Name: differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes
Uploaded: 2023-01-27T13:15:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes at JoVE.com

Los autores agradecen a Flow Core Facility y Glasgow Imaging Facility (GIF) dentro de la Escuela de Infección e Inmunidad por su apoyo y asistencia en este trabajo.

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

El cultivo fácil y el aislamiento de un gran número de AO funcionales in vitro son importantes para avanzar en la comprensión de la biología ósea y las enfermedades mediadas por AO. Clásicamente, los AO se generaron en cocultivos con osteoblastos o células estromales y células hematopoyéticas del bazo o la médula ósea38,39. Un avance significativo en la comprensión de la osteoclastogénesis fue la identificación de RANKL como el principal regulador de la formación, diferenciación y supervivencia de AO40. Los primeros protocolos de los sistemas de cultivo dependientes de RANKL utilizaron PBMC para la generación de CO21,41,42. Sin embargo, estos cultivos mixtos son largos y presentan muchos factores de confusión que limitan la capacidad de probar los efectos directos sobre la diferenciación y función de AO. Este protocolo describe un modelo in vitro eficiente y fiable de osteoclastogénesis a partir de monocitos CD14+ periféricos humanos en el que se puede obtener una osteoclastogénesis óptima en 7 días (Figura 1 y Figura 2), que es considerablemente más rápida en comparación con otros protocolos43,44,45,46. Las principales características distintivas de este protocolo son (1) el uso de monocitos CD14+ purificados, (2) el cebado de los monocitos con M-CSF antes de la exposición a RANKL, (3) la duración del cultivo (<7 días) y (4) la detección fiable de la inhibición de la formación de CO (tinción TRAP) y la función (reabsorción, producción de ATP, reorganización del anillo de actina) con inhibidores. 
Durante la optimización de la metodología, se identificaron varios puntos críticos. Se ha observado que la diferenciación in vitro de los AO depende en gran medida de la densidad de siembra de los monocitos CD14+. Así, en este protocolo, las células se siembran a una alta densidad (1 x 105 células/pocillo de una placa de 96 pocillos, en 100 μL de medio), ya que es esencial que las células puedan interactuar entre sí y estar cerca de fusionarse y convertirse en AOs maduros. Del mismo modo, la siembra de células a una densidad demasiado alta limita su diferenciación y crecimiento debido a las limitaciones del medio y la falta del espacio requerido. Además, para lograr el máximo éxito con este protocolo, es importante realizar la separación del gradiente de densidad cuidadosamente y garantizar que la población enriquecida de células CD14 + sea lo más pura posible. Por ejemplo, pasos de lavado inadecuados resultan en una falta de eliminación de plaquetas, lo que consecuentemente inhibe la diferenciación de AO47,48. Del mismo modo, la presencia de contaminación menor de células T en preparaciones aisladas de CD14+ estimuladas con M-CSF solo puede resultar en la diferenciación de OC, potencialmente a través de la secreción de RANKL por las células T49. Por lo tanto, es importante incluir un control M-CSF para cada experimento. También se recomienda un control de pureza de rutina, especialmente cuando se utiliza un nuevo kit de aislamiento, para garantizar la pureza de la muestra.
Los números óptimos de OC (rango: ~ 200-1,600 OC / pocillo) se logran utilizando α-MEM medio enriquecido con nucleósidos y L-glutamina. Otros medios de cultivo convencionales, incluyendo el medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) y el medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, afectan el rendimiento de OC. La fuente de FBS también puede influir en la osteoclastogénesis. Diferentes lotes de FBS pueden conducir a una reducción de la osteoclastogénesis derivada de RANK-L, así como a la aparición de un bajo número de células multinucleadas TRAP+ en los controles de M-CSF (Figura complementaria 3). Por lo tanto, para lograr resultados consistentes, se recomienda probar nuevos lotes de FBS antes de su uso y continuar con el mismo lote durante los experimentos para minimizar las variaciones en el proceso de diferenciación. Además, la variabilidad de donante a donante, en términos del número total de AO diferenciados obtenidos en el punto de tiempo final, constituye una limitación cuando se utiliza este protocolo para comparar, por ejemplo, donantes sanos con pacientes. En estos casos, es imperativo utilizar exactamente las mismas condiciones y el mismo lote de medios, FBS y otros reactivos.
Otro paso necesario para una diferenciación y maduración óptimas de OC es preparar los monocitos con M-CSF antes de la adición de RANKL. La exposición de las células a M-CSF 18-24 h antes de RANKL prepara los monocitos para regular al alza la expresión de RANK 15,26. La adición de RANKL en este punto de tiempo garantiza una diferenciación óptima de AO de una manera dependiente de la dosis. El grado de diferenciación de la CO varía de un donante a otro; sin embargo, 25 ng/ml de RANKL suele ser suficiente para diferenciar un alto número de AO en la mayoría de los donantes. Además, se pueden utilizar 25 ng/ml de RANKL en ensayos para el cribado inicial de compuestos, ya que facilita la evaluación de los efectos potenciadores e inhibitorios de los compuestos de ensayo. Otros sistemas de cultivo han utilizado tiempos de preincubación de M-CSF más largos antes de la adición de RANKL, pero esto resulta en un tiempo de cultivo más largo para la osteoclastogénesis50. Además, dejar que los monocitos cebados se incuben durante la noche les permite adherirse a la placa, aunque no en un estado completamente adherente. Por lo tanto, cuando se introduce RANKL por primera vez, el medio debe cambiarse a medias con mucho cuidado en lugar de cambiarse completamente para evitar el desprendimiento y la pérdida de los monocitos cebados. El medio también debe actualizarse cada 3-4 días para evitar el agotamiento del medio y prevenir la muerte celular. Además, debido al bajo volumen utilizado en este ensayo (100 μL/pocillo en una placa de 96 pocillos), es de suma importancia tener un marco de pocillos vacíos que se llenen con una solución acuosa (es decir,H2Odestilado estéril o PBS) alrededor de los pocillos de ensayo. Esto evita la evaporación media y los efectos de borde.
Finalmente, para los ensayos metabólicos (por ejemplo, ensayos de ATP), es imperativo que las células sean viables para evitar una gran desviación estándar entre las réplicas (Figura 5). La alta viabilidad de las células también es importante para clasificar las células y para el cultivo posterior de los AO ordenados (Figura 4). Este método, sin embargo, tiene varias limitaciones. Los AO completamente maduros son muy adherentes y difíciles de separar de las placas. Los AO más grandes a menudo son imposibles de separar, lo que puede conducir a un menor rendimiento celular. Por lo tanto, las células deben contarse después de la clasificación y antes del recubrimiento a la concentración requerida. Además, en el presente protocolo, se utiliza un método no enzimático (accutasa) para separar los AO para prevenir alteraciones de la membrana en la tinción superficial aguas abajo para la citometría de flujo. El uso de raspadores celulares (ambos con terminaciones blandas o duras) también se probó y condujo a una alta muerte celular. El desprendimiento enzimático utilizando soluciones de tripsina/EDTA al 0,05% se puede utilizar para un mayor rendimiento de OC desprendidos cuando no se requiere integridad de membrana para aplicaciones posteriores. Además, para evitar que los AO se agrupen, se recomienda encarecidamente el uso de una alta concentración de EDTA en todos los tampones después del desprendimiento celular, así como el filtrado adecuado antes de la adquisición de citometría de flujo. Es importante tener en cuenta que los cultivos de AO son una población heterogénea de células que consiste en AO maduros, precursores de AO y macrófagos. Los macrófagos pueden distinguirse fácilmente de los AO, aunque tanto los pre-OC mononucleares como los OC multinucleares expresan OSCAR y no pueden distinguirse con el método actual (Figura 4). De hecho, esta última cuestión constituye la principal limitación de este método. Además, una baja expresión de OSCAR también está presente en cultivos de M-CSF (Figura 4B) y podría indicar macrófagos que están preparados para el compromiso del linaje de AO. Es importante establecer la puerta para las celdas OSCAR+ en función de la señal de tinción FMO, como se muestra en la Figura 4B.
En resumen, este protocolo describe un método optimizado y robusto para la producción eficiente de AO activos y funcionalmente maduros a partir de monocitos humanos primarios circulantes. La fortaleza de este protocolo es su capacidad para generar AO en un corto período de tiempo y producir un alto número de AO diferenciados. Este método abre el camino para investigar los mecanismos básicos que subyacen a la diferenciación y función de la AO.

