон действует как сильный ингибитор митохондриального комплекса I и влияет на выработку АТФ. Также было показано, что ротенон ингибирует дифференцировку и функциюОК 34.
Этот протокол описывает эффективный и оптимизированный метод остеокластогенеза in vitro из образцов периферической крови человека. В периферической крови человека моноциты CD14+ являются основным источником ОК15,35,36. В этом протоколе кинетика воздействия и концентрации M-CSF и RANKL были скорректированы для оптимального остеокластогенеза. Мононуклеарные клетки сначала отделяются от эритроцитов и гранулоцитов, присутствующих в цельной крови, градиентом плотности; затем они обогащаются моноцитами CD14+ с использованием положительного отбора магнитными шариками. Изолированные моноциты CD14+ затем инкубируют в течение ночи с M-CSF. Это побуждает моноциты повышать экспрессию RANK15,26. Последующее добавление RANKL индуцирует остеокластогенез и многоядерность в зависимости от времени. Активно-резорбирующие ОК показывают характерное распределение F-актиновых колец по краю клеточной мембраны30,32 и окрашивание на TRAP. Зрелые ОК анализируются путем количественного определения многоядерных (более трех ядер) клеток TRAP+. Функциональная способность зрелых ОК может быть оценена по их резорбции, целостности актинового кольца и продукции АТФ. Кроме того, дифференцированные CD14-OSCAR+ OC могут быть обогащены и использованы для оценки влияния определенных соединений на функциональность OC посредством резорбции минералов (или дентина) и организации F-актина. Кроме того, в этой работе известный ингибитор ОК, ротенон, используется в качестве примера соединения, которое влияет на функциональность ОК. Снижение активности резорбции ОК под действием ротенона связано со снижением продукции АТФ и фрагментацией актинового кольца. В заключение, этот протокол устанавливает надежный анализ, который может быть использован в качестве эталонного метода для изучения нескольких биологических аспектов дифференцировки и функции ОК in vitro. 
Эта методология может быть использована для оценки (1) способности циркулирующих моноцитов дифференцироваться в ОК в здоровье и при заболеваниях, а также (2) влияния терапевтических кандидатов на дифференцировку и функцию ОК. Этот надежный протокол остеокластогенеза позволяет определить эффективность и механизмы костно-ориентированной терапии как на дифференцировку ОК из клеток-предшественников, так и на функцию зрелых ОК.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Остеокласты (ОК) - это костно-резорбирующие клетки, которые играют ключевую роль в развитии скелета и ремоделировании костей взрослого человека. Некоторые заболевания костей вызваны повышенной дифференцировкой и активацией ОК, поэтому ингибирование этой патобиологии является ключевым терапевтическим принципом. Два ключевых фактора стимулируют дифференцировку ОК от миелоидных предшественников: колониестимулирующий фактор макрофагов (М-КСФ) и рецепторный активатор лиганда ядерного фактора каппа-В (RANKL). Давно известно, что циркулирующие человеческие моноциты CD14+ дифференцируются в ОК in vitro. Однако время воздействия и концентрация RANKL влияют на эффективность дифференцировки. Действительно, были описаны протоколы для генерации человеческих ОК in vitro , но они часто приводят к плохому и длительному процессу дифференцировки. Здесь представлен надежный и стандартизированный протокол для своевременной генерации функционально активных ОК зрелого человека. Моноциты CD14+ обогащены мононуклеарными клетками периферической крови человека (PBMC) и заправлены M-CSF для повышения регуляции RANK. Последующее воздействие RANKL генерирует ОК в зависимости от дозы и времени. ОК идентифицируются и количественно оцениваются путем окрашивания тартратной кислотоустойчивой фосфатазой (TRAP) и анализа световой микроскопии. Иммунофлюоресцентное окрашивание ядер и F-актина используется для идентификации функционально активных ОК. Кроме того, зрелые ОК OSCAR+CD14− дополнительно обогащаются с помощью проточной цитометрической сортировки клеток, а функциональность ОК количественно определяется анализами резорбции минералов (или дентина/кости) и образованием актиновых колец. Наконец, известный ингибитор ОК, ротенон, используется на зрелых ОК, демонстрируя, что производство аденозинтрифосфата (АТФ) необходимо для целостности актинового кольца и функции ОК. В заключение, в этой работе установлен надежный анализ для дифференцировки большого количества ОК, который в сочетании с окрашиванием актинового кольца и анализом АТФ обеспечивает полезную модель in vitro для оценки функции ОК и скрининга новых терапевтических соединений, которые могут модулировать процесс дифференцировки.

Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Остеокласты являются ключевыми костно-резорбирующими клетками в организме. Этот протокол описывает надежный метод дифференцировки остеокластов in vitro из моноцитов периферической крови человека. Этот метод может быть использован в качестве важного инструмента для дальнейшего понимания биологии остеокластов в гомеостазе и при болезнях.