Los osteoclastos (AO) son células gigantes multinucleadas de linaje hematopoyético con una capacidad única para reabsorber hueso. Son responsables del desarrollo y remodelación continua del esqueleto 1,2. En las fases esqueléticas del desarrollo, los AO y los macrófagos residentes en el tejido se derivan de progenitores eritromieloides y colonizan el nicho óseo y los tejidos de los órganos. En condiciones fisiológicas, los progenitores eritromieloides son necesarios para el desarrollo óseo normal y la erupción dental, mientras que la afluencia de monocitos sanguíneos circulantes en el nicho óseo proporciona el mantenimiento postnatal de los AO, la masa ósea y la cavidad de la médula ósea3. En condiciones patológicas, los monocitos son reclutados en sitios de inflamación activa y pueden contribuir a la destrucción ósea patológica 4,5.
Los pacientes con varias formas de artritis experimentan inflamación articular, lo que lleva a la destrucción progresiva de las articulaciones causada por los AO6. Por ejemplo, en la artritis reumatoide (AR), los AO sobreactivados son responsables de la erosión ósea patológica y la destrucción articular 7,8, y los tratamientos actuales a menudo no mejoran ni detienen el daño óseo9,10,11. Se han descrito alteraciones en los monocitos circulantes tanto en términos de distribución poblacional como de firmas transcriptómicas y epigenéticas en pacientes con AR12,13,14. Además, se ha descrito que las respuestas alteradas de los monocitos a la estimulación inflamatoria afectan la osteoclastogénesis en pacientes con AR con enfermedad activa15,16,17.
La diferenciación de los AO es un proceso complejo de varios pasos que comprende el compromiso de las células precursoras mieloides con la diferenciación en precursores de AO. Durante la osteoclastogénesis, los AO se vuelven gigantes y multinucleados a través de la fusión célula-célula, citocinesis incompleta y un proceso de reciclaje nuclear descrito como fisión y fusión18,19,20. La capacidad de diferenciar los AO in vitro ha permitido avances significativos en la comprensión de la biología ósea21. Los AO se diferencian de los precursores tras la exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y al activador del receptor del ligando del factor nuclear kappa-B (RANKL). Este último es esencial para el desarrollo y la función normal de los AO in vitro e in vivo, incluso en condiciones inflamatorias 6,22,23. RANKL es presentado por osteoblastos y osteocitos, así como por células T activadas y fibroblastos en la membrana sinovial de la AR inflamada 2,24,25. Durante el proceso de diferenciación de AO, los monocitos expuestos a M-CSF regulan al alza el activador del receptor de la expresión del factor nuclear kappa-B (RANK) en su membrana celular y, bajo estimulación posterior con RANKL, se diferencian en pre-OC mononucleares positivos para fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y luego en OC multinucleados15,26. Los AO producen varias enzimas, la principal de ellas es TRAP, que permite la degradación de fosfoproteínas dentro del hueso27. Un regulador y marcador de diferenciación de OC es el receptor asociado a OC (OSCAR). Se regula al alza temprano en las células precursoras que se comprometen con el linaje OC28. Los OC multinucleados gigantes maduros pueden degradar (reabsorber) la matriz esquelética generando una gran zona de sellado, que está hecha de un anillo de actina que rodea un borde erizado21,29,30. La capacidad de resorción ósea de los AO requiere la reorganización del citoesqueleto y la consiguiente polarización y formación de una membrana enrevesada, que es el llamado borde erizado. El borde erizado está rodeado por una gran banda circular de una estructura rica en actina F, que es el anillo de actina o zona de sellado. La integridad del anillo de actina es esencial para que los AO reabsorban el hueso tanto in vitro como in vivo, y la formación defectuosa del borde erizado se asocia con la expresión de adenosina trifosfatasa vacuolar inferior (V-ATPasa)31,32,33. Además, los AO son células ricas en mitocondrias, y el trifosfato de adenosina (ATP) se asocia con estructuras similares a las mitocondrias en los AO localizados en el borde erizado31,32,33. La rotenona actúa como un fuerte inhibidor del complejo mitocondrial I e impacta la producción de ATP. También se ha demostrado que la rotenona inhibe la diferenciación y función de la AO34.
Este protocolo describe un método eficiente y optimizado de osteoclastogénesis in vitro a partir de muestras de sangre periférica humana. En la sangre periférica humana, los monocitos CD14+ son la principal fuente de AO15,35,36. En este protocolo, la cinética de exposición y las concentraciones de M-CSF y RANKL se han ajustado para una osteoclastogénesis óptima. Las células mononucleares se separan primero de los eritrocitos y granulocitos presentes en la sangre total por gradiente de densidad; luego se enriquecen para monocitos CD14 + utilizando selección positiva por perlas magnéticas. Los monocitos CD14+ aislados se incuban durante la noche con M-CSF. Esto prepara a los monocitos para regular al alza la expresión de RANK15,26. La adición posterior de RANKL induce osteoclastogénesis y multinucleación de una manera dependiente del tiempo. Los AO de reabsorción activa muestran la distribución característica de los anillos de actina F en el borde de la membrana celular30,32 y la tinción para TRAP. Los AO maduros se analizan cuantificando células multinucleadas TRAP+ (más de tres núcleos). La capacidad funcional de los AO maduros puede evaluarse por su reabsorción, integridad del anillo de actina y producción de ATP. Además, los OC CD14− OSCAR+ diferenciados pueden enriquecerse y utilizarse para evaluar los efectos de ciertos compuestos sobre la funcionalidad de OC a través de la reabsorción mineral (o dentina) y la organización de la actina F. Además, en este trabajo, un conocido inhibidor de OC, rotenona, se utiliza como ejemplo de un compuesto que afecta la funcionalidad de los AO. La reducción de la actividad de reabsorción de OC bajo rotenona se asocia con una reducción de la producción de ATP y la fragmentación del anillo de actina. En conclusión, este protocolo establece un ensayo robusto que puede ser utilizado como método de referencia para estudiar varios aspectos biológicos de la diferenciación y función de OC in vitro. 
Esta metodología se puede utilizar para evaluar (1) el potencial de los monocitos circulantes para diferenciarse en AO en salud y enfermedades, así como (2) el impacto de los candidatos terapéuticos en la diferenciación y función de AO. Este robusto protocolo de osteoclastogénesis permite determinar la eficacia y los mecanismos de las terapias dirigidas al hueso tanto en la diferenciación de AO a partir de células precursoras como en la función de los AO maduros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 18 well chamber slides</td>
			<td>ibidi</td>
			<td>81816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-well glass chamber slides&#160;</td>
			<td>Ibidi&#160;</td>
			<td>80807&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well TC plate&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3596&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well osteo assay stripwell plate&#160;&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3989&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>386-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone&#160;</td>
			<td>VWR&#160;</td>
			<td>20066.330&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid phosphatase, Leukocyte (TRAP) kit&#160;</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH&#160;</td>
			<td>387A-1KT&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>A12379&#160;</td>
			<td>AF488&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher - Invitrogen</td>
			<td>A22287</td>
			<td>AF647</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alfa Aesar 2-Deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>11321867&#160;</td>
			<td>2DG, 98%&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha minimum essential medium&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>22571-020&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATPlite 1step&#160;</td>
			<td>PerkinElmer&#160;</td>
			<td>6016731&#160;</td>
			<td>Luminiscence ATP detection assay system&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III cell sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>A9418-100G&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture microplate, 96-well, PS, F-bottom&#160;</td>
			<td>Greiner bio-one&#160;</td>
			<td>655083&#160;</td>
			<td>White-bottom plates&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-5</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 6ml round-bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay surface multiple well plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>CLS3989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwell</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3989-2EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Theremo Fisher &#160;</td>
			<td>D3571&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human CD14 positive selection kit&#160;</td>
			<td>STEMCELL Technologies&#160;</td>
			<td>17858&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep red blood cell lysis buffer (10x)</td>
			<td>StemCell Technologies&#160;</td>
			<td>20110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFluor 780</td>
			<td>Theremo Fisher - Invitrogen&#160;</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>E7889-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL auto imaging system</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A32678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon round-bottom polypropylene test tubes with cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10314791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>430790&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes 50 mL&#160;</td>
			<td>Corning&#160;&#160;</td>
			<td>430828&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC base solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-2</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>10500-064&#160;</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus&#160;</td>
			<td>cytiva&#160;</td>
			<td>17144003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>F-8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human sRANK ligand&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>310-01-100UG&#160;</td>
			<td>Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand&#160;(RANKL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ Image analysis software</td>
			<td>Image J</td>
			<td>version 2.9.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>25030-024&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium heparin tubes (9 mL)&#160;</td>
			<td>VACUETTE&#160;</td>
			<td>455084&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophage colony-stimulating factor&#160;</td>
			<td>PEPROTECH&#160;</td>
			<td>300-25-100UG&#160;</td>
			<td>&#160;M-CSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Napthol AS-BI phosphoric acid solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-1</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemacytometer counting chamber&#160;</td>
			<td>Camlab</td>
			<td>SKU 1127885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligomycin from Streptomyces Diastatochromogenes&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Q4876-5MG&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OSCAR Antibody, anti-human, Vio Bright FITC, REAfinit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-107-661 and 130-107-617</td>
			<td>Clone REA494</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine7 anti-human CD14 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>325618</td>
			<td>Clone HCD14&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/streptomycin&#160;</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>P0781&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHERAstar machine and software</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (DPBS, 1x)&#160;</td>
			<td>gibco&#160;</td>
			<td>14190-094&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REA control antibody (S), human IgG1, Vio Bright FITC, REAfinity</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-113-443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>425044-1L&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium nitrite solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>91-4</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>387-3</td>
			<td>from kit Cat No. 387A-1KT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>9002-93-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>T8154-100ML&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood cd14+ monocytes

Los osteoclastos (AO) son células de reabsorción ósea que desempeñan un papel fundamental en el desarrollo esquelético y la remodelación ósea adulta. Varios trastornos óseos son causados por una mayor diferenciación y activación de los AO, por lo que la inhibición de esta patobiología es un principio terapéutico clave. Dos factores clave impulsan la diferenciación de los AO de los precursores mieloides: el factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y el activador del receptor del ligando del factor nuclear kappa-B (RANKL). Se sabe desde hace tiempo que los monocitos CD14+ circulantes humanos se diferencian en AO in vitro. Sin embargo, el tiempo de exposición y la concentración de RANKL influyen en la eficiencia de diferenciación. De hecho, se han descrito protocolos para la generación de AO humanos in vitro , pero a menudo resultan en un proceso de diferenciación pobre y prolongado. En este documento, se proporciona un protocolo robusto y estandarizado para generar AO humanos maduros funcionalmente activos de manera oportuna. Los monocitos CD14+ están enriquecidos a partir de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) y preparados con M-CSF para regular al alza el RANK. La exposición posterior a RANKL genera AO de una manera dependiente de la dosis y el tiempo. Los AO se identifican y cuantifican mediante tinción con fosfatasa resistente al ácido tartrato (TRAP) y análisis de microscopía óptica. La tinción por inmunofluorescencia de núcleos y actina F se utiliza para identificar AO funcionalmente activos. Además, los AO maduros OSCAR+CD14− se enriquecen aún más mediante la clasificación celular por citometría de flujo y la funcionalidad de OC cuantificada mediante ensayos de reabsorción mineral (o dentina/hueso) y formación de anillos de actina. Finalmente, un inhibidor conocido de OC, rotenona, se usa en AO maduros, lo que demuestra que la producción de trifosfato de adenosina (ATP) es esencial para la integridad del anillo de actina y la función de OC. En conclusión, en este trabajo se establece un ensayo robusto para diferenciar un alto número de AO, que en combinación con la tinción con anillo de actina y un ensayo de ATP proporciona un modelo in vitro útil para evaluar la función de OC y detectar nuevos compuestos terapéuticos que pueden modular el proceso de diferenciación.

Generación de OC a partir de monocitos CD14+ Este método tenía como objetivo diferenciar fácilmente un gran número de AO de los monocitos CD14+ de sangre periférica humana in vitro, generalmente en 1 semana. En primer lugar, los monocitos CD14 + se enriquecieron a partir de PBMC y se prepararon con M-CSF durante la noche para regular al alza el RANK, como se informó anteriormente15. Después del cebado de monocitos, para determinar la concentración óptima de RANKL para la diferenciación y maduración de OC, se utilizaron concentraciones de RANKL de 1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml y 100 ng / ml, junto con 25 ng / mL M-CSF. La adición de RANKL produjo un número creciente de grandes AO multinucleados positivos para TRAP de una manera dependiente de la dosis, y esto se evaluó mediante tinción TRAP. Los AO maduros se definen como células TRAP-positivas con múltiples núcleos (típicamente más de tres; Figura 2A, B y Figura complementaria 1). Además, la cinética de la diferenciación de OC de monocitos se investigó mediante tinción TRAP y microscopía óptica durante un período de cultivo de 2-14 días. En este caso, se eligió la diferenciación de OC utilizando una concentración intermedia de 50 ng/ml RANKL para evaluar qué tan rápido se diferenciaron los AO en cultivo. En estas condiciones de cultivo, los AO multinucleados fueron visibles desde el día 5 en adelante, y la diferenciación óptima se alcanzó el día 7 (Figura 2C). La incubación prolongada de cultivos más allá de 10 días en plásticos dio como resultado células fusionadas anormalmente gigantes. En este protocolo, los días 6-8 se utilizan generalmente como el punto final óptimo de la generación de AO. Los AO pueden cuantificarse o utilizarse para ensayos posteriores.
Evaluación funcional de los AO diferenciados Para determinar la actividad funcional de los AO generados, examinamos su actividad resortiva diferenciando los OC en una superficie mineralizada. Como los AO grandes solo se generan después de un período de cultivo de 7 días, y para permitir el tiempo suficiente para reabsorber el sustrato mineral, los cultivos se mantuvieron hasta el día 10. La formación de agujeros redondos, o pozos de reabsorción, se observó solo en las superficies mineralizadas de pozos que contenían células que habían sido tratadas con M-CSF y RANKL (Figura 3). Por lo tanto, el porcentaje de superficie mineralizada disuelta (pozos de reabsorción) permite determinar la capacidad de reabsorción de OC. Además, los AO diferenciados siguiendo este protocolo hasta el día 7, tanto en portaobjetos de cámara de plástico como de vidrio, mostraron una estructura de anillo de actina bien organizada que podía visualizarse mediante tinción inmunofluorescente (Figura complementaria 2).
Efecto de un inhibidor sobre la función madura de OC Las condiciones de cultivo mencionadas anteriormente se utilizaron para determinar la capacidad funcional de los AO generados in vitro en presencia del inhibidor conocido de AO, rotenona34. Los AO se diferenciaron durante 6-8 días, y los AO CD14-OSCAR+ y los precursores de AO se enriquecieron mediante citometría de flujo (Figura 4). Las células enriquecidas se colocaron a 50,000 células / por pocillo en una placa de 96 pocillos recubierta de minerales en medio pro-osteoclastogénico (25 ng / mL M-CSF y RANKL) durante 3 días. El tratamiento con rotenona (Figura 5A,B) inhibió dosis-dependiente de la reabsorción de la superficie mineralizada en comparación con el pozo control no tratado, consistente con estudios previos34. Además, la funcionalidad de OC se evaluó a través de la producción de ATP y la formación de anillos de actina. La inhibición dependiente de rotenona de la reabsorción de OC se asoció con la inhibición de la producción de ATP (Figura 5C). Los AO reabsorbentes son células altamente polarizadas que regulan su capacidad de absorción promoviendo la organización citoesquelética. La faloidina conjugada Alexa fluor 647 se utilizó para marcar el citoesqueleto de actina F de los AO maduros cultivados en presencia o ausencia de rotenona. La rotenona causó la fragmentación del anillo de actina derivado de RANKL de los AO maduros (Figura 5D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig02.jpg"> Figura 2: AO diferenciando eficientemente de los precursores de monocitos CD14+ . Los monocitos CD14+ se enriquecieron magnéticamente, se colocaron en 1 x 105 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche con 25 ng/mL M-CSF. (A) Los monocitos preparados para M-CSF fueron estimulados con concentraciones crecientes de RANKL (1 ng/mL, 25 ng/mL, 50 ng/mL y 100 ng/mL), fijados y teñidos para TRAP el día 7. Se adquirieron imágenes y se contaron las células multinucleadas (MNC) TRAP+ . En la Figura suplementaria 1 se muestran imágenes representativas de la tinción TRAP. Las barras de error muestran la media ± SD (n = 3). Los datos se analizaron con un ANOVA unidireccional y la prueba de comparaciones múltiples de Holm-Sidak para datos pareados; * P ≤ 0,05 y ** P ≤ 0,005. (B) Imagen representativa de un pocillo teñido con TRAP de una placa de 96 pocillos que muestra la cantidad típica de AO/pocillo esperado y su morfología por debajo de 25 ng/ml de RANK-L en comparación con los macrófagos derivados de M-CSF en el día 7. Barras de escala: 1000 μm. (C) Imágenes representativas de la formación de CO por debajo de 50 ng/ml RANKL evaluadas mediante tinción TRAP desde el día 2 hasta el día 14. Los AO son visibles desde el día 5 en adelante. Los AO gigantes anormalmente fusionados están presentes después de 10 días. Barras de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig03.jpg"> Figura 3: AO resorpresivos diferenciados de los monocitos CD14+ . Las células CD14+ aisladas de PBMC se diferenciaron durante 10 días en AO en presencia de 25 ng/mL M-CSF (M) y RANKL (R) en placas de superficie de ensayo mineral (osteoensayo). (A) Imágenes de pozos reconstruidos representativos tomadas con un aumento de 10x para analizar la reabsorción en el día 10 (sustrato mineral en gris; pozos de reabsorción en blanco). Barras de escala: 1000 μm. (B) Cuantificación del porcentaje de área reabsorbida. Los datos de reabsorción se analizaron con un análisis pareado de Wilcoxon. Las barras de error muestran