Дифференциация функциональных остеокластов из CD14+ моноцитов периферической крови человека

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0. Наш протокол описывает оптимизированный и воспроизводимый метод получения остеокластов in vitro, который может быть использован для исследования механизмов, лежащих в основе процесса их дифференцировки и функциональности. Основным преимуществом этого метода является способность генерировать большое количество функционально активных остеокластов всего за неделю. Высокий выход дифференцировки достигается за счет использования очищенных моноцитов и своевременного добавления цитокинов.Остеокласты ответственны за разрушение костей при всех формах артрита, и этот метод предоставляет инструменты для скрининга новых терапевтических соединений, которые могут модулировать их дифференцировку и / или функции. Продемонстрирует процедуру Патрисия Ридлова, аспирант нашей лаборатории. Для начала изолируйте PBMC, перелив кровь в новую 50-миллилитровую пробирку.Разбавьте его стерильным PBS в равном объеме для свежей крови или в соотношении 1:3 для лейкоцитарных шишек и охристой шерсти. Аккуратно перемешайте кровь путем инверсии. Подготовьте 15-миллилитровые пробирки, содержащие три миллилитра среды градиента плотности, и медленно нанесите от восьми до 10 миллилитров разбавленной крови поверх среды градиента плотности, избегая смешивания.Центрифугируйте пробирку при 400 x g в течение 30 минут при комнатной температуре без тормозов. Затем аккуратно сбросьте верхний слой с помощью пастеровской пипетки. Соберите нижний межфазный слой, содержащий PBMC, и перенесите этот слой в новую 50-миллилитровую пробирку.Суспендировать клетки до 50 миллилитров стерильным PBS и смыть остаточную среду градиента плотности центрифугированием при 300 x g в течение 10 минут при комнатной температуре с полным тормозом. Чтобы удалить остаточные тромбоциты, повторите процесс центрифугирования, как описано в рукописи, ресуспендируйте выделенные и очищенные PBMC в 20 миллилитрах PBS и подсчитайте их с помощью гемацитометра в соответствии со стандартным методом. Чтобы обогатить CD14 + моноциты, перенесите 1 x 10 в седьмой PBMC в подходящую полистирольную пробирку с круглым дном и гранулируйте клетки в 300 x g в течение пяти минут.После удаления надосадочной жидкости и ресуспендирования клеточной гранулы в буфере для разделения клеток инкубируйте клетки с 10 микролитрами коктейля антител на 100 микролитров с закрытой крышкой в течение 10 минут. В конце инкубации добавьте 10 микролитров шариков магнитных наночастиц на 100 микролитров и выдерживайте в течение трех минут под крышкой. Дополните объем до 2,5 миллилитров буфером для разделения ячеек.Поместите трубку в магнит и выдерживайте в течение трех минут со снятой крышкой. Теперь отбросьте популяцию отрицательных клеток одним непрерывным движением путем инверсии, пока трубка все еще находится в магните. Снимите трубку с магнита, промойте обогащенные CD14 + моноциты, прикрепленные к магнитным шарикам, ресуспендировав их в 2,5 миллилитрах буфера клеточной суспензии, и поместите трубку обратно в магнит.Подсчитайте изолированные клетки, как показано ранее. Центрифугируйте собранные клетки при 300 х г в течение пяти минут. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте клетки в концентрации 1 миллион клеток на миллилитр в полной альфа-минимальной незаменимой среде с 10% FBS.Чтобы дифференцировать остеокласт, добавьте M-CSF в конечной концентрации 25 нанограммов на миллилитр в клеточную суспензию и тщательно перемешайте путем пипетки для гомогенизации клеточной суспензии. Пластина 100 микролитров суспензии на лунку в плоскодонной 96-луночной пластине. Затем добавьте 200 микролитров стерильной дистиллированной воды в каждую лунку вокруг покрытых клетками, чтобы предотвратить испарение среды и краевые эффекты в системе культивирования.Инкубируйте клетки в течение ночи примерно от 18 до 20 часов при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Приготовьте свежий носитель с добавлением M-CSF и лиганда RANK. После инкубации осторожно удалите половину среды путем аспирации с помощью пипетки P200 и замените ее свежей теплой полной средой с добавлением лиганда M-CSF и RANK в конечной концентрации 25 нанограмм на миллилитр.Дифференцируют клетки в остеокласты в течение семи-14 дней с полной заменой среды каждые три дня. После удаления среды зафиксируйте дифференцированные прилипшие остеокласты 100 микролитрами на лунку приготовленного фиксирующего раствора и выдержите в течение одной минуты. Не прикасайтесь ко дну лунок, чтобы не поцарапать прилипшие ячейки.После того, как лунки будут промыты три раза 300 микролитрами стерильной дистиллированной воды, высушите пластины и добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежеприготовленного окрашивающего раствора. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия в темноте в течение 20 минут. После инкубации удалите окрашивающий раствор путем инверсии и трижды промойте тарелку дистиллированной водой в количестве 300 микролитров на лунку.