la media ± SD (n = 7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig04.jpg"> Figura 4: Enriquecimiento por citometría de flujo de CD14−OSCAR+ OCs. Los monocitos CD14+ se enriquecieron a partir de PBMC, y los AO se diferenciaron como se describió anteriormente. Los cultivos de AO adherentes se separaron con atasa y se tiñeron para citometría de flujo. (A-C) Los AO del día 8 se clasificaron según la expresión de CD14 y OSCAR. (A) Estrategia representativa de clasificación de compuertas. Las células se cerraron como singletes, negativas para tinción muerta, y se clasificaron los subconjuntos CD14+ OSCAR+ (rojo) y CD14− OSCAR+ (azul). (B) Gráficos representativos que muestran la tinción OSCAR superpuesta de OC derivados de RANKL (cian) y macrófagos derivados de M-CSF de control (naranja). En rojo está el control teñido con isotipo OSCAR de los OC derivados de RANKL. (C) Las poblaciones clasificadas se colocaron en plástico y se dejaron adherir durante 2 h en medio pro-OC (25 ng/mL M-CSF y 50 ng/mL RANKL), seguido de tinción y visualización de TRAP. Las imágenes representativas muestran una falta de células TRAP+ en el subconjunto CD14+ (rojo) y TRAP+ mono y multinucleadas pre-OCs y OCs en el subconjunto CD14− (azul). Barras de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64698/64698fig05.jpg"> Figura 5: Ensayos para evaluar la función de los AO maduros. Para evaluar la función de los AO maduros, las células CD14+ aisladas de PBMC se cultivaron con M-CSF (M) solo o combinado con RANKL (R) durante 7 días, los AO se enriquecieron mediante citometría de flujo y los AO se trataron con el inhibidor rotenona durante 24 h. (A) Los AO maduros se clasificaron mediante citometría de flujo (CD14−OSCAR+) y se cultivaron en una superficie de ensayo mineral en presencia o ausencia de rotenona durante 3 días, después de lo cual las células se blanquearon y se obtuvieron imágenes a 10x para revelar el área reabsorbida (pozos de reabsorción en blanco). (A) Imágenes representativas reconstruidas de pozos. Barras de escala: 1000 μm. (B) La cuantificación del porcentaje de área reabsorbida. Los datos en (B) se analizaron con un ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Dunn (n = 7); * P ≤ 0,05 y** P ≤ 0,01. Las barras de error muestran la media ± DE. (C) Contenido total de ATP intracelular de AO maduros indiferenciados y diferenciados para el día 7 diferenciados con RANKL y tratados con vehículo o rotenona (10 nM y 30 nM). Aquí, 2DG y oligomicina se utilizaron como controles positivos para el ensayo y se agregaron 30 minutos antes de la lisis celular y la cuantificación de ATP. Las barras de error muestran la media ± SD (n = 4). Los datos se analizaron con un ANOVA unidireccional y la prueba de comparación múltiple de Dunnett para datos pareados. ** P ≤ 0,01. (D) Una imagen representativa de 20x de OCs maduros teñidos para la formación de anillos de actina (rojo) y núcleos (azul), que muestra la pérdida del anillo de actina con el inhibidor. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/64698fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Formato de placa</td>
			<td>96 placa de pozo</td>
			<td>48 placa de pozo</td>
			<td>24 placa de pozo</td>
			<td>12 placa de pozo</td>
			<td>6 placas de pozo</td>
		</tr><tr><td>volumen</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>225–250 μL</td>
			<td>450–500 μL</td>
			<td>0.8–1 ml</td>
			<td>1.8–2 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Volumen de suspensión celular para diferentes formatos de placa. Los volúmenes se calculan a partir de una solución de 1 x 106 células/ml y proporcionan una densidad óptima para la fusión célula-célula.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Fluoróforo, clon</td>
			<td>Volumen (μL) por 106 células</td>
		</tr><tr><td>CD14</td>
			<td>PE/cianina7, HCD14</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>OSCAR</td>
			<td>FITC, REA494</td>
			<td>10 μL</td>
		</tr><tr><td>Búfer de clasificación de celdas</td>
			<td></td>
			<td>80 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Solución de mezcla maestra de anticuerpos. 
Figura complementaria 1: Tinción TRAP de la respuesta a dosis de RANKL. Los monocitos CD14+ se enriquecieron magnéticamente, se colocaron en 1 x 105 células/pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche con 25 ng/mL M-CSF, como en la Figura 2. Las imágenes representativas de la tinción con TRAP muestran monocitos cebados con MCSF estimulados con concentraciones crecientes de RANKL (1 ng / ml, 25 ng / ml, 50 ng / ml y 100 ng / ml), fijados y teñidos para TRAP el día 7. Barras de escala: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.%20Figure%201.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Tinción en anillo de actuación en AO totalmente diferenciados. (A) Un aumento de 10x de OC diferenciado en plástico TC y teñido con faloidina AF647 (en rojo). Barra de escala: 400 μm. (B) Un aumento de 40x de OCs diferenciados en portaobjetos de cámara de vidrio y teñidos con faloidina AF488 (en amarillo). Barra de escala: 100 μm.Los núcleos están teñidos con DAPI, que se muestra en azul en (A) y en cian en (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/Supl.Figure%202.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 3: Efecto de diferentes lotes de FBS en la eficiencia de diferenciación de OC. Los AO se diferenciaron de los monocitos CD14+ en presencia de 25 ng/mL M-CSF y 50 ng/mL RANKL (MR) durante 7 días. Los pocillos de control tenían M-CSF solamente (M). (A) aumentos representativos de 10x (barras de escala: 400 μm) y (B) cuantificación de AO teñidos con TRAP diferenciados de un donante en dos lotes diferentes de FBS. Las barras de error muestran la media ± SD de tres réplicas técnicas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64698/suppl.Figure%203.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Los osteoclastos son células clave de reabsorción ósea en el cuerpo. Este protocolo describe un método fiable para la diferenciación in vitro de osteoclastos a partir de monocitos de sangre periférica humana. Este método se puede utilizar como una herramienta importante para comprender mejor la biología de los osteoclastos en la homeostasis y en las enfermedades.

Diferenciación de osteoclastos funcionales de monocitos CD14+ de sangre periférica humana

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

0.Nuestro protocolo describe un método optimizado y reproducible para generar osteoclastos in vitro que se puede utilizar para investigar los mecanismos subyacentes a su proceso de diferenciación y funcionalidad. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de generar un alto número de osteoclastos funcionalmente activos en solo una semana. El alto rendimiento de diferenciación se logra mediante el uso de monocitos purificados y la adición de citoquinas a tiempo.Los osteoclastos son responsables de la destrucción ósea en todas las formas de artritis, y este método proporciona las herramientas para detectar nuevos compuestos terapéuticos que pueden modular su diferenciación y / o funciones. Demostrando el procedimiento estará Patricia Riedlova, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para comenzar, aísle las PBMC transfiriendo la sangre a un nuevo tubo de 50 mililitros.Dilúyalo con PBS estéril en un volumen igual para sangre fresca, o una proporción de 1:3 para conos leucocitarios y capas leucocitarias. Mezclar suavemente la sangre por inversión. Prepare tubos de 15 mililitros que contengan tres mililitros de medio de gradiente de densidad, y coloque lentamente de ocho a 10 mililitros de sangre diluida en la parte superior del medio de gradiente de densidad, evitando mezclar.Centrifugar el tubo a 400 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente sin freno. A continuación, deseche con cuidado la capa superior con una pipeta Pasteur. Recoja la capa de interfase inferior que contiene los PBMC y transfiera esta capa a un nuevo tubo de 50 mililitros.Suspender las celdas hasta 50 mililitros con PBS estéril y lavar el medio de gradiente de densidad residual centrifugando a 300 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente con el freno completo. Para eliminar las plaquetas residuales, repita el proceso de centrifugación como se describe en el manuscrito, resuspenda las PBMC aisladas y purificadas en 20 mililitros de PBS y cuéntelas con un hemacitómetro siguiendo el método estándar. Para enriquecer CD14+ monocitos, transfiera 1 x 10 a las séptitas PBMC a un tubo de fondo redondo de poliestireno adecuado y granule las células a 300 x g durante cinco minutos.Después de desechar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en el tampón de separación celular, incubar las células con 10 microlitros de cóctel de anticuerpos por 100 microlitros con la tapa puesta durante 10 minutos. Al final de la incubación, agregue 10 microlitros de las perlas de nanopartículas magnéticas por cada 100 microlitros e incube durante tres minutos con la tapa puesta. Recargue el volumen a 2,5 mililitros con el tampón de separación celular.Coloque el tubo en un imán e incube durante tres minutos con la tapa cerrada. Ahora, descarte la población de células negativas con un movimiento continuo por inversión mientras el tubo todavía está en el imán. Retire el tubo del imán, Lave los monocitos CD14+ enriquecidos unidos a las perlas magnéticas resuspendiéndolas en 2,5 mililitros del tampón de suspensión celular y vuelva a colocar el tubo en el imán.Cuente las celdas aisladas como se demostró anteriormente. Centrifugar las células recogidas a 300 x g durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, resuspender las células a 1 millón de células por mililitro en medio esencial alfa mínimo completo con 10% FBS.Para diferenciar el osteoclasto, agregue M-CSF a una concentración final de 25 nanogramos por mililitro a la suspensión celular y mezcle pipeteando a fondo para homogeneizar la suspensión celular. Placa de 100 microlitros de la suspensión por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos. A continuación, agregue 200 microlitros de agua destilada estéril por pocillo alrededor de las celdas plateadas para evitar la evaporación media y los efectos de borde en el sistema de cultivo.Incubar las células durante la noche durante aproximadamente 18 a 20 horas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Prepare medios frescos complementados con M-CSF y ligando RANK. Después de la incubación, retire cuidadosamente la mitad del medio por aspiración con una pipeta P200 y reemplácelo con un medio completo fresco y cálido suplementado con M-CSF y ligando RANK a una concentración final de 25 nanogramos por mililitro.Diferenciar las células en osteoclastos durante siete a 14 días con un reemplazo completo del medio cada tres días. Después de retirar el medio, fije los osteoclastos adherentes diferenciados con 100 microlitros por pocillo de la solución fijadora preparada e incube durante un minuto. No toque el fondo de los pocillos para evitar rayar las células adherentes.Una vez que los pozos se lavan tres veces con 300 microlitros de agua destilada estéril, seque las placas y agregue 100 microlitros de solución de tinción recién preparada a cada pozo. Incubar el plato a 37 grados centígrados en la oscuridad durante 20 minutos. Después de la incubación, retire la solución de tinción por inversión y lave la placa tres veces con 300 microlitros por pocillo de agua destilada.Retire el exceso de agua golpeando los platos con toallas de papel, y deje los platos abiertos y protegidos de la luz para secar al aire durante la noche. Usando un microscopio de campo claro con una opción de mosaico, tome imágenes a 10x o 20x para capturar toda la superficie del pozo. Cuente manualmente los osteoclastos identificados como células teñidas TRAP+púrpura con más de tres núcleos utilizando un software de análisis de imágenes con un complemento de contador de células.Placa de 100 microlitros de monocitos CD14+ aislados por pocillo en un portaobjetos de cámara de 18 pocillos con una densidad celular de 1 x 10 a la quinta célula por pocillo. Diferenciar los osteoclastos en presencia de ligando M-CSF y RANK como se demostró anteriormente con un cambio completo de medio cada tres días. En el punto final, retire suavemente el medio y lave cada pocillo dos veces con 200 microlitros de PBS precalentado a pH 7.4.No deje que los pozos se sequen entre los pasos. Fijar la muestra con 100 microlitros por pocillo de solución de formaldehído al 4% en PBS, e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital con agitación suave. Después de la incubación, lave las células dos veces con 200 microlitros por pocillo de PBS.Permeabilizar las células con 100 microlitros por pocillo de solución Triton x-100 al 0,1% diluida en PBS, e incubar durante 10 minutos como se mostró anteriormente. Lave dos veces con 200 microlitros por pocillo de PBS. Para bloquear la unión no específica y aumentar la señal, agregue 100 microlitros de solución de bloqueo hecha con albúmina sérica bovina al 2% y solución de PBS.Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital con una agitación suave. Después de retirar la solución de bloqueo, agregue 100 microlitros de solución de faloidina conjugada fluorescentemente diluida en solución BSA/PBS al 2% a cada pocillo. Lave dos veces con 200 microlitros por pocillo de PBS.Teñir los núcleos con 100 microlitros por pocillo de una solución de PBS que contenga 300 DAPI nanomolares. Después de 10 a 15 minutos, retire la solución DAPI y reemplácela con PBS de 100 microlitros por pozo. Visualice la tinción usando inmunofluorescencia apropiada o microscopios confocales de cuatro a 40x.Los osteoclastos maduros se definen como TRAP+múltiples células nucleadas. La adición del ligando RANK produjo un número creciente de grandes osteoclastos TRAP+multinucleados de una manera dependiente de la dosis. La cinética de la diferenciación de osteoclastos de monocitos se investigó durante un período de cultivo de dos a 14 días.Los osteoclastos multinucleados fueron visibles desde el quinto día en adelante, y la diferenciación óptima se alcanzó en el séptimo día. La diferenciación de osteoclastos sobre superficies mineralizadas permite evaluar su actividad de reabsorción mediante el análisis de la formación de agujeros redondos o pozos de reabsorción. El porcentaje de reabsorción aumenta significativamente en presencia de M-CSF y ligando RANK en comparación con M-CSF solo.Además, el tratamiento con rotenona dependiente de la dosis inhibió la reabsorción de la superficie mineralizada en comparación con el pozo de control no tratado. La inhibición dependiente de rotenona de la reabsorción de osteoclastos se asoció con la inhibición de la producción de ATP. La fragmentación del anillo de actina derivado del ligando RANK del OCS maduro se observó en presencia de rotenona.Es importante asegurarse de que los monocitos enriquecidos no contengan plaquetas, que las células estén chapadas en la densidad correcta y que los pozos circundantes estén llenos de agua para evitar el efecto borde. Este protocolo es particularmente útil para interrogar mecánicamente cómo se forman los osteoclastos y qué influye en su funcionalidad tanto en la ciencia básica como en la traslacional. Por ejemplo, mediante el uso de compuestos o proteínas que pueden modular estos procesos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Expansión, purificación y evaluación funcional de la sangre periférica humana células NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Investigación