Удалите лишнюю воду, постукивая тарелками по бумажным полотенцам, и оставьте тарелки открытыми и защищенными от света, чтобы они высохли на воздухе на ночь. Используя светлопольный микроскоп с опцией плитки, сделайте снимки с 10-кратным или 20-кратным увеличением, чтобы захватить всю поверхность лунки. Вручную подсчитайте остеокласты, идентифицированные как окрашенные в TRAP + фиолетовый цвет клетки с более чем тремя ядрами, с помощью программного обеспечения для анализа изображений с плагином счетчика клеток.Планшет 100 микролитров изолированных CD14 + моноцитов на лунку в 18-луночной камере с плотностью клеток 1 x 10 до пятой клетки на лунку. Дифференцируйте остеокласты в присутствии лиганда M-CSF и RANK, как было показано ранее, с полной сменой среды каждые три дня. В конце времени аккуратно удалите среду и дважды промойте каждую скважину 200 микролитрами предварительно подогретого PBS при pH 7,4.Не допускайте высыхания лунок между ступенями. Зафиксируйте образец 100 микролитрами на лунку 4%-ного раствора формальдегида в PBS и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере с легким встряхиванием. После инкубации дважды промойте клетки 200 микролитрами PBS на лунку.Пермеабилизируют клетки 100 микролитрами на лунку 0,1% раствора Triton x-100, разбавленного в PBS, и инкубируют в течение 10 минут, как показано ранее. Дважды промойте PBS по 200 микролитров на лунку. Чтобы блокировать неспецифическое связывание и увеличить сигнал, добавьте 100 микролитров блокирующего раствора, приготовленного из 2% бычьего сывороточного альбумина и раствора PBS.Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере с легким встряхиванием. После удаления блокирующего раствора добавьте в каждую лунку 100 микролитров флуоресцентно конъюгированного раствора фаллоидина, разведенного в 2%-ном растворе BSA/PBS. Дважды промойте PBS по 200 микролитров на лунку.Окрашивают ядра раствором PBS, содержащим 300 наномолярных DAPI, по 100 микролитров на лунку. Через 10–15 минут удалите раствор DAPI и замените его PBS со скоростью 100 микролитров на лунку. Визуализируйте окрашивание с помощью соответствующих иммунофлуоресцентных или конфокальных микроскопов в диапазоне от четырех до 40 раз.Зрелые остеокласты определяются как TRAP + множественные ядерные клетки. Добавление лиганда RANK приводило к увеличению количества больших многоядерных остеокластов TRAP + дозозависимым образом. Кинетику дифференцировки остеокластов из моноцитов исследовали в течение периода культивирования от двух до 14 дней.Многоядерные остеокласты были видны с пятого дня, а оптимальная дифференцировка была достигнута на седьмой день. Дифференциация остеокластов на минерализованные поверхности позволяет оценить их резорбционную активность путем анализа образования круглых отверстий, или резорбционных ям. Процент резорбции значительно увеличивается в присутствии М-КСФ и лиганда RANK по сравнению с одним М-КСФ.Кроме того, обработка ротеноном дозозависимо ингибировала резорбцию минерализованной поверхности по сравнению с необработанной контрольной скважиной. Ротенон-зависимое ингибирование резорбции остеокластов ассоциировалось с ингибированием продукции АТФ. Фрагментация актинового кольца, полученного из лиганда RANK, зрелого OCS наблюдалась в присутствии ротенона.Важно убедиться, что обогащенные моноциты не содержат тромбоцитов, что клетки покрыты с нужной плотностью, а окружающие лунки заполнены водой, чтобы избежать краевого эффекта. Этот протокол особенно полезен для механистического исследования того, как образуются остеокласты и что влияет на их функциональность как в фундаментальной, так и в трансляционной науке. Например, с помощью соединений или белков, которые могут модулировать эти процессы.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Расширение, очистки и функциональной оценки периферической крови человека клетки NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Расширение периферической крови человека γδ T клеток с использованием Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Количественные Визуализация Lineage конкретных Toll-подобный рецептор-опосредованной сигнализации в моноцитах и ​​дендритных клеток из малых образцов крови человека

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Обнаружение гликогена в мононуклеарных клеток периферической крови с йодной кислотой Шиффа окрашивания

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Генерация человека Аллоантиген-специфических Т-клеток из периферической крови

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

Изоляция, дифференцировку и Количественная человеческого антитела секретирующие В-клетки из крови: Elispot в качестве функционального считывания показаний гуморального иммунитета

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Декстран повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человеческие клетки первичной

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Мегакариоцитов дифференциации и образование тромбоцитов от человека пуповинной крови производные CD34 клетки+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Оценка синаптических интерфейса первичного человека Т-клеток в периферической крови и лимфоидной ткани

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Изоляция, Трансфекция и культура первичных человеческих моноцитов

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...