Inmunología e Infección

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Expansion of Human Peripheral Blood  ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells using Zoledronate

Expansión de la sangre periférica humana de células T γδ con zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood

Imagen cuantitativa de linaje específico Toll-like receptor-mediada por la señalización en los monocitos y células dendríticas de pequeñas muestras de sangre humana

Individual variations in immune status determine responses to infection and contribute to disease severity and outcome.  Aging is associated with an ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

La detección de glucógeno en las células mononucleares de sangre periférica con ácido periódico de Schiff tinción

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generación de células T humanas aloantígeno-específicos de la sangre periférica

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

The hallmark of humoral immunity is to generate functional ASCs, which synthesize and secrete Abs specific to an antigen (Ag), such as a pathogen, and are ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Dextrano mejora la eficiencia de transducción lentivirales de las células NK primaria murinas y humanas

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Assessment of the Synaptic Interface of Primary Human T Cells from Peripheral Blood and Lymphoid Tissue

Evaluación de la interfaz sináptica primaria humana de células de T de sangre periférica y tejido linfoide

The current understanding of the dynamics and structural features of T-cell synaptic interfaces has been largely determined through the use of ...

Isolation, Transfection, and Culture of Primary Human Monocytes

Aislamiento, transfección y cultivo de monocitos humanos primarios

Human immunodeficiency virus (HIV) remains a major health concern despite the introduction of combined antiretroviral therapy (cART) in the mid-1990s